CN104737913B

CN104737913B - 玛咖杂交种的无性快速繁殖方法

Info

Publication number: CN104737913B
Application number: CN201510156588.4A
Authority: CN
Inventors: 王枢
Original assignee: Huize Pivot Health Chinese Herbal Medicine Plantation Co Ltd
Current assignee: Huize Pivot Health Chinese Herbal Medicine Plantation Co Ltd
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2015-04-03
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2035-04-03
Also published as: CN104737913A

Abstract

本发明公开了一种玛咖杂交种的无性快速繁殖方法，将消毒处理后的玛咖杂交种外植体接入愈伤组织诱导培养基中，待愈伤组织发生后转入丛苗发生和增殖培养基中培养，待丛苗发生并增殖到一定数量时，在增殖培养基中继代增殖，增殖苗数量达到生根要求时，将丛苗中生长健壮的主苗转接至生根培养基中培养，苗壮根粗时按常规进行炼苗3 d后，移栽至装有消毒腐殖质的漂浮盘中培养60 d，得到生长健壮的玛咖杂交种无性种苗。本发明对玛咖杂交种无性种苗生产工艺进行了优化调整，在获得愈伤组织及丛芽后，增殖培养采用高NH₄ ⁺的MS和低NH₄ ⁺的B₅为基本培养基交替使用，彻底解决了玛咖试管苗易老化、黄苗现象，缩短无性繁殖周期，提高了繁殖效率，为玛咖杂交种F₁代优质种苗繁育提供了有效途径。

Description

玛咖杂交种的无性快速繁殖方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种药食两用植物玛咖杂交种的无性快速繁殖技术。

背景技术

玛咖Lepidium meyenii 为十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium ）一年生草本植物，原产于秘鲁海拔 3500 m 以上的安第斯山区，可在无肥料、缺氧、昼夜温差大、长期冰封的独特环境下正常生长。玛咖在营养成分和增强精力、耐力的功效方面可以与人参媲美，因此又常被称为“Peruvian Ginseng（秘鲁人参）”。由于玛咖在生长中吸取了大量的土壤养分，原始耕作情况下，玛咖根采收后的土地需要休耕数年才能再次种植，因此玛咖一度曾濒临绝种，被国际上列为濒危植物。直到 1982 年，在联合国粮农组织（FAO）和国际植物遗传资源研究所（IPGRI）等国际组织的努力下，这种珍贵的植物才得以逐步推广，嘉惠世人。此后，FAO 等国际组织又先后多次向各国推荐种植和食用玛咖，并指出玛咖是一种营养丰富的安全食物，可以解决多种因营养不足引起的健康问题。玛咖自2002年引进中国以来，十分适宜在我国西部高寒地区生长，并开始了产品加工，具有很好的市场前景，同时对改善西部生态环境、发展当地经济也将起到积极的推动作用。玛咖在中国的种植现主要集中在云南（占全国的98%），新疆（占全国的1%），西藏（占全国的0.5%），四川（占全国的0.5%），种植海拔在2500米以上。云南现有的种植规模已有10000亩左右，年产玛咖干果干片原料250吨，目前已基本满足初级市场的需求量。但随着市场的扩大，参照国外市场看，最终将会形成以玛咖食品、保健品、药品、食品添加剂、药品添加剂等形态的玛咖产业链，玛咖原料的需求量将会出现井喷现象。对此，云南省政府已经出台了“加快玛咖产业发展的若干意见”，将玛咖产业列为十二五重点发展的农业及生物产业对象，提出5年内建设5万亩的目标，至十二五结束达到15—20万亩的目标。

玛咖的繁殖全部依赖于种子繁殖。由于玛咖为自花授粉植物，所有植株均为纯合体，具高度的遗传稳定性，缺乏适应性分离和变异，即使发生偶然的变异，在自然选择下也很快会被稀释或淘汰。因此，一方面栽培玛咖时间过长，由于其适应性降低可能产生病毒或病害积累而导致品质、产量下降；另一方面在玛咖的栽培过程中即使出现符合人类需要的新性状或变异，很难用种子繁殖的方式将其固定，阻碍了玛咖在选育种方面的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对玛咖杂交种通过种子繁育后代出现严重的性状分离，继而丧失杂种优势和优良性状的情况，提供一种玛咖杂交种的无性快速繁殖方法，为固定、保存其杂种优势和发展玛咖选育种奠定技术基础，同时亦可提供基因型背景一致的优质杂交种种苗以满足人工种植的需求。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述玛咖杂交种的无性快速繁殖方法包括以下步骤：

（1）玛咖杂交种外植体的选择、处理

选择生长健壮的杂交种植株的幼嫩花序作为玛咖杂交种外植体，用自来水清洗所述幼嫩花序表面的不洁物后，放入烧杯中，用细纱布扎紧烧杯口，于自来水下流水冲洗2 h，置于超净工作台上，用灼烧过的镊子将幼嬾花序从烧杯内逐一取出，投入到体积比为75％的酒精中消毒15 s，再用质量比为0.1％的 HgCl₂灭菌5 min，最后用无菌水冲洗6-8次，去除幼嫩花序上残留的升汞，之后放在无菌滤纸上吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的外植体；

（2）接种、培养

Ⅰ、以[h1] 玉米素ZT 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 0.01～0.1 mg/L、蔗糖 20000mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得愈伤组织诱导培养基A；将所述步骤（1）选取的消毒灭菌玛咖杂交种外植体接种于所述愈伤组织诱导培养基A中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10 ～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，进行愈伤组织诱导；

Ⅱ、以[h2] 6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5～2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1～1.0 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得丛苗发生及增殖培养基B；所述步骤Ⅰ愈伤组织诱导培养基A中的愈伤组织培养25～35 d待其增殖膨大至直径2～3cm后，将其切割为0.2～ 0.3 cm²，转接至所述丛苗发生及增殖培养基B中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养5d后愈伤组织生长明显，7 d后分化出大量芽点，30 d后生长为小而致密的簇状丛苗；

Ⅲ、以[h3] 6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5～2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1～1.0 mg/L、蔗糖30000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得增殖培养基C；将所述步骤Ⅱ所得的簇状丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养15 d，得既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗作为生根[h4] 进行转接，较小丛苗可继续增殖培养；

Ⅳ、以[h5] 萘乙酸NAA 0.1～0.5 mg/L，吲哚丁酸IBA 0.1～0.5 mg/L、活性炭AC0.5～1.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得生根培养基D；选取所述步骤Ⅲ所得簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗接种于所述生根培养基D中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后得苗壮根粗的生根苗；

Ⅴ、取所述步骤Ⅳ所得6～8 cm高的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将所述幼苗上残留培养基清洗干净，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒2～3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18～25℃的温度漂浮培养60 d后，得移栽苗。

进一步，本发明所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B与所述步骤Ⅲ增殖培养基C轮流使用进行继代培养，即所述步骤Ⅲ得到的簇状转接丛苗中的较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中，依照所述步骤Ⅱ的条件培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根[h6] 接种于所述生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根[h7] 接种于所述生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗再次切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中继续增殖培养，如此循环进行，每一代培养15 d后均可得正常、健壮的簇状转接丛苗，之后继续进行所述步骤Ⅳ、Ⅴ的工艺，最后得生根苗。

本发明的有益效果：由于使用了以上所述技术方案，本发明具有以下优点：

1、解决了玛咖杂交种种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致杂种优势、优良性状丧失的难题；通过本发明所述技术，可使杂交种具遗传特性的杂种优势及优良性状得以固定和保持，且所有种苗具有相同基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为玛咖的育种及杂交种的大面积推广种植提供统一标准的优良种苗；

2、丛苗发生及增殖培养基B和增殖培养基C轮流使用进行增殖继代，解决了玛咖体外快速繁殖中易出现的老化、黄苗现象，提高了种苗质量；

3、实现了高效快繁的目的，15 d为一个培养周期，繁殖系数可达8.0以上；

4、用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。

附图说明

图1为愈伤组织培养7 d后开始分化出的不定芽点；

图2 为愈伤组织培养30 d后的簇状丛苗；

图3为培养基B、C循环培养后任何一代培养15 d的增殖苗；

图4 为在生根培养基D中培养25 d的生根苗；

图5为试管苗根系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述玛咖杂交种的无性快速繁殖方法包括以下步骤：

（1）玛咖杂交种外植体的选择、处理

（2）接种、培养

Ⅰ、以[h8] 玉米素ZT 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 0.01～0.1 mg/L、蔗糖 20000mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得愈伤组织诱导培养基A；将所述步骤（1）选取的消毒灭菌玛咖杂交种外植体接种于所述愈伤组织诱导培养基A中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10 ～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，进行愈伤组织诱导；

Ⅱ、以[h9] 6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5～2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1～1.0 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得丛苗发生和及增殖培养基B；所述步骤Ⅰ愈伤组织诱导培养基A中的愈伤组织培养25～35 d待其增殖膨大至直径2～3cm后，将其切割为0.2～0.3cm²，转接至所述丛苗发生及增殖培养基B中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养5 d后愈伤组织生长明显，7 d后分化出大量芽点，30 d后生长为小而致密的簇状丛苗；

Ⅲ、以[h10] 附加6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0～2.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5～2.0 mg/L、玉米素ZT 0.1～1.0 mg/L、蔗糖30000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得增殖培养基C；将所述步骤Ⅱ所得的簇状丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养15 d，得既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗作为生根[h11] 进行转接，较小丛苗可继续增殖培养；

Ⅳ、以[h12] 附加萘乙酸NAA 0.1～0.5 mg/L，吲哚丁酸IBA 0.1～0.5 mg/L、活性炭AC 0.5～1.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得生根培养基D；选取所述步骤Ⅲ所得簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗接种于所述生根培养基D中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后得苗壮根粗的生根苗；

进一步，本发明所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B与所述步骤Ⅲ增殖培养基C轮流使用进行继代培养，即所述步骤Ⅲ得到的簇状转接丛苗中的较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中，依照所述步骤Ⅱ的条件培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根[h13] 接种于所述生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根[h14] 接种于所述生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗再次切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中继续增殖培养，如此循环进行，每一代培养15 d后均可得正常、健壮的簇状转接丛苗，之后继续进行所述步骤Ⅳ、Ⅴ的工艺，最后得生根苗。

实施例一：

1、玛咖杂交种外植体的获取

选择生长势好、无病虫害、无畸形的玛咖杂交种健壮植株，晴天下午取其幼嫩花序，这时植株表面洁净并干燥，细菌及真菌含量低；将所取幼嫩花序先用自来水清洗表面的不洁物和灰尘，再放到流水下冲洗2 h后，置于超净工作台上，用灼烧过的镊子将幼嬾花序从烧杯内逐一取出，投入到体积比为75％的酒精中消毒15 s，再用0.1％HgCl₂（升汞）（质量比）灭菌5 min，最后用无菌水冲洗8次，去除幼嬾花序上残留的升汞，之后放在无菌滤纸上吸干表面水分；在整个消毒过程中充分摇动器皿；

2、愈伤组织诱导将所述步骤1选取的幼嫩花序接种于下列愈伤组织诱导培养基A中，

B₅基本培养液

米素ZT 1.5mg/L

萘乙酸NAA 0.05 mg/L

蔗糖 20000 mg/L

琼脂粉 4800 mg/L

pH 5.6

在光照度1500～2000 lx，光照时间10 h/d，温度控制在20±1℃的条件下，进行愈伤组织诱导；培养10 d后即有质地紧密、白色愈伤组织产生；

3、愈伤组织在所述步骤2愈伤组织诱导培养基A中培养30 d，待其增殖膨大至直径2～3cm后，将其切割为0.5 cm × 0.5cm，转接至下列丛苗发生及增殖培养基B中，

B₅基本培养液

6-苄胺基嘌呤6-BA 2.0 mg/L

萘乙酸NAA 2. 0 mg/L

玉米素ZT 0.5 mg/L

蔗糖 20000 mg/L

琼脂粉 4800 mg/L

pH 5.6

在光照度1500～2000 lx、光照时间10 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养5d后愈伤组织生长明显，7 d后分化出大量芽点（见图1），30 d后生长为簇状丛苗（见图2）；

4、将所述步骤3所得的簇状丛苗切割成3～5苗一丛转接入下列增殖培养基C中，

MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤6-BA 2.0 mg/L

萘乙酸NAA 2. 0 mg/L

玉米素ZT 0.5 mg/L

蔗糖 30000 mg/L

琼脂粉 4800 mg/L

pH 5.6

在光照度1500～2000 lx、光照时间10 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养15d，得既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗作为生根[h15] 进行转接，较小丛苗可继续增殖培养；

5、选取所述步骤4得到的簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗接种于下列生根培养基D中，

1/2MS基本培养液

萘乙酸NAA 0.1mg/L

吲哚丁酸IBA 0.2mg/L

活性炭AC 1.0 mg/L

蔗糖 15000 mg/L

琼脂粉 4800 mg/L

pH 5.6

在光照度1500～2000 lx、光照时间10 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养25d后得苗壮根粗的生根苗；

6、取所述步骤5约6～8 cm高的生根植株，连培养瓶置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒2～3 min后，移栽至装有消毒后的腐殖质的漂浮盘中，保持18～25℃的温度漂浮培养60 d后，即得移栽苗，成活率可达100%。

实施例二：

1、玛咖杂交种外植体的获取本实施例所述玛咖杂交种外植体的获取及处理同实施例一。

2、愈伤组织诱导所述愈伤组织诱导培养基A的成分为：B₅基本培养液、玉米素ZT1.0mg/L、萘乙酸NAA 0.1mg/L、蔗糖20000 mg/L、琼脂粉4800 mg/L、pH 5.4；培养方法及其他要求同实施例一。

3、所述丛苗发生及增殖培养基B的成分为：B₅基本培养液、6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0mg/L、萘乙酸NAA 1.5 mg/L、玉米素ZT 0.1mg/L、蔗糖20000 mg/L、琼脂4800 mg/L、pH 5.4；培养方法及其他要求同实施例一。

4、所述增殖培养基C的成分为：MS基本培养液、6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0 mg/L、萘乙酸NAA 1.5mg/L、玉米素ZT 1.0 mg/L、蔗糖30000 mg/L、琼脂粉4800 mg/L、pH 5.8；其余同实施例一；簇状丛苗在增殖培养基C里培养15 d后得到既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗直接进行生根[h16] ，所述簇状转接丛苗中较小的丛苗切割成3～5苗一丛转接入新鲜的丛苗发生及增殖培养基B中，依照实施例一的条件培养15 d后，也得到簇状转接丛苗，主苗仍然作为生根[h17] 进行转接，较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中培养15 d后，又得到簇状转接丛苗，主苗继续作为生根[h18] 转接，较小丛苗再次切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中继续增殖培养，如此循环进行，每一代培养15 d后均可得正常、健壮的簇状转接丛苗。

5、所述生根培养基D的成分为：1/2MS基本培养液、萘乙酸NAA 0.5mg/L、吲哚丁酸IBA 0.5mg/L、活性炭AC 0.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L、琼脂4800 mg/L、pH 5.4；选取所述步骤4来自于丛苗发生及增殖培养基B或增殖培养基C中的簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗作为转接苗接种于所述生根培养基D中，依照实施例一的条件培养25 d后得苗壮根粗的生根苗。

培养基C中循环培养3代后（每代均15 d）会出现严重的老化黄苗现象，增殖继代时间不易掌握，影响丛苗质量和繁殖系数；我们做了很多试验来解决这个问题，结果发现，在所述步骤Ⅲ增殖培养基C中培养1代、2代或3代中的任何一代后，转接至所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B中培养15 d后，老化黄苗现象明显得以改善，但如果继续在所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B培养，又会出现老化黄苗现象，而再转入所述步骤Ⅲ增殖培养基C中培养一代，情况又得以改善，所以采用B、C这两种培养基轮流培养的方法得以彻底解决老化黄苗问题。[h19]

实施例三：本实施例玛咖杂交种外植体的获取、培养方法、步骤及培养条件均与实施例二相同，各培养基成分有所不同，具体如下：

（1）愈伤组织诱导培养基A：B₅基本培养液、米素ZT 2.0mg/L、萘乙酸NAA 0.01mg/L、蔗糖20000 mg/L琼脂4800 mg/L、pH 5.8；

（2）丛苗发生及增殖培养基B：B₅基本培养液、6-苄胺基嘌呤6-BA 1.5mg/L、萘乙酸NAA 1. 8 mg/L、玉米素ZT 1.0mg/L、蔗糖20000 mg/L、琼脂粉4800 mg/L、pH 5.8；

（3）培养基C：MS基本培养液、6-苄胺基嘌呤6-BA 1.5 mg/L、萘乙酸NAA 1.8 mg/L、玉米素ZT 0.1 mg/L、蔗糖30000 mg/L、琼脂粉4800 mg/L、pH 5.8；

（4）生根培养基D：1/2MS基本培养液、萘乙酸NAA 0.3mg/L、吲哚丁酸IBA 0.1mg/L、活性炭AC 1.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L、琼脂粉4800 mg/L、pH 5.8。

本发明对玛咖杂交种无性种苗生产工艺进行了优化调整，在获得愈伤组织及丛芽后，增殖培养采用高NH₄ ⁺的MS和低NH₄ ⁺的B₅为基本培养基交替使用，彻底解决了玛咖试管苗易老化、黄苗现象，并将玛咖杂交种无性繁殖周期缩短为15 d，大大提高了繁殖效率。

杂交种繁殖最为困难的就是如何在后代中维系其杂种优势，因为有性生殖后由于多基因的分离与自由组合，杂交种的优良性状会迅速消失。本发明通过组织培养无性固定杂交种的杂种优势，且[h20] 根本上解决了玛咖体外快繁即组织培养中极为常见的玻璃化现象。本发明所提供的方法能完全固定玛咖杂交种所表现出的杂种优势，避免了来源于有性生殖种子苗的性状分离，为玛咖杂交种F₁代优质种苗繁育提供了有效途径。

以上仅为本发明的部分实施方式，本领域技术人员看过以上所述说明书内容，可知本发明所述技术方案可有多种实施方式，只要使用了以上所述技术方案，均应落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种玛咖杂交种的无性快速繁殖方法，其特征在于，所述繁殖方法包括以下步骤：

（1）玛咖杂交种外植体的选择、处理

选择生长健壮的杂交种植株的幼嫩花序作为玛咖杂交种外植体，用自来水清洗所述幼嫩花序表面的不洁物后，放入烧杯中，用细纱布扎紧烧杯口，于自来水下流水冲洗2 h，置于超净工作台上，用灼烧过的镊子将幼嫩花序从烧杯内逐一取出，投入到体积比为75％的酒精中消毒15 s，再用质量比为0.1％的 HgCl₂灭菌5 min，最后用无菌水冲洗6-8次，去除幼嫩花序上残留的升汞，之后放在无菌滤纸上吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的外植体；

（2）接种、培养

Ⅰ、以B₅为基本培养基，附加玉米素1.0～2.0 mg/L、萘乙酸0.01～0.1 mg/L、蔗糖 20000mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得愈伤组织诱导培养基A；将所述步骤（1）选取的消毒灭菌玛咖杂交种外植体接种于所述愈伤组织诱导培养基A中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，进行愈伤组织诱导；

Ⅱ、以B₅为基本培养基，附加6-苄氨基嘌呤1.0～2.0 mg/L、萘乙酸1.5～2.0 mg/L、玉米素0.1～1.0 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得丛苗发生及增殖培养基B；所述步骤Ⅰ愈伤组织诱导培养基A中的愈伤组织培养25～35 d待其增殖膨大至直径2～3cm后，将其切割为0.2～0.3cm²，转接至所述丛苗发生及增殖培养基B中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养5 d后愈伤组织生长明显，7 d后分化出大量芽点，30 d后生长为小而致密的簇状丛苗；

Ⅲ、以MS为基本培养基，附加6-苄氨基嘌呤1.0～2.0 mg/L、萘乙酸1.5～2.0 mg/L、玉米素0.1～1.0 mg/L、蔗糖30000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得增殖培养基C；将所述步骤Ⅱ所得的簇状丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养15 d，得既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗进行转接，较小丛苗可继续增殖培养；

Ⅳ、所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B与所述步骤Ⅲ增殖培养基C轮流使用进行继代培养，即所述步骤Ⅲ得到的簇状转接丛苗中的较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中，依照所述步骤Ⅱ的条件培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗接种于生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述步骤Ⅲ增殖培养基C中培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗接种于生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗再次切割成3～5苗一丛转接入所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B中继续增殖培养，如此循环进行，每一代培养15 d后均可得正常、健壮的簇状转接丛苗，之后继续进行所述步骤Ⅴ、VI的工艺；

Ⅴ、以1/2MS为基本培养基，附加萘乙酸0.1～0.5 mg/L，吲哚丁酸0.1～0.5 mg/L、活性炭0.5～1.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得生根培养基D；选取所述步骤Ⅲ或步骤Ⅳ所得簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗接种于所述生根培养基D中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后得苗壮根粗的生根苗；

VI、取所述步骤Ⅴ所得6～8 cm高的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将所述幼苗上残留培养基清洗干净，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒2～3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18～25℃的温度漂浮培养60 d后，得移栽苗。