CN106538385B - 一种连香树的体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种连香树的体外培养方法。以连香树授粉种子为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织、愈伤组织的增殖、胚性愈伤组织的诱导和增殖、体细胞胚胎的分化、植株再生。本发明方法培育周期在175天左右、再生植株成活率达到85%以上。

Description

一种连香树的体外培养方法

技术领域

本发明属于植物的体外培养技术领域，涉及一种连香树的体外培养方法。

背景技术

连香树(Cerdiphyllum japonicum Sieb.)又称山白果、云义树，为连香树科连香树属落叶乔木，高10-20m，胸径达1m，单科单属稀有种，在中国与日本均有自然分布，在国内连香树的分布向西可到四川，向东可到安徽浙江，最北可到山西中条山。连香树雌雄异株，花先叶开放或与叶同放，花期为3-4月，果实9-10月成熟，种子卵圆形，顶端有长圆形透明刺。其味芳香，百米可闻，因其大树越摇越香而得名连香树。连香树喜欢潮湿与阳光充足的环境，一般生长在1000-1500m海拔的山沟与混交林中。连香树自然生长的环境中，年平均气温为10℃至20℃，年降水量50-2000mm，充沛的雨量与潮湿的环境，这种冬暖夏凉的特殊生境满足了连香树的生长与自我更新的需求。连香树材质优良，木材纹理通直，结构细致，质地坚硬，心材与边材区别明显，是小提琴、室内装修与实木家具的理想用材。果与叶可作药用，药用价值也很高。连香树不仅具有很高的经济价值，连香树树姿雄伟，叶型奇特美观，具有很高的观赏价值。连香树现多为单株分布，结实量少，结实率低，种子较小，幼苗植株纤细易染病，天然更新能力较差，再加上大量盗挖林下幼苗，使其处于濒危状态，目前连香树已被列为国家二级保护植物。

在目前全国大力发展城市园林绿化，努力创建森林城市的大环境下，这对具有优秀观赏价值的彩叶树种连香树而言，市场需求十分广巨大；但由于各种因素的影响，导致自然环境下的连香树资源已经十分稀少。所以，加快对连香树快速扩繁技术的研究步伐已经成为重中之重的任务。

连香树育种主要采用传统方法，如播种、扦插、埋根等，采用传统手法育种存在果实颗粒小收集困难，种子发芽率低和实生苗生长周期长，以及出苗率不高等问题。因此，探索连香树快速繁殖的有效途径和手段成为亟待解决的问题。目前，国内学者对连香树生物学和生态学特性、自然分布、种群结构、资源现状与保护、解剖、濒危原因、引种繁育、扦插繁殖、过氧化物酶同工酶分析等方面进行了研究报道。另外，麦苗苗、杨欣超等、张先云等、陈荣珠等、杜敏华等和袁丽洁等探究了不同种类和不同浓度的植物生长调节剂，以及不同类型的外植体对连香树愈伤组织的诱导、腋芽的诱导、愈伤组织的增殖和生根的影响；但对于连香树体细胞胚胎发生的研究未见有相关报道。

发明内容

本发明提供一种连香树的体外培养方法，其方法的培育周期在170天左右、再生植株成活率达到85%以上。

本发明技术方案：

一种连香树的体外培养方法，所述方法包括以下步骤 ：

1）愈伤组织的诱导：以连香树授粉的种子为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸和活性炭（AC）；

2）愈伤组织的增殖：将步骤1）诱导后的愈伤组织置于增殖培养基上增殖，所述增殖培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-1.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.001-1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L活性炭；

3）胚性愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2）增殖后的愈伤组织置于诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，并在诱导培养基上继代增殖，得到；所述的胚性愈伤组织诱导、增殖培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-2.0 mg/L 的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.001-2.0 mg/L的α-萘乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L活性炭；

4）体细胞胚胎的分化：将经步骤3）继代增殖后的胚性愈伤组织置于分化培养基上诱导体细胞胚胎分化；所述的分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-1.0 mg/L的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.001-2.0mg/L的α-萘乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L的活性炭；

5）植株再生：将经步骤4）分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发，得到连香树再生苗。

优选地，所述步骤1）中的连香树外植体为未成熟合子胚。

优选地，所述方法步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.001-1.0 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.001-2.0 mg/L，活性炭的浓度为0.05-1.0 g/L。

进一步优选地，所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度度为0.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为2.0 mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

优选地，所述步骤2）增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

优选地，所述方法步骤3）胚性愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5mg/L，α-萘乙酸的浓度为1.0 mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L。

所述方法步骤3）胚性愈伤组织增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1 mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

优选地，所述步骤4）所述分化培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

优选地，所述步骤5）所述的植株再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.1-1.0 mg/L 的吲哚丁酸。

优选地，所述步骤1）、所述步骤2）、所述步骤3）、所述步骤4）、所述步骤5）培养条件为：温度23~27℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux。

优选地，所述步骤1）中以连香树授粉100-130天的种子为外植体，愈伤组织的诱导时间为10-20天，外植体成为长满浅黄色的愈伤组织；

所述步骤2）中的愈伤组织增殖时间为20-40天，浅黄色愈伤组织逐渐转变为黄褐色颗状愈伤组织；

所述步骤3）中的胚性愈伤组织的诱导和增殖时间为20-40天，黄褐色颗粒状愈伤组织分化生成黄色的胚性愈伤组织；

所述步骤4）中的胚胎分化时间为20-40天，黄色的胚性愈伤组织分化成绿色的体胚；

所述步骤5）中的再生培养时间为30天，体细胞胚萌发生成再生苗。

本发明有益效果：

1、本发明提供了连香树的一种体外培养方法。该方法是利用未成熟子叶胚及其它类似材料作为外植体，通过胚性愈伤组织诱导途径得到再生植株。以子叶胚为外植体进行离体再生的优势在于取材方便、可提供的材料充足。用该方法可高频率地诱导出大量的连香树体细胞胚胎，再生植株成活率高，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点。本发明为扩大连香树的繁殖系数、该物种的种质保存及遗传转化奠定了良好的基础，应用前景广阔。

2、本发明方法的培育周期在175天左右、再生植株成活率达到85%以上。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1为增殖后的黄色胚性愈伤组织。

图2为显微镜下观察到的球形胚。

图3为显微镜下观察到的心形胚。

图4为显微镜下观察到的鱼雷胚。

图5为显微镜下观察到的子叶胚。

图6为显微镜下观察到的绿色子叶胚。

图7为胚状体。

图8萌发的连香树体胚苗。

图9为本发明方法步骤。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

1/2MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium forrapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,1962, 15: 473-497）配制，仅将大量元素减为原来的一半。

如图9中，连香树的体外培养方法主要内容如下，灭菌——愈伤组织的诱导——愈伤组织的增殖——胚性愈伤组织的诱导和增殖——体细胞胚胎的分化——植株再生——移植，具体实施如下：

一、子叶胚的灭菌

取连香树幼果在洗洁净液中用软刷清洗，自来水冲洗2 h，在超净工作台上用75 %酒精灭菌60 s，0.1 % HgCl₂消毒15 min，无菌水清洗5~6次。用灭菌的手术刀纵向切开果皮，挑出未成熟种子合子胚，作为外植体。

二、愈伤组织的诱导及含有不同浓度6-苄氨基嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果比较。

愈伤组织诱导培养基：在MS基本培养基的基础上添加了

（1）2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)（0.001-2.0mg/L），激动素（KT）（0.001-2.0mg/L）。

（2）6-苄基腺嘌呤(6-BA）（0.001-2.0mg/L），α-萘乙酸（NAA）（0.001-2.0mg/L），激动素（KT）（0.001-2.0 mg/L）。

（3）2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，6-苄基腺嘌呤(6-BA）（0.001-1.0mg/L）和活性炭（AC）（0.05-1.0 g/L）。

（4）不添加任何植物生长调节剂的空白对照MS培养基。

每个培养瓶中接种15粒，每个组合接种20瓶，重复3次）上，在温度25±2℃，光照时间12-16 h／天，光照强度2000-2500 lux下诱导愈伤组织，并对含有不同浓度以上四种组合的愈伤组织诱导培养基的诱导效果进行比较。

组合（1）添加了植物生长调节剂的培养基上，在当2,4-D浓度一定时，随着KT浓度升高，愈伤诱导率呈现先上升再下降的趋势。子叶胚在接种第25 d开始启动，子叶胚中部膨大，表面变得粗糙。培养40 d后，子叶胚均能诱导出大量的愈伤组织，愈伤组织呈黄绿色疏松状。当2,4-D浓度为2.0 mg/L、KT的浓度为1.0 mg/L时，愈伤诱导率最高达到73.33%。在后期的增殖培养中愈伤组织能快速的增殖成大团的疏松状愈伤组织，但却不能转化成为胚性愈伤组织。由此可见，由2,4-D和KT组合的培养基不适合诱导连香树胚性愈伤组织。而在组合（4）未成熟种子子叶胚在空白对照培养基上没有愈伤组织出现。

在组合（2）愈伤组织多呈现黄色、黄绿色与浅紫红色相间的状态，30 d后将愈伤组织转接到MS附加0.1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA和0.5 g/L AC的增殖培养基培养，愈伤组织的质地和形态未发生较明显的改变，后期培养不能转化成为胚性愈伤组织。由此可见，由6-BA、NAA和KT组合的培养基不适合诱导连香树愈伤组织。

在组合（3）子叶胚在第30 d开始启动，子叶胚从中部开始膨大翘起，愈伤组织呈浅黄绿色疏松状，继续培养10 d后，外植体表面长满浅绿色愈伤组织，整体变大。

在组合（4）不含任何植物生长调节剂的对照培养基上不能诱导出愈伤组织。在不含6-BA和2,4-D，仅有0.05 g/L AC的MS培养基上，也能诱导出愈伤组织，可见活性炭在诱导愈伤组织中也能起到一定的作用，虽然这种类型的愈伤组织在后期的培养中能快速增殖，但不能转化为胚性愈伤组织。在附加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D和1.0 g/L AC的MS培养基上，愈伤诱导率最高可达到59.33%。尽管在6-BA、2,4-D和活性炭组合的诱导培养基上的愈伤组织诱导率整体偏低，但是在其中几个组合培养基上能观察到有直接体胚发生的现象，在附加0.5 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2,4-D和0.5 g/L AC的MS培养基上，直接体胚发生诱导率最高达3.33%。在无添加6-BA和2,4-D的培养基上也能有直接体胚发生，说明低浓度的活性炭具有启动体胚发生的作用。但是当活性炭浓度维持在0.05 g/L时，附加了6-BA和2,4-D的MS培养基上均不能诱导直接体胚发生，可见6-BA和2,4-D对于低浓度的活性炭在诱导直接体胚发生上有一定的抑制作用。将诱导出的愈伤及体胚转接至MS附加0.1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA和0.5 g/L AC的增殖培养基上培养30 d，大部分黄绿色、紫红色的愈伤组织形态和质地没有发生明显改变，但是增殖速度很快，可以观察到组织块表面有白色颗粒状晶体出现，但是这部分愈伤组织后期培养无法转化成为胚性愈伤组织。少部分浅黄绿色愈伤组织在培养一段时间后颜色转变为黑色、质地疏松柔软呈颗粒状，生长相对缓慢；将黑色的愈伤组织转接到相同组合的新鲜培养基中继代培养，30 d后，黑色愈伤组织表面开始出现大量的浅黄色颗粒状的体细胞胚，将这种黑褐色、质地疏松、易捣碎且生长快速，进一步培养可以转化成体细胞胚的愈伤愈伤组织称为胚性愈伤组织。经过继代培养几代后，发现来源于不同组合诱导培养基产生的愈伤组织在诱导体胚发生的能力上有差异。来源于附加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D和1.0 g/L AC或附加1.0 mg/L 6-BA和0.5 g/L AC的MS培养基上的愈伤组织在增殖培养基中，只能产生少量的胚性愈伤组织，而且在后期的继代培养中容易失去胚性分化成畸形苗；而来源于附加0.5 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2,4-D和0.5 g/L AC的MS培养基上的愈伤组织能长出大量的黑褐色的胚性愈伤组织，并且生长非常旺盛；而来源于其他6-BA、2,4-D和AC组合的培养基上的愈伤组织不能诱导产生黑褐色的胚性愈伤组织。在这三个组合培养基中可以观察到，2,4-D浓度大小对诱导胚性愈伤组织影响不大，而只有当6-BA处于较高浓度时，愈伤组织才会在增殖培养基中转化为胚性愈伤组织。由此可见，最适合诱导愈伤组织的培养基是附加0.5 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2,4-D和0.5 g/LAC的MS培养基，并且这个组合的培养基诱导直接体胚发生频率最高。

三、愈伤组织的增殖及含有不同浓度的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和活性炭（AC）组合的培养基对愈伤组织增殖的效果比较。

MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-1.0 mg/L 的6-苄氨基嘌呤(6-BA)，浓度为0.001-0.1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和浓度为0.05-1.0g/L活性炭（AC）。

将诱导出的愈伤及体胚转接至MS附加6-苄氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和活性炭（AC）组合的增殖培养基上培养30 d，大部分黄绿色、紫红色的愈伤组织形态和质地没有发生明显改变，但是增殖速度很快，可以观察到组织块表面有白色颗粒状晶体出现，但是这部分愈伤组织后期培养无法转化成为胚性愈伤组织。少部分浅黄绿色愈伤组织在培养一段时间后颜色转变为黑色、质地疏松柔软呈颗粒状，生长相对缓慢；将黑色的愈伤组织转接到相同组合的新鲜培养基中继代培养，30 d后，黑色愈伤组织表面开始出现大量的浅黄色颗粒状的体细胞胚，将这种黑褐色、质地疏松、易捣碎且生长快速，进一步培养可以转化成体细胞胚的愈伤愈伤组织称为胚性愈伤组织（图1）。

在6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的浓度为0.1mg/L，活性炭（AC）的浓度为0.5g/L的培养基上，愈伤长势最好；

四、胚性愈伤组织的诱导和增殖：将上述步骤增殖后的愈伤组织置于胚性愈伤诱导培养基上培养；

胚性愈伤诱导和增殖含有不同浓度6-苄氨基嘌呤和α-萘乙酸（NAA）组合的分化培养基的诱导分化效果比较。

1、诱导：将步骤三黑褐色愈伤组织转接到MS附加不同浓度的6-BA（0.001-1.0mg/L）、NAA（0.001-2.0mg/L）和AC（0.001-1.0g/L）组合培养基上诱导胚性愈伤组织发生，培养30d后统计体胚诱导率，胚性愈伤组织在不添加6-BA和NAA，仅有0.05 g/L AC的MS培养基上也能分化出浅黄色颗粒状的组织，但分化率极低。在MS附加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA和1.0 g/L AC的组合培养基上体胚的诱导率最高达30%，是较为理想的诱导胚性愈伤组织培养基。

2、增殖：将生长良好、来源于相同培养基的胚性愈伤组织转接至MS附加6-BA、NAA和0.5 g/L AC的组合培养基中，观察对愈伤组织增殖的影响，观察并记录体细胞胚的增殖及分化情况，观察到在附加0.05 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA或0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg/LNAA的培养基上，体细胞胚增殖的速度明显小于分化成小苗的速度，体细胞胚总体呈现分化成苗的趋势，体细胞胚在这两个组合的培养基上继代培养几代后，细胞会渐渐失去胚性。在附加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的培养基上，胚性愈伤组织增殖的速度较快，体细胞胚分化成苗的速度与增殖的速度相差不大，胚性愈伤组织增殖速度曲线呈现先上升后下降再平稳发展的循环。而在附加0.1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA和0.5 g/L AC的培养基上，由于添加了具有吸附培养基中多余生长调节剂及有毒物质功能的活性炭的缘故，胚性愈伤组织增殖的速度明显快于体胚分化成苗的速度，并且在分化出的小苗表面能快速长出亮黄色的颗粒状的体细胞胚。

在诱导连香树愈伤组织和体胚发生的试验中还发现，活性炭的浓度大小对诱导结果有一定的影响，并且培养基中pH值的大小以及琼脂浓度的大小都会影响体细胞胚胎的增殖。

1）不同pH值对连香树胚性愈伤组织增殖的影响

将生长良好、来源相同的胚性愈伤组织胚转接到只有pH值不同的附加0.1 mg/L6-BA、0.1 mg/L NAA和0.5 g/L AC的培养基中，观察记录胚性愈伤组织增殖的情况，将培养基的pH值设了三个梯度分别为5.8、6.0和6.2。不同的pH值对胚性愈伤组织的增殖有明显的影响，当pH为5.8时，培养基较软含水量较多，胚性愈伤组织增殖速度慢且褐化严重，培养后期胚性愈伤组织容易失去胚性或很容易分化成小苗；当pH为6.2时，培养基较硬含水量较少，胚性愈伤组织不容易吸收培养基中的营养，且增殖缓慢，培养一段时间后胚性愈伤组织逐渐干枯而死亡；只有当pH保持在6.0时，胚性愈伤组织增殖速度快，生长状况良好，褐化极少。由此可见，最适宜连香树胚性愈伤组织继代增殖的pH值为6.0。

2）不同浓度琼脂对连香树体细胞胚胎增殖的影响

将生长良好、来源相同的胚性愈伤组织转接到只有琼脂浓度不同的附加0.1 mg/L6-BA、0.1 mg/L NAA和0.5 g/L AC，pH为6.0的培养基中，观察并记录愈伤组织增殖的情况，当琼脂浓度在0.65%~0.7%g/L时，培养基偏软，胚性愈伤组织的萌发速度大于增殖速度，黄色颗粒状的体胚表面逐渐变得模糊，胚性愈伤组织有转化为非胚的趋势，细胞含水量明显增加；当琼脂浓度在0.75%~0.8% g/L时，培养基偏硬，不利于胚性愈伤组织吸收培养基中的营养，愈伤组织增殖缓慢，培养一段时间后体胚干枯死亡；而当琼脂浓度在0.7%~0.75% g/L时，胚性愈伤组织增殖速度远远快于萌发成苗的速度，并且在分化体胚表面能明显的看到新长出来的鲜黄色的颗粒状的体细胞胚。由此可见，最适宜连香树胚性愈伤组织增殖的琼脂浓度为0.7%~0.75% g/L。

五、体细胞胚胎的分化

在MS基本培养基的基础上添加为0.001-1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤(6-BA)，浓度为0.001-2.0mg/L 的α-萘乙酸（NAA）和浓度为0.05-1.0 g/L的活性炭（AC）；

将连香树胚性愈伤组织转接到MS附加上述植物生长调节剂组合的分化培养基（所述的体细胞胚胎分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为1.0 mg/L 的6-苄氨基嘌呤(6-BA)，浓度为0.1mg/L 的α-萘乙酸（NAA）和浓度为0.5g/L的活性炭（AC））中培养，体细胞胚生长速度快且状态良好，虽然有部分体细胞胚分化成为小苗，但总体趋势能够维持体细胞胚大量增殖的。发现在体细胞胚分化出的小苗表面能长出次级胚，且次级胚增殖速度也比较快，也能维持较长时间的胚性。

胚性愈伤向体细胞胚分化过程中可在显微镜下观察到体细胞胚的四个阶段（图2-5）；由于添加了具有吸附培养基中多余生长调节剂及有毒物质功能的活性炭的缘故，体细胞胚增殖的速度明显快于分化成苗的速度，后期出现绿色的子叶胚（图6），并且在分化出的小苗表面能快速长出亮黄色的颗粒状的体细胞胚（图7）。

六、 植株再生

将步骤（4）具有有两片子叶的体细胞胚转入MS不添加任何植物生长调节剂的植株再生培养基中，茎端和根端能同时生长，但植株继代培养约3代以后叶片开始出现病斑，随后逐渐干枯脱落导致植株死亡。于是，将已经长高3-5 cm的连香树体胚苗（图8）转接至MS附加不同浓度生长素IBA（吲哚丁酸）（0.5，1.0，2.0 mg/L）的培养基中进行培养。培养30 d后得到的结果如下：在生根培养基上，连香树体胚苗均能生长，有红色不定根产生，根尖为白色，根部呈辐射状生长。当IBA浓度为0.5 mg/L时，体胚苗每株侧根为2-4根左右，平均长度2-3 cm，有红色不定根产生但根毛较少，叶片易出现病斑，继代培养几代后叶片脱离植株干枯死亡；当IBA浓度为2.0 mg/L时，体胚苗每株侧根为2-5根左右，平均长度2-4 cm；而IBA浓度为1.0 mg/L时，连香树体胚苗根部生长健壮，叶片基本上无病斑出现，继代培养多次后能发育成为生长健壮的正常植株。由此可见，连香树最适合的再生培养基为MS + IBA1.0 mg/L。

七、炼苗和移栽

先将步骤六中经体胚萌发培养后得到的再生植株进行炼苗，移植。炼苗方法为：待再生苗长出3-5片真叶时，将再生苗从培养瓶中移至缓冲间培养，逐步打开组培瓶盖，使再生植苗与空气接触，在20-25℃下炼苗7天；再将再生苗从缓冲间中移至培养室外常温下炼苗培养7天左右。再取出再生苗，在流水下彻底清洗根部的培养基，最后将幼苗移至装有已灭菌培养基质(腐殖土：珍珠岩=1：1)的花盆中，浇透水置于温棚中培养。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤 ：

1）愈伤组织的诱导：以连香树授粉的种子中未成熟合子胚为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸和活性炭（AC）；

2）愈伤组织的增殖：将步骤1）诱导后的愈伤组织置于增殖培养基上增殖，所述增殖培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-1.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤，浓度为0.001-1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L活性炭；

3）胚性愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2）增殖后的愈伤组织置于诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，并在胚性愈伤组织增殖培养基上继代增殖；所述的胚性愈伤组织诱导、增殖培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-2.0 mg/L 的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.001-2.0 mg/L的α-萘乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L活性炭；

4）体细胞胚胎的分化：将经步骤3）继代增殖后的胚性愈伤组织置于分化培养基上诱导体细胞胚胎分化；所述的分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.001-1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，浓度为0.001-2.0mg/L的α-萘乙酸和浓度为0.05-1.0 g/L的活性炭；

5）植株再生：将经步骤4）分化出的体细胞胚胎置于再生培养基上诱导体胚萌发，得到连香树再生苗；

所述方法步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.001-1.0 mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.001-2.0 mg/L，活性炭的浓度为0.05-1.0 g/L；

所述步骤5）所述的植株再生培养基是在MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.1-1.0mg/L 的吲哚丁酸。

2.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1）中的连香树外植体为未成熟合子胚。

3.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1）中愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度度为0.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为2.0 mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

4.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤2）增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

5.根据根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述方法步骤3）胚性愈伤组织诱导培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5mg/L，α-萘乙酸的浓度为1.0 mg/L，活性炭的浓度为1.0g/L；

所述方法步骤3）胚性愈伤组织增殖培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为0.1mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1 mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

6.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤4）所述分化培养基中6-苄氨基嘌呤的浓度为1.0 mg/L，α-萘乙酸的浓度为0.1mg/L，活性炭的浓度为0.5g/L。

7.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：所述步骤1）、所述步骤2）、所述步骤3）、所述步骤4）、所述步骤5）培养条件为：温度23~27℃，光照时间12-16h/天，光照强度2000-2500lux。

8.根据权利要求1所述的一种连香树的体外培养方法，其特征在于：

所述步骤1）中以连香树授粉100-130天的种子中的未成熟合子胚为外植体，愈伤组织的诱导时间为10-20天；

所述步骤2）中的愈伤组织增殖时间为20-40天；

所述步骤3）中的胚性愈伤组织的诱导和增殖时间为20-40天；

所述步骤4）中的胚胎分化时间为20-40天；

所述步骤5）中的再生培养时间为30天。