CN107568063B - 一种油料植物白檀组培快繁方法 - Google Patents
一种油料植物白檀组培快繁方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种油料植物白檀组培快繁方法。该方法如下：外植体选择与预处理→成熟种胚的启动培养→带根无菌苗→取无菌根为外植体→胚性愈伤组织诱导→体细胞胚胎分化及增殖→体细胞胚胎成熟及萌发培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种油料植物白檀组培快繁方法。
背景技术
白檀（Symplocos paniculata (Thunb.) Miq.）是山矾科山矾属植物，又名山桂花，为我国原产树种，适生能力强，分布范围非常广泛，北自辽宁、南至台湾均有分布。白檀树形优美、枝叶婀娜、白花蓝果，具有较高的观赏价值，是园林绿化的理想树种；白檀适应性强，根系发达，能有效的防治水土流失，又是很好的防护林造林树种；白檀的根、叶、花或种子均可入药，具有较高的药用价值；白檀果实含油率高，含有多种不饱和脂肪酸，能够满足人体所需的多种营养成分，同时，又是制备生物柴油的理想原料，是一种不可多得的兼具食用及工业两用的木本油料植物。白檀全身是宝，其综合利用价值较高，目前已被作为能源及绿化树种引种栽培。
白檀多为野生资源，人为破坏非常严重，资源量日趋紧缩，对白檀后期的良种选育以及推广利用形成毁灭性威胁。由此可见，当务之急是进一步保护白檀现有资源，减少优良种质资源的流失。目前，白檀资源的人工繁育多为实生苗繁殖，但由于白檀种子具有休眠特性，当年生种子发芽率极低，延长了白檀育苗周期；同时该繁殖方法受季节性限制且苗木容易发生变异，不能保持母本的优良性状，导致苗木品质的不稳定。而组织培养作为一种快繁技术，不仅能够实现快速繁殖，而且能够保持植株的优良遗传性状，是一种比较理想的繁殖方式。本发明通过对白檀体细胞胚胎发生、丛芽诱导及植株再生体系的建立，为白檀的快速繁殖提供了新的途径，为白檀资源保护、遗传转化、人工制种以及规模化开发利用提供技术依据。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种油料植物白檀组培快繁方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述油料植物白檀组培快繁方法包括如下步骤：
（1）将白檀种子去除果肉，温水洗净，以确保白檀种子外壳没有油脂，备用；
（2）将洗净的白檀种子再用无菌水洗涤后浸泡于体积百分比浓度为75%的酒精溶液中25—35s，用无菌水冲洗后浸泡于体积百分比浓度为0.1%的升汞中8—12min，用无菌水冲洗后去除种皮和胚乳，取出种胚备用；
（3）以MS培养基为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和萘乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得种胚培养基；所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，萘乙酸的浓度为0.03—0.07mg/L；将种胚接种至种胚培养基后于20—30℃进行暗培养15—20d，待根系发育完全形成完整植株，则进行散射光培养6—8d，待叶片舒展后转入光照培养，光照12h/d，光照强度为2000LX；至获得无菌苗，将无菌苗的根作为组培快繁的外植体，备用；
（4）以MS或改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得胚性愈伤组织的诱导培养基；所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.3mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1—0.3mg/L；将外植体接种至诱导培养基，于20—26℃进行避光培养15—20d，得胚性愈伤组织；
（5）以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎分化及增殖培养基；所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.05—0.2mg/L；将胚性愈伤组织接种至体细胞胚胎分化及增殖培养基，于20—26℃进行避光培养15—25d，得分化后的体细胞胚；
（6）以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和GA3，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎成熟及萌发培养基；所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L；将分化后的体细胞胚接种至体细胞胚胎成熟及萌发培养基，于20—26℃进行暗培养15—20d；当体细胞胚胎达到成熟的子叶胚的阶段时，转入大量元素减半的改良MS培养基中进行成熟体细胞胚的萌发培养，所述大量元素减半的改良MS培养基中加入白砂糖，白砂糖在大量元素减半的改良MS培养基中的质量百分比浓度为1.3—1.7%；萌发培养前10d采用避光培养，培养温度20—26℃，待根系发育完全，子叶伸展，苗高长至1.5cm时，转入光照培养，培养温度20—26℃，光照12h/d,光照强度为2000LX，培养20—25d。
优选地，步骤（3）所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，萘乙酸的浓度为0.05mg/L。步骤（4）所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.15mg/L。步骤（5）所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1mg/L。步骤（6）所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L。步骤（6）所述白砂糖在大量元素减半的改良MS培养基中的质量百分比浓度为1.5%。步骤（6）所述大量元素减半的改良MS培养基是指KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、Na2SO4、Ca(NO3)2·4H2O、CaCl2·2H2O减半的改良MS培养基。
下面对本发明作进一步说明：
本发明方法包括以下几个部分：
1、 外植体选择与预处理
通过连续3年对野外白檀资源定点定时调查，选择出生长健壮，无病虫害，挂果率高且稳定的优良单株作为母株。
于11月下旬，待果子成熟后，采摘带回实验室。将从野外采回的种子去除果肉，用35℃的温水加洗洁剂浸泡30min，然后将种子揉搓干净，再放于流水下冲洗，以确保种子外壳没有油脂。
将洗干净的种子放于超净工作台，用无菌水洗涤2—3次，之后浸泡于75%的酒精溶液中30s，用无菌水冲洗2—3次，最后用0.1%的升汞浸泡10min，用无菌水冲洗4—5次，用无菌滤纸吸干种子外种皮的水分。最后，去除种皮和胚乳，取出种胚以备用。
2、成熟种胚的启动培养
以MS培养基为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和萘乙酸（NAA），调节pH值为5.8—6.4，得种胚培养基；所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，萘乙酸的浓度为0.03—0.07mg/L。每个培养瓶中接种3个成熟胚，接种后用深蓝色棉布覆盖进行暗培养，培养温度为25℃左右，培养15d；待根系发育完全形成完整植株，揭开深蓝色棉布，进行散射光培养，培养7d；待叶片舒展，转入光照培养，光照12h/d,光照强度为2000LX，使无菌苗更有韧性，以备后续环节使用。
3、带根无菌苗
通过成熟种胚启动培养获得的无菌苗分为两部分:根和茎段，其中根用组培快繁外植体。
4、胚性愈伤组织的诱导
以MS或改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），调节pH值为5.8—6.4，得胚性愈伤组织的诱导培养基；所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.3mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1—0.3mg/L；将外植体接种至诱导培养基，于20—26℃进行避光培养15—20d，得胚性愈伤组织，其中以改良MS+0.25 mg·L-16-BA +0.15mg·L-12,4-D所诱导的胚性愈伤组织最好，诱导率高达94.8%。
5、体细胞胚胎分化及增殖培养
以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎分化及增殖培养基；所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.05—0.2mg/L。将诱导出的胚性愈伤组织接种到体细胞胚胎分化和增殖培养基上，培养条件与胚性愈伤组织诱导过程相同。经过25d的培养，在改良MS+0.25mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D培养基上，可使白檀体细胞胚胎分化率和增殖系数分别达到80%和5.5，且分化出的体胚颜色为乳白色，体胚完整。
6、体细胞胚胎成熟及萌发培养
以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和GA3，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎成熟及萌发培养基；所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L。将诱导分化出的体细胞胚转入此培养基中，暗培养15d，培养温度20—26℃。
当体细胞胚胎达到成熟的子叶胚的阶段时，转入大量元素减半的改良MS+1.5%白砂糖（不添加任何外源激素，培养基PH值为5.8—6.4）培养基中进行成熟体细胞胚的萌发培养。萌发培养前10d，仍然采用避光培养，培养温度20—26℃。待根系发育完全，子叶伸展，苗高长至1.5cm时，转入光照培养，培养温度20—26℃，光照12h/d,光照强度为2000LX，培养20d。在该条件下，体细胞胚胎萌发且成苗率可达90%。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明通过成熟体胚预培养，用于后续环节作外植体，大大降低了培养过程的污染率，同时能够多重利用培养材料，所用植物材料极少；
2、本发明方法可以不受季节的限制，大幅度提高苗木增殖系数和生根率，在短时间内可获得大量的优质无菌苗；
3、由于快繁体系是通过体细胞胚胎发生和以芽繁芽的途径构建的，无菌苗的生根都没有经过愈伤组织培养阶段，苗木根系粗壮、不易脱落且呈辐射状分布，确保了苗木的移栽成活率，保证了苗木质量。
4、本发明有利于白檀资源保护和定向选育，可为白檀资源的综合开发利用提供大批优良种苗。该技术的实施推广，将对生态、经济以及能源方面产生积极影响。
具体实施方式
所述油料植物白檀组培快繁方法包括如下几个部分：
1、 外植体选择与预处理
通过连续3年对野外白檀资源定点定时调查，选择出生长健壮，无病虫害，挂果率高且稳定的优良单株作为母株。
于11月下旬，待果子成熟后，采摘带回实验室。将从野外采回的种子去除果肉，用35℃的温水加洗洁剂浸泡30min，然后将种子揉搓干净，再放于流水下冲洗，以确保种子外壳没有油脂。
将洗干净的种子放于超净工作台，用无菌水洗涤2—3次，之后浸泡于75%的酒精溶液中30s，用无菌水冲洗2—3次，最后用0.1%的升汞浸泡10min，用无菌水冲洗4—5次，用无菌滤纸吸干种子外种皮的水分。最后，去除种皮和胚乳，取出种胚以备用。
2、成熟种胚的启动培养
以MS培养基为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和萘乙酸（NAA），调节pH值为5.8—6.4，得种胚培养基；所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，萘乙酸的浓度为0.03—0.07mg/L。每个培养瓶中接种3个成熟胚，接种后用深蓝色棉布覆盖进行暗培养，培养温度为25℃左右，培养15d；待根系发育完全形成完整植株，揭开深蓝色棉布，进行散射光培养，培养7d；待叶片舒展，转入光照培养，光照12h/d,光照强度为2000LX，使无菌苗更有韧性，以备后续环节使用。
3、带根无菌苗
通过成熟种胚启动培养获得的无菌苗分为两部分:根和茎段，其中根用组培快繁外植体。
4、胚性愈伤组织的诱导
以MS或改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），调节pH值为5.8—6.4，得胚性愈伤组织的诱导培养基；所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.3mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1—0.3mg/L；将外植体接种至诱导培养基，于20—26℃进行避光培养15—20d，得胚性愈伤组织，其中以改良MS+0.25 mg·L-16-BA +0.15mg·L-12,4-D所诱导的胚性愈伤组织最好，诱导率高达94.8%。
5、体细胞胚胎分化及增殖培养
以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎分化及增殖培养基；所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.05—0.2mg/L。将诱导出的胚性愈伤组织接种到体细胞胚胎分化和增殖培养基上，培养条件与胚性愈伤组织诱导过程相同。经过25d的培养，在改良MS+0.25mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D培养基上，可使白檀体细胞胚胎分化率和增殖系数分别达到80%和5.5，且分化出的体胚颜色为乳白色，体胚完整。
6、体细胞胚胎成熟及萌发培养
以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和GA3，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎成熟及萌发培养基；所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L。将诱导分化出的体细胞胚转入此培养基中，暗培养15d，培养温度20—26℃。
当体细胞胚胎达到成熟的子叶胚的阶段时，转入大量元素减半的改良MS+1.5%白砂糖（不添加任何外源激素，培养基PH值为5.8—6.4）培养基中进行成熟体细胞胚的萌发培养。萌发培养前10d，仍然采用避光培养，培养温度20—26℃。待根系发育完全，子叶伸展，苗高长至1.5cm时，转入光照培养，培养温度20—26℃，光照12h/d,光照强度为2000LX，培养20d。在该条件下，体细胞胚胎萌发且成苗率可达90%。
Claims (6)
1.一种油料植物白檀组培快繁方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将白檀种子去除果肉，温水洗净，以确保白檀种子外壳没有油脂，备用；
（2）将洗净的白檀种子再用无菌水洗涤后浸泡于体积百分比浓度为75%的酒精溶液中25—35s，用无菌水冲洗后浸泡于体积百分比浓度为0.1%的升汞中8—12min，用无菌水冲洗后去除种皮和胚乳，取出种胚备用；
（3）以MS培养基为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和萘乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得种胚培养基；所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，萘乙酸的浓度为0.03—0.07mg/L；将种胚接种至种胚培养基后于20—30℃进行暗培养15—20d，待根系发育完全形成完整植株，则进行散射光培养6—8d，待叶片舒展后转入光照培养，光照12h/d，光照强度为2000LX；至获得无菌苗，将无菌苗的根作为组培快繁的外植体，备用；
（4）以MS或改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得胚性愈伤组织的诱导培养基；所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.3mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1—0.3mg/L；将外植体接种至诱导培养基，于20—26℃进行避光培养15—20d，得胚性愈伤组织；
（5）以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖、6-苄基氨基嘌呤和2,4-二氯苯氧乙酸，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎分化及增殖培养基；所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.1—0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.05—0.2mg/L；将胚性愈伤组织接种至体细胞胚胎分化及增殖培养基，于20—26℃进行避光培养15—25d，得分化后的体细胞胚；
（6）以改良MS为基本培养基，向基本培养基中加入琼脂粉、白砂糖和GA3，调节pH值为5.8—6.4，得体细胞胚胎成熟及萌发培养基；所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L；将分化后的体细胞胚接种至体细胞胚胎成熟及萌发培养基，于20—26℃进行暗培养15—20d；当体细胞胚胎达到成熟的子叶胚的阶段时，转入大量元素减半的改良MS培养基中进行成熟体细胞胚的萌发培养，所述大量元素减半的改良MS培养基中加入白砂糖，白砂糖在大量元素减半的改良MS培养基中的质量百分比浓度为1.3—1.7%；萌发培养前10d采用避光培养，培养温度20—26℃，待根系发育完全，子叶伸展，苗高长至1.5cm时，转入光照培养，培养温度20—26℃，光照12h/d,光照强度为2000LX，培养20—25d。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述种胚培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，萘乙酸的浓度为0.05mg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述诱导培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.15mg/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述体细胞胚胎分化及增殖培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.6—0.7%，白砂糖的质量百分比浓度为2—4%，6-苄基氨基嘌呤的浓度为0.25mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.1mg/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述体细胞胚胎成熟及萌发培养基中，琼脂粉的质量百分比浓度为0.65%，白砂糖的质量百分比浓度为3%，GA3的浓度为0.5—2.0mg/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述白砂糖在大量元素减半的改良MS培养基中的质量百分比浓度为1.5%。
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| GR01 | Patent grant | ||
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