CN105494108A - 一种速生白榆的组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种速生白榆的组培快繁方法，由无菌外植体的获得，丛生芽诱导，组培苗复壮，生根培养和炼苗步骤组成。步骤中没有初代培养，得到无菌苗直接进行快繁，快繁后经壮苗再进行生根，提高了组培苗生根质量和炼苗成活率，经检索在目前公开的能找到的快繁方法的文献中，本发明的快繁出苗率是最高的，即速生白榆扩繁系数可达到4.5，生根率达到96.3%，炼苗成活率95%。利用改良培养基即在DKW培养基基础上添加不同浓度的和不同种类的激素提高繁殖效率，解决了速生白榆快繁难题，较常规步骤扩繁系数高、出苗质量好，为速生工厂化育苗或规模化生产及推广奠定了良好基础。

Description

一种速生白榆的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种速生白榆的组培快繁方法。
背景技术
白榆(Ulmuspumila)为榆科榆属植物，根系发达，适应性强，耐寒耐旱，耐中度盐碱，可作滨海盐碱地造林和绿化树种，速生白榆在实际应用中优势明显，但传统的扦插无性繁殖法成活率低、扩繁周期长，致使其扩繁和推广受到影响。
目前国内针对白榆的研究主要以资源保存、杂交育种、实生苗选育、非常规育种为主，将细胞和组织培养用于白榆遗传改良的较少，目前公开的白榆组织培养中，外植体以茎段诱导效果较好，叶片分化效果不佳，培养基以MS最常用，激素以6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）为主，辅以吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、噻苯隆（TDZ）等，王静华等（2009）以白榆茎段和叶片为外植体进行白榆再生研究，茎段再生效果较好，最适增值培养基为MS+6-BA0.10mg/L+IBA0.005mg/L，增值系数为243%，平均茎高2.65cm。最适生根培养基为：MS+IBA0.01mg/L，生根率100%，生根系数8.94，但主根较少。现有专利中，辛全伟等（2012）公布了一种耐盐白榆的继代和生根配方；慕德宇等（2014）公布了一种耐盐速生白榆继代培养基EM及激素配比；林大为等（2014）公布了一种白榆组培苗复壮的方法，以上研究集中在基本培养基研发、继代、壮苗、生根等一个或两个环节且缺少炼苗过程，鲜有完整白榆再生体系，无法很好的指导生产。
发明内容
为了解决以上现有技术中白榆组织培养方法不系统、无法很好的指导生产的问题，本发明提供了一种完整的速生白榆的组培快繁方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明所述速生白榆的组培快繁方法，由无菌外植体的获得，丛生芽诱导，组培苗复壮，生根培养和炼苗步骤组成。
其中：所述无菌外植体获得：5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽为外植体，用饱和洗洁净水浸泡5~10min，后用毛笔轻刷表面，再用流水冲洗30~60min；移至超净工作台，用70~75%酒精消毒20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用1%次氯酸钠溶液消毒8~10min，后用无菌水冲洗5~8次，每次不少于3min，最后再置于少量无菌水中，防止接种时间过长造成外植体缺水失活。接种时，用无菌滤纸吸去外植体表面多余水分，获得无菌外植体。
其中：所述丛生芽诱导的方法是：将灭菌后的外植体剪成1cm左右带腋芽小段接种于快繁培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，获得丛生芽；其中所述快繁培养基的组成为：DKW+TDZ0.075~0.2mg/L+6-BA0.025~0.075mg/L+IBA0.025~0.075mg/L+NAA0~0.1mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L，pH值为5.8~6.0；其中DKW培养基组分为：硝酸铵1416.0mg/L，硼酸4.8mg/L，无水氯化钙112.5mg/L，硝酸钙1367.0mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钠45.4mg/L，七水硫酸铁33.8mg/L，硫酸镁361.49mg/L，一水硫酸锰33.5mg/L，钼酸钠0.39mg/L，六水硫酸镍0.005mg/L，磷酸二氢钾265.0mg/L，硫酸钾1559.0mg/L，六水硝酸锌17.0mg/L，盐酸硫胺素5.22mg/L。
其中：优选快繁培养基为：DKW+TDZ0.1-0.2mg/L+6-BA0.025-0.05mg/L+IBA0.025-0.075mg/L+NAA0-0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L。
所述最适宜的快繁培养基为：DKW+TDZ0.2mg/L+6-BA0.05mg/L+IBA0.025mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L。
其中：所述组培苗复壮的方法是：在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株，切去基部愈伤组织，接种到复壮培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到茎秆粗壮，叶片开展，叶色浓绿的健壮组培苗；复壮培养基为：MS培养基+TDZ0.025mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+AC0.5/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0；其中MS培养基组分为：硝酸铵1650.0mg/L，硝酸钾1900.0mg/L，二水合氯化钙440.0mg/L，七水硫酸镁370.0mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，碘化钾0.83mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，硼酸6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，肌醇100.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
其中：所述生根培养的方法是：在无菌环境下将复壮后的组培苗剪去基部愈伤组织，接种到生根培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到生根组培苗；生根培养基组成为DKW或1/2DKW或1/2MS培养基+IBA0.01~0.05mg/L+NAA0~0.05mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
其中1/2DKW培养基组分为：硝酸铵708.0mg/L，硼酸4.8mg/L，无水氯化钙56.25mg/L，硝酸钙683.5mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钠45.4mg/L，七水硫酸铁33.8mg/L，硫酸镁361.49mg/L，一水硫酸锰33.5mg/L，钼酸钠0.39mg/L，六水硫酸镍0.005mg/L，磷酸二氢钾132.5mg/L，硫酸钾779.5mg/L，六水硝酸锌17.0mg/L，盐酸硫胺素5.22mg/L。
其中1/2MS培养基组分为：硝酸铵825.0mg/L，硝酸钾950.0mg/L，二水合氯化钙220.0mg/L，七水硫酸镁185.0mg/L，磷酸二氢钾85.0mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，碘化钾0.83mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，硼酸6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，肌醇100.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
其中：优选DKW或1/2MS培养基+IBA0.01-0.05mg/L+NAA0-0.05mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
最适宜的生根培养基为：1/2MS培养基+IBA0.05mg/L+NAA0.025mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
其中：所述炼苗的方法是：将获得的生根组培苗移至遮阴温室，遮阴法控制自然光500-1000lx，室内温度20~25℃，湿度40%以上，闭瓶炼苗2-3天，开瓶盖炼苗2-3天，取出小苗，洗净培养基后，移栽至蛭石:草炭=1:1的基质中，在温室内继续炼苗30-40天，待根系发育正常，苗株生长健壮后移栽至大田。
本发明的有益效果：
1）本发明公开的速生白榆组培快繁方法是将外植体直接接种到快繁培养基上获得丛生芽，并将丛生芽分成单株后接种到复壮培养基上进行复壮，再将复壮组培苗接种到生根培养基上。步骤中没有初代培养，得到无菌苗直接进行快繁，快繁后经壮苗再进行生根，提高了组培苗生根质量和炼苗成活率，经检索在目前公开的能找到的快繁方法的文献中，本发明的快繁出苗率是最高的，即速生白榆扩繁系数可达到4.5，生根率达到96.3%，炼苗成活率95%。
2）本发明建立了针对速生白榆的组培快繁体系，利用改良培养基即在DKW培养基基础上添加不同浓度的和不同种类的激素提高繁殖效率，解决了速生白榆快繁难题，并且本发明方法较常规步骤扩繁系数高、出苗质量好，为速生工厂化育苗或规模化生产及推广奠定了良好基础。
附图说明
图1：本发明所述速生白榆组培及炼苗情况
其中：a：芽增殖b：组培苗复壮c：生根情况d：炼苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例
5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽为外植体，用饱和洗洁净水浸泡5~10min，后用毛笔轻刷表面，再用流水冲洗30~60min；移至超净工作台，用70~75%酒精消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用1%次氯酸钠溶液消毒8min，后用无菌水冲洗5~8次，每次不少于3min，最后再置于少量无菌水中，防止接种时间过长造成外植体缺水失活。接种时，用无菌滤纸吸去外植体表面多余水分，接种到含不同激素配比的快繁培养基上（见表1）。在25（±2）℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养。1周后芽开始分化，30-40天丛生芽生长稳定。
表1.不同快繁培养基激素配比及白榆生长情况
其中，所述最适宜的快繁培养基为：DKW+TDZ0.2mg/L+6-BA0.05mg/L+IBA0.025mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L。出芽率为93.3%，扩繁系数为4.5，平均苗高为6.768cm
在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株，切去基部愈伤组织，接种到复壮培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到茎秆粗壮，叶片开展，叶色浓绿的健壮组培苗；复壮培养基为：MS培养基+TDZ0.025mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+AC0.5/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
在无菌环境下将复壮后的组培苗剪去基部愈伤组织，接种到含不同激素配比的不同生根培养基上（见表2），在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到生根组培苗。
表2.不同生根培养基激素配比及白榆生根情况
其中：所述最适宜的生根培养基为：1/2MS培养基+IBA0.05mg/L+NAA0.025mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。生根率可达96.3%，平均生根条数5.154条，平均根长5.642cm。
将生根组培苗移至遮阴温室，遮阴法控制室内光照不高于1000lx，控制温度20~25℃，湿度40%以上，闭瓶炼苗2-3天，开瓶盖炼苗2天，开瓶后瓶内湿度不低于60%，如培养基过干可用喷雾方式补水。开瓶炼苗结束后，用勺子取出组培苗和培养基，洗净培养基，移栽至蛭石：草炭=1:1的基质中，在温室内继续炼苗30~40天。基质和育苗容器预先用0.125%高锰酸钾浇透后静置2天，移栽前再用清水浇透尽量去除基质中高锰酸钾，炼苗期间温室内湿度保持在40%~80%，温度15-30℃。待根系发育正常，苗株生长健壮后移栽至大田，成活率95%。
上述DKW培养基组分为：硝酸铵1416.0mg/L，硼酸4.8mg/L，无水氯化钙112.5mg/L，硝酸钙1367.0mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钠45.4mg/L，七水硫酸铁33.8mg/L，硫酸镁361.49mg/L，一水硫酸锰33.5mg/L，钼酸钠0.39mg/L，六水硫酸镍0.005mg/L，磷酸二氢钾265.0mg/L，硫酸钾1559.0mg/L，六水硝酸锌17.0mg/L，盐酸硫胺素5.22mg/L；1/2DKW为大量元素减半。
上述MS培养基组分为：硝酸铵1650.0mg/L，硝酸钾1900.0mg/L，二水合氯化钙440.0mg/L，七水硫酸镁370.0mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，碘化钾0.83mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，硼酸6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，肌醇100.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L；1/2MS为大量元素减半。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种速生白榆的组培快繁方法，其特征在于包括无菌外植体的获得，丛生芽诱导，组培苗复壮，生根培养和炼苗步骤；
其中所述丛生芽诱导中使用的快繁培养基组成为：DKW培养基+TDZ0.075~0.2mg/L+6-BA0.025~0.075mg/L+IBA0.025~0.075mg/L+NAA0~0.1mg/L+蔗糖20~30g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L，pH值为5.8~6.0。
2.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于无菌外植体的获得包括以下步骤：
5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽为外植体，用饱和洗洁净水浸泡5~10min，后用毛笔轻刷表面，再用流水冲洗30~60min；移至超净工作台，用70~75%酒精消毒20~30s，无菌水冲洗2~3次，再用1%次氯酸钠溶液消毒8~10min，后用无菌水冲洗5~8次，每次不少于3min，最后再置于无菌水中，防止接种时间过长造成外植体缺水失活，接种时，用无菌滤纸吸去外植体表面多余水分，获得无菌外植体。
3.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于所述丛生芽诱导的方法是：
将无菌外植体剪成1±0.1cm带腋芽小段接种于快繁培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，获得丛生芽，其中DKW培养基中含有硝酸铵1416.0mg/L，硼酸4.8mg/L，无水氯化钙112.5mg/L，硝酸钙1367.0mg/L，五水硫酸铜0.25mg/L，乙二胺四乙酸二钠45.4mg/L，七水硫酸铁33.8mg/L，硫酸镁361.49mg/L，一水硫酸锰33.5mg/L，钼酸钠0.39mg/L，六水硫酸镍0.005mg/L，磷酸二氢钾265.0mg/L，硫酸钾1559.0mg/L，六水硝酸锌17.0mg/L，盐酸硫胺素5.22mg/L。
4.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于快繁培养基组成为：DKW+TDZ0.2mg/L+6-BA0.05mg/L+IBA0.025mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L+AC0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于组培苗复壮的方法是：在无菌条件下将获得的丛生芽分成单株，切去基部愈伤组织，接种到复壮培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到茎秆粗壮，叶片开展，叶色浓绿的健壮组培苗。
6.根据权利要求5所述的组培快繁方法，其特征在于复壮培养基为：MS培养基+TDZ0.025mg/L+6-BA0.1mg/L+IBA0.05mg/L+AC0.5/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
7.根据权利要求1或6所述的组培快繁方法，其特征在于其中MS培养基中含有硝酸铵1650.0mg/L，硝酸钾1900.0mg/L，二水合氯化钙440.0mg/L，七水硫酸镁370.0mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸铁27.8mg/L，碘化钾0.83mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，硼酸6.2mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，肌醇100.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
8.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于所述生根培养的方法是：在无菌环境下将复壮后的组培苗剪去基部愈伤组织，接种到生根培养基上，在25±2℃，光照14~16h，光强3000lx条件下培养20~30天，得到生根组培苗；生根培养基组成为DKW或1/2DKW或1/2MS培养基+IBA0.01~0.05mg/L+NAA0~0.05mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
9.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于生根培养基组成为1/2MS培养基+IBA0.05mg/L+NAA0.025mg/L+AC0.5g/L+蔗糖12.5g/L+琼脂6.5g/L，pH值为5.8~6.0。
10.根据权利要求1所述的组培快繁方法，其特征在于所述炼苗的方法是：将获得的生根组培苗移至遮阴温室，遮阴法控制自然光500-1000lx，室内温度20~25℃，湿度40%以上，闭瓶炼苗2-3天，开瓶盖炼苗2-3天，取出小苗，洗净培养基后，移栽至蛭石:草炭=1:1的基质中，在温室内继续炼苗30-40天，待根系发育正常，苗株生长健壮后移栽至大田。
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