CN101836589A - 一种南抗杨的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种南抗杨的快速繁殖方法，包括(1)选择南抗杨当年生叶片作为外植体并灭菌；(2)丛生芽的诱导；(3)成苗的培养；(4)炼苗和移栽等步骤，其特征在于：对诱导的丛生芽进行增殖培养，即将丛生诱导的材料培养在下列培养基中：MS、6-BA 1.0～1.5mg/L、NAA0.2～0.5mg/L、KT 0.1～0.3mg/L、琼脂6～8g/L、蔗糖20～30g/L、pH为5.6～6.2；培养条件为温度23～26℃、光照2000～3000Lx；培养时间为30～40天，光照时间为10～12小时/天。本方法增加了丛生芽增殖，可以大大提高快繁的效率，同时也保证了较高的成活率，使得该技术满足大规模推广和工厂化生产的要求。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种植物无性繁殖的方法，特别涉及杨树离体快速繁殖的方法，具体地说是一种南抗杨的快速繁殖方法。
二、背景技术
杨树是世界各国普遍种植的木本植物，属于杨柳科(Salicacea)杨属(Populus L)，具有适应性强、生长速度快、丰产等特性，已被广泛作为短期轮作的造林树种，在生态环境治理和解决木材短缺方面占有重要地位。
南抗杨(Populus delteides cl.Nankang)为美洲黑杨杂种，是沙滩荒地、固沙护堤的主要选择对象，特别适合严重沙化地的林化改造，它能分泌一种可以杀死“天牛”幼虫的毒汁，将其杀死。南抗杨是国家林业局推荐的林木良种，是目前在江淮平原及长江中下游平原重点推广的优良无性系品种。
1838年，Schwann和Schleiden提出了细胞全能性理论，为植物细胞和组织培养奠定了理论基础。杨树作为一种速生树种，它的经济价值和重要性尤为突出。因此，杨树成为了最早采用组织培养方法进行大量繁殖的林木树种之一。杨树离体快速繁殖始于1977年。Whitehead和Giles用三个杨树品种，进行了用腋芽做外植体的考察无性繁殖潜力的试验。结果发现，6～8周以后，每个原始的芽外植体可以形成120～220个小苗，因此估计每个芽每年可生产一百万个以上的小植株，这为杨树无性繁殖的商业化打下了基础。2006年沈周高《3个杨树品种叶片再生体系的建立》的论文中，详细论述了南抗杨再生体系：叶片消毒方法的筛选、愈伤组织诱导、诱导分化、不同组合的生长素对根生长的影响。在对叶片消毒中，他选用的是0.1％HgCl2溶液、消毒4min，叶片的污染率为20％，出愈率为76％；在愈伤诱导中最佳的培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L，出愈率为98.3％；在诱导分化中最佳培养基为MS+KT0.2mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+蔗糖40g/L+琼脂8g/L，分化数为16.33，分化率为81.67％；在生根培养中最佳方案为1/2MS+IBA0.50mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7g/L，生根数为5.80，生根率为100％。
关于植物的离体快速繁殖，该项技术是目前植物组织培养中应用最广泛、最有效的技术，尤其对于新引进品种、脱毒苗、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可实现离体快速增殖，且不受地区、气候影响，繁殖速度比常规生产快数百万倍，能迅速提供大量优质种苗。
三、发明内容
本发明针对现有南抗杨组织培养方法的不足，旨在对其进行改进，提供一种能够适合南抗杨组织培养技术进行快速繁殖的方法。所要解决的技术问题是对诱导的丛生芽进行增殖培养，以提高繁殖效率。
本发明的技术方案以现有南抗杨组织培养技术为基础，包括：(1)外植体的选择与灭菌；(2)丛生芽的诱导；(3)成苗的培养；(4)炼苗和移栽。与现有技术的区别是对诱导的丛生芽进行增殖培养以倍增丛生芽的数量，具体地说就是将已经通过丛生诱导的材料培养在下列培养基中：MS+6-BA 1.0～1.5mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+KT 0.1～0.3mg/L+琼脂6～8g/L+蔗糖20～30g/L，pH为5.6～6.2；培养条件为温度23～26℃、光照2000～3000Lx；培养时间为30～40天，光照时间为10～12小时/天。
本方法完整的操作过程如下：
(1)外植体的选择与灭菌——选用南抗杨当年新生的叶片作为外植体，先将叶片用洗衣粉浸泡、清洗，之后在流水下冲洗2个小时以上，再用75％的无水乙醇杀菌8～12秒，用0.1％的升汞杀菌4～10分钟，用无菌水冲洗8～10次，最后用灭过菌的滤纸(或纱布)擦干叶片。将叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，尽量使每个小块里都含有叶脉，备用。
(2)丛生芽的诱导——采用培养基的配方为：MS、6-BA 1.0～2.0mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、KT 0.1～0.3mg/L、琼脂6～8g/L、蔗糖20～30g/L，pH为5.6～6.2；培养条件为：温度21±1℃、光照1500～2000Lx；光照时间为12～14小时/天，培养时间为40～50天。
(3)丛生芽增殖培养——采用培养基配方为：MS、6-BA 1.0～1.5mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、KT 0.1～0.3mg/L、琼脂6～8g/L、蔗糖20～30g/L，pH为5.6～6.2；培养条件为：温度23～26℃、光照2000～3000Lx、培养时间30～40天、光照时间10～12小时/天
(4)成苗的培养——采用培养基的配方为：1/2MS、IBA0.2～0.5mg/L、NAA0～0.1mg/L、琼脂6～8g/L、蔗糖15～25g/L；培养条件为：温度24±1℃、光照1500～2000Lx；光照时间为8～10小时/天，培养时间为45～60天。
(5)炼苗与移栽——待快繁苗生根并长高至4～6cm左右后，打开组培瓶，轻轻地用灭菌后的镊子捣碎培养基，并注入灭菌后的双蒸水，水位高度超过培养基表面1～2cm左右，在组培室炼苗5～7天；之后将组培苗取出，用水轻轻清洗根部的培养基，移栽至基质(选用泥炭上或腐殖上与直径为0.3～0.5mm的细砂按3∶1体积比配制，用3％硫酸亚铁进行土壤消毒)中，遮光喷雾保湿3～5天，再经过漫射光照射培养一周后，逐渐转入直射光环境中培养或移栽至大田中。
在本方法中，采用营养体作为材料，保证了遗传的稳定性。增加了丛生芽增殖，可以大大提高快繁的效率，而炼苗方法的改进，不仅保证了较高的成活率，也使得该技术满足了大规模推广和工厂化生产的要求。
本发明方法具有如下优点或效果：
1、本方法克服了传统繁殖方法如：繁殖速度慢，难以满足大规模生产需求的不足，将南抗杨的种苗繁殖工厂化，对于解决每年上亿株苗的供应和数百万亩地的南抗杨造林需求，特别是对我国生态环境治理、解决木材短缺问题具有极大的现实意义。
2、本方法中的种苗营养充足、长势旺盛。
3、本方法具有成本低、产量大、遗传稳定等特点。
四、附图说明
图1、图2为南抗杨诱导的丛生芽照片。
图3、图4为南抗杨增殖培养后的丛生芽照片。
图5、图6为南抗杨生根苗照片。
图7为南抗杨根须照片。
图8为南抗杨快繁苗移栽成活照片。
五、具体实施方式
(1)外植体的选择与灭菌：一般选在4、5月份的晴天，在天气晴朗的上午10点钟以后采摘南抗杨当年新生的叶片，先用毛刷蘸洗衣粉溶液将叶片表面的污垢洗净，然后在流水下冲洗至少2个小时，之后放入大烧杯中，带入接种室，于超净工作台上；再用75％的乙醇浸泡8秒，无菌水冲洗2次，再用0.1％的升汞溶液浸泡4分钟，用无菌水冲洗8次，最后用灭菌滤纸或纱布吸干叶片表面水分。将叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，尽量使每一小块都带有叶脉，备用。
(2)丛生芽的诱导：接种到以MS为基本培养基，蔗糖25g/L，琼脂8g/L，附加6-BA 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L，KT 0.1mg/L，pH 5.6，在(21±1)℃、光照1500～2000Lx、13h/d下培养6周，中间剔除污染的外植体。MS培养基配方：每升培养基中含NH4NO3(1650mg/L)，KNO3(1900mg/L)，CaCl2·2H2O(440mg/L)，KH2PO4(170mg/L)，MgSO4·7H2O(370mg/L)，MnSO4·4H2O(22.3mg/L)，ZnSO4·4H2O(8.6mg/L)，H3BO3(6.2mg/L)，KI(0.83mg/L)，Na2MoO4·2H2O(0.25mg/L)，CuSO4·5H2O(0.025mg/L)，CoCl2·6H2O(0.025mg/L)，Na2EDTA(37.25mg/L)，FeSO4·7H2O(27.85mg/L)，甘氨酸(2.0mg/L)，盐酸硫胺素B1(0.4mg/L)，烟酸B3(0.5mg/L)，盐酸吡哆醇B6(0.5mg/L)，肌醇(100mg/L)。7周后每片外植体即可获得平均为12.3个的不定芽。
(3)丛生芽的增值培养
采用的培养基为：MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.3mg/L+KT 0.1mg/L+琼脂8g/L+蔗糖25g/L，pH 5.8；培养条件为温度24℃、光照2000-3000Lx；培养时间为30-40天，光照时间为10-12小时/天。使丛生芽的数量增加15.4倍，繁殖效率明显提高。
(4)成苗的培养：从中选取生长健壮，叶片展开，长度2cm左右的嫩茎，切去茎段基部愈伤组织，转入以1/2MS为基本培养基，附加生长素IBA 0.5mg/L、NAA 0.01mg/L、琼脂7g/L、蔗糖15g/L、pH 5.8的培养基中诱导生根，培养时间约为45天，平均苗高为5.2cm，根长2.19cm。
(5)炼苗与移栽：待快繁苗生根并长高至4～6cm左右后，打开组培瓶，轻轻地用灭菌后的镊子捣碎培养基，并注入灭菌后的双蒸水，使水位高度超过培养基表面1cm左右，在组培室炼苗5～7天；之后将组培苗取出，用水轻轻清洗根部的培养基，移栽至基质(选用泥炭上或腐殖上与直径为0.3～0.5mm的细砂按3∶1体积比配制，用3％硫酸亚铁进行土壤消毒)中，遮光喷雾保湿3～5天，再经过漫射光照射培养一周后，逐渐转入直射光环境中培养或移栽至大田。
综合以上各步，本发明的方法，不仅在取材方便性，丛生芽的诱导率，增殖倍数和瓶苗的质量等方面高于其他各组，而且为大规模工厂化生产，提供了可行的炼苗和移栽的方法。
Claims (2)
1.一种南抗杨的快速繁殖方法，包括(1)选择南抗杨当年生叶片作为外植体并灭菌；(2)丛生芽的诱导；(3)成苗的培养；(4)炼苗和移栽等步骤，其特征在于：对诱导的丛生芽进行增殖培养，即将丛生诱导的材料培养在下列培养基中：MS、6-BA 1.0～1.5mg/L、NAA0.2～0.5mg/L、KT 0.1～0.3mg/L、琼脂6～8g/L、蔗糖20～30g/L、pH为5.6～6.2；培养条件为温度23～26℃、光照2000～3000Lx；培养时间为30～40天，光照时间为10～12小时/天。
2.根据权利要求1所述的繁殖方法，其特征在于：所述的增殖培养培养基为：MS、6-BA1.2mg/L、NAA 0.3mg/L、KT 0.1mg/L、琼脂8g/L、蔗糖25g/L、pH 5.8。
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