CN100556283C

CN100556283C - 香果树的一种体外培养方法

Info

Publication number: CN100556283C
Application number: CNB2007100652927A
Authority: CN
Inventors: 陈发菊; 梁宏伟; 王玉兵; 熊丹; 姚伟; 何正权; 乐超银; 梁薇
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2007-04-10
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2027-04-10
Also published as: CN101027974A

Abstract

本发明公开了香果树的一种体外培养方法。该培养方法包括以下步骤：1)胚性愈伤组织的诱导：以经灭菌的种子为外植体，将其置于胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和2，4-D；2)体细胞胚的分化：将胚性愈伤组织置于分化培养基上诱导分化；所述分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸；3)生根和植株再生：将分化出的子叶胚置于生根培养基上诱导生根，得到香果树再生植株；所述生根培养基为1/4-3/4MS培养基。本发明为扩大香果树的繁殖系数、该物种的种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础，应用前景广阔。

Description

香果树的一种体外培养方法

技术领域

本发明涉及植物的体外培养方法，特别是涉及珍稀植物香果树的一种体外培养方法。

背景技术

香果树(Emmenopterys henryi Oliv)为茜草科(Rubiaceae)香果树属(Emmenopterys Oliv)的高大乔木，第四纪冰川幸存的古老孑遗植树种，为中国特有的单种属植物，是研究茜草科系统发育、形态演化及中国植物地理区系的重要材料。香果树材质洁白细密，纹理通直，生长迅速，树皮纤维是制蜡纸和人造棉的原料，是一种优良用材和绿化造林树种；此外，香果树树姿优美，花色艳丽，花期长，也是很好的园林绿化和庭院观赏植物。该植物不仅在植物的系统演化研究方面具有重要的科学价值，而且具有较高的经济价值。但是，该物种多零星分散，种群数量不多，现已被列为国家二级重点保护植物和林业部公布的国家珍贵树种。

高等植物的卵细胞受精后发育成的胚称为合子胚，由高等植物的体细胞在一定条件下诱导形成的胚或胚状体(embryoid)称为体细胞胚(somatic embryo)或不定胚(adventitious embryo)。离体的植物细胞或组织在适当的诱导条件下，通过与合子胚发生相似的途径形成胚状体从而发育成完整植株的过程称为植物体细胞胚发生(somatic embryogenesis)，它是植物离体培养形态发生的一条有效途径。体细胞胚发生与另外一种植物再生方式，即器官分化相比，具有数量多、速度快、结构完整和再生率高等优点(Shinoyama H，Nomura Y，Tsuchiya T，et al.A simple andefficient method for somatic embryogenesis and plant regeneration from leavesof chrysanthemum(Dendranthema×grandiflorum)[J].Plant Biotechnology.2004，21(1)：25-33.；Mandal A K A，Datta S K.Direct somatic embryogenesis and plantregeneration from ray florets of chrysanthemum[J ].Biologia Plantarum，2005，49(1)：29-33.)；同时，由于植物体细胞胚的产生多起源于单细胞，因此还能在突变体育种和基因重组育种中克服嵌合体现象。目前，植物体细胞胚发生的研究已在多领域得到广泛应用于，如用于物种的种质保存、作为稳定高效的植物再生体系和理想的遗传转化受体体系(Suzuki S，Supaibulwatana K，Mii M，Nakano M.Productionof transgenic plants of the Liliaceous ornamental plant Agapanthus praecoxssp.orientalis(Leighton)via Agrobacterium-mediated transformation ofembryogenic call i[J].Plant Sci.2001，161：89-97.；Tanaka Y，KatsumotoY，Brugliera F，et al.Genetic engineering in floriculture[J].Plant Cell，Tiss and Org Cult，2005，80：1-24.；Kim C K，Chung J D，Park S H，BurrellA M，Kamo K K，Byrne D H.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationof Rosa hybrida using the green fluorescent protein(GFP)[J]Plant Cell，Tiss and Org Cult，2004，78：107-111.)。

香果树雌雄同株，结实较少，具有明显的间歇周期性开花结果现象，一般2-4年开花结果一次，且坐果率很低，加上自然条件下种子萌发力极低，天然更新能力差，现存数量有限，资源稀少；此外，其种子特小，千粒重仅为0.3-0.51g，并且种子有休眠特性，成苗率极低，再加上森林破坏，乱砍滥伐现象严重，现分布范围越来越小，目前该树种已濒临灭绝(傅立国，金鉴明.中国植物红皮书稀有濒危植物(第一册)〔M〕.北京：科学出版社.1992，PP.568-569.)。

利用组织培养技术通过体细胞胚胎发生途径获得大量遗传稳定的再生个体对扩大该物种的繁殖系数不失为一种有效方法。在香果树的繁殖技术方面，目前研究人员已通过组织培养技术，以香果树幼叶或芽为外植体诱导出了再生植株(谈峰，刘玉成，王晓龙.香果树的快速繁殖[J].西南师范大学学报，1992，17(2)：260-263.韦小丽，朱忠荣，廖明，金天喜.贵阳香果树组织培养技术研究[J].种子，2005，24(10)：27-29.；周彦兵，谈峰.植物生长调节剂和蔗糖对抗黑胫病香果树丛芽分化的影响[J].西南师范大学学报，2005，20(6)：680-685.；)进行了香果树的扦插研究。但是，通过体细胞胚发生途径大量繁殖香果树的研究还很少，仅有姬飞腾等利用香果树叶子为外植体诱导出体细胞胚胎(姬飞腾，李凤兰，高述民，陈发菊.香果树体细胞胚胎发生[J].植物生理学通讯，2005，41，619-621.)，但仍旧存在繁殖系数低的问题。基于上述问题，迫切需要通过外植体、植物生长调节剂、基本培养基和培养条件的筛选，建立稳定高频率发生的香果树植株再生体系，从而为香果树的生物技术育种、种质资源保存、快速繁殖、遗传转化、人为控制香果树的生长发育研究提供良好的实验体系。

发明内容

本发明的目的是提供香果树的培育周期较短、产率较高的一种体外培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：香果树的体外培养方法，包括以下步骤：

1)胚性愈伤组织的诱导：以经灭菌的种子为外植体，将其置于胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)和2，4-D；

2)体细胞胚的分化：将胚性愈伤组织置于分化培养基上诱导分化；所述分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸(NAA)；

3)生根和植株再生：将分化出的子叶胚置于生根培养基上诱导生根，得到香果树再生植株；所述生根培养基为1/4-3/4MS培养基。

在上述香果树的体外培养方法中，为获得更高的诱导效率，步骤1)中的种子优选为未成熟的种子；对种子进行灭菌的方法可为(两步灭菌法)：先将香果树未成熟果实在浓度为每100mL含4-8滴洗洁净的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水冲洗1-3h，然后将其置于超净工作台上在75％酒精中浸泡30-90s，随后用每100mL含2-4滴土温-40的0.1％HgCl₂溶液消毒10-20min，用无菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于无菌水中，在4℃下浸泡12-24h，然后切开果皮，挑出种子，再次用0.1％HgCl₂溶液消毒3-8min，最后用无菌水清洗4-6次，每次1-3min。所述洗洁净为市售的普通无磷洗洁净即可，如纳爱斯集团有限公司生产的雕牌洗洁净或西安开米股份有限公司生产的开米牌洗洁净等。

在上述步骤中所用到的培养基添加剂的浓度为：胚性愈伤组织诱导培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1-2.0mg/L，优选为2.0mg/L，2，4-D的浓度为0-2.0mg/L，优选为0mg/L；所述分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1-2.0mg/L，优选为0.5mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1-2.0mg/L，优选为0.5mg/L；所述生根培养基包含的大量和微量元素为MS基本培养基全量的1/4-3/4，优选的生根培养基为1/2MS培养基。

所述步骤1)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux；步骤2)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux；步骤3)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux。

所述步骤1)中胚性愈伤组织的诱导时间可为10-17天，优选为15天；步骤2)中的诱导分化时间可为60-90天，优选为75天；步骤3)中约培养20天后开始生根。

为提高再生植株移栽后的成活率，可对步骤3)中经生根培养后得到的再生苗进行炼苗，方法可为：待再生苗长出3-5片真叶时，打开瓶盖，使再生植株与空气接触，在20-25℃下保温5-10天后即可移栽。

本发明提供了珍稀植物香果树的一种体外培养方法。该方法是种子(特别是未成熟种子)作为外植体，通过胚性愈伤组织诱导途径得到再生植株。以种子为外植体进行离体再生的优势在于取材方便、可提供的材料充足。用该方法可高频率地诱导出大量的香果树体细胞胚胎，再生植株成活率高，可达98％，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点。本发明为扩大香果树的繁殖系数、该物种的种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为经诱导产生的多细胞原胚

图2为处于球形和鱼雷时期的体胚

图3为含有处于不同发育时期体胚

图4为含有处于不同发育时期体胚的胚状体丛

图5为香果树的再生植株

图6为香果树的再生植株

图7为经炼苗的香果树的再生植株

图8为移栽后的香果树再生植株

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、香果树的体外培养

MS基本培养基：可参照文献(Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapidgrouth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol.Plant，1962，15：473-497)配制。

本发明的香果树的体外培养方法，包括以下步骤：

1)种子的灭菌(两步灭菌法)

先将香果树幼果在浓度为每100mL含4-8滴洗洁净(纳爱斯集团有限公司生产的雕牌洗洁净)的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水冲洗1-3h，然后将其置于超净工作台上在75％酒精中浸泡30-90s，随后用每100mL含2-4滴土温-40的0.1％HgCl₂溶液消毒10-20min，用无菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于无菌水中，在4℃下浸泡12-24小时，然后切开果皮，挑出未成熟种子，再次用0.1％HgCl₂溶液消毒3-8min，最后用无菌水清洗4-6次，每次1-3min。

2)胚性愈伤组织的诱导及含有不同浓度6-BA和2，4-D组合的胚性愈伤组织诱导培养基的诱导效果比较

胚性愈伤组织诱导培养基：在MS基本培养基的基础上添加了6-BA 0-2.0mg/L和2，4-D 0-2.0mg/L。

以步骤1)获得的经灭菌的未成熟种子为外植体，将其置于上述含有不同浓度6-BA和2，4-D组合的胚性愈伤组织诱导培养基(每个培养皿中接种50粒，每个组合接种5个培养皿，重复3次)上在温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux下诱导胚性愈伤组织，并对含有不同浓度6-BA和2，4-D组合的胚性愈伤组织诱导培养基的诱导效果进行比较。

结果除仅含2，4-D的MS培养基以外，在含其它不同浓度6-BA和2，4-D组合的MS培养基上的种子外植体均能产生颗粒状突起，接种后第5天，未成熟种子中部膨胀，接种6天后，在显微镜观察到少量浅绿色的颗粒状突起，即多细胞原胚(将图1)，接种12天后，未成熟种子表面长满浅绿色颗粒，其中在仅含6-BA(1.0-2.0mg/L)的MS培养基上的胚性愈伤组织诱导率高达100％，而在附加6-BA(1.0-2.0mg/L)和2，4-D的不同浓度组合的MS培养基上的诱导率最高只有80％，在只含2，4-D的MS培养基上不能诱导出胚性愈伤组织，表明在香果树体细胞胚胎的诱导过程中，6-BA是必需的，2，4-D具有一定抑制作用，因此将胚性愈伤组织诱导培养基定为：在MS基本培养基的基础上添加了6-BA 0.1-2.0mg/L和2，4-D 0-2.0mg/L。若诱导产生的多细胞原胚继续在原培养基上培养，多细胞原胚可发育成球形胚，但不能进一步完成由球形胚向心形胚、鱼雷胚到子叶胚的分化发育。

3)体细胞胚的分化及含有不同浓度6-BA和NAA组合的分化培养基的诱导分化效果比较

分化培养基：在MS基本培养基的基础上添加了6BA 0.1-2.0mg/L和NAA0.1-2.0mg/L。

将诱导15天后获得的步骤2)获得的胚性愈伤组织(外植体表面长满的浅绿色颗粒)转接入上述含有不同浓度6-BA和2，4-D组合的分化培养基上在温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux下诱导分化，并对含有不同浓度6-BA和NAA组合的分化培养基的诱导分化效果进行比较。

结果在上述含有不同浓度6-BA和NAA组合的分化培养基上均可进行多细胞原胚的诱导分化，其中，在含6-BA 0.1mg/L和NAA 1.0mg/L的MS培养基上，20天后，浅黄色胚性愈伤组织的体积是转接时的100倍以上，随后，多细胞原胚进一步发育成球形胚(见图2)、心形胚、鱼雷胚(见图2)和子叶胚，据统计，每0.5g的胚性愈伤组织中含有1000个以上的各个时期的胚状体(见图3和图4)，继续培养，产生大量子叶胚。

4)生根和植株再生

生根培养基：1/2MS培养基(包含的大量和微量元素为MS基本培养基全量的1/2，1/4-3/4MS培养基均可)。

将步骤3)获得的已经长出两片子叶的子叶胚转接到1/2MS培养基上在温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux下诱导生根，约20天后开始生根，茎端和根端同时发育，45天后发育成完整植株(见图5和图6)。

5)炼苗和移栽

先将步骤4)中经生根培养后得到的再生苗进行炼苗，方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，将其与空气接触，在25±2℃下保温5-10天；然后将经炼苗的再生苗(见图7)移栽到按等比(1/4-3/4比例均可)混合的沙土和椰蓉的混合基质中培养，得到香果树再生植株(见图8)，成活率达98％。

Claims

1、香果树的体外培养方法，包括以下步骤：

1)胚性愈伤组织的诱导：以经灭菌的种子为外植体，将其置于胚性愈伤组织诱导培养基上诱导胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和2，4-D，所述胚性愈伤组织诱导培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1-2.0mg/L，2，4-D的浓度为0-2.0mg/L；

2)体细胞胚的分化：将胚性愈伤组织置于分化培养基上诱导分化；所述分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤和α-萘乙酸，所述分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1-2.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1-2.0mg/L；

2、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的种子为未成熟的种子；对种子进行灭菌的方法为：先将香果树未成熟果实在浓度为每100mL含4-8滴洗洁净的水溶液中浸泡20-40min后刷洗，再用水冲洗1-3h，然后将其置于超净工作台上在75％酒精中浸泡30-90s，随后用每100mL含2-4滴的土温-40的0.1％HgCl₂溶液消毒10-20min，用无菌水清洗4-6次，每次1-3min，清洗后置于无菌水中，在4℃下浸泡12-24小时，然后切开果皮，挑出种子，再次用的0.1％HgCl₂溶液消毒3-8min，最后用无菌水清洗4-6次，每次1-3min。

3、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述生根培养基为1/2MS培养基。

4、根据权利要求1-3中任一所述的培养方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织诱导培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为2.0mg/L，2，4-D的浓度为0mg/L；所述分化培养基中6-苄基腺嘌呤的浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸的浓度为1.0mg/L。

5、根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux；步骤2)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux；步骤3)的培养条件为：温度25±2℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux。

6、根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中胚性愈伤组织的诱导时间为10-17天；步骤2)中的诱导分化时间为60-90天；步骤3)中培养20天后开始生根。

7、根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：对步骤3)中经生根培养后得到的再生苗进行炼苗，方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，将其与空气接触，在25±2℃下保温5-10天。