CN105230497B - 一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属植物组培技术领域，涉及一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法，是取开花后170～190d发育时期的油茶果实幼胚子叶作为外植体，经脱分化诱导出结节胚性组织、增殖培养、再分化培养得到体细胞胚，将体细胞胚转接至植株再生诱导培养基上诱导得到具健壮胚芽和主根的体细胞胚再生植株。本发明利用组织培养，选择花后180d油茶果发育时期的种子未成熟胚子叶为外植体进行油茶组培快繁，建立一整套经体细胞胚发生途径获得油茶再生植株的体系，为海南地区白花油茶工厂化育苗提供技术依据，并为海南地区白花油茶的基因工程改良奠定了材料和技术基础。

Description

一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法

技术领域

本发明属植物组培技术领域，涉及一种组培苗的生产方法，具体是一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法。

背景技术

油茶(Camellia oleifera)又名茶子树、油茶树，为常绿小乔木或灌木，分布于我国海南、福建、湖南、江西、广西等省区，与橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，是我国特有的油料植物资源，也是海南省传统的油料经济作物。油茶种子榨取的茶油色清味香，是优质的食用油，具“东方橄榄油”美称。尤其是海南省得天独厚的绿色生态环境，使得海南茶油气味和滋味香醇浓厚、疗效显著，享誉国内外。茶油还可作为润滑油、防锈油用于机械工业；茶饼既是农药，又是肥料，可提高农田蓄水能力和防治稻田害虫；果皮是提制栲胶的原料；叶部含有花黄素、茶碱等，可做医药工业的原料。另外，油茶树不但具生态保护功能，而且油茶花色洁白或艳丽，花期又长，为海南国际旅游岛旅游增色，与海南绿色宝岛的生态环境相辅相成。因而，油茶树的经济、观赏和生态价值极高，对发展海南绿色农业具有重要的作用。

目前，海南油茶种植业正在快速发展，但由于油茶生长周期长，从开花至果实成熟历时一年半，且经实验证明，油茶杂交难度大，成功率低，令油茶品种的改良效率低，全国油茶适生区已陆续有油茶优良品种，但依然稀缺。由于海南省油茶种质资源调查、优株筛选、采穗圃建立和育种等研究工作近两年才开始，至今尚无适应本土生长的本省油茶优良品种、优株采穗圃等。相应的优株种子实生苗、嫁接苗和优质组培苗稀缺，而引进的外省优良品种苗木却因海南省独特的地理环境和天气，在海南本土种植时引起“水土不服”，导致生长、结果皆不理想。在国家政策扶持下，全国油茶适生地掀起发展油茶种植业热潮，海南省部分种植户受海南本地油茶优株种籽量少、缺乏嫁接苗等不良因素的影响，在更新衰退老油茶林以及新建油茶林时，种苗大多数采用油茶实生苗和扦插苗。由于本地优株数量有限，种植户选用良莠不齐的种子，造成育苗后代个体间性状分离，不能获得品质一致的育苗产品，造成油茶种植后开花、挂果期不一致，肥水管理麻烦，产量也高低不一，整体生产普遍低效。另外，油茶扦插苗虽然保持母株的优良基因，且苗木生长迅速，挂果快，但扦插苗植株不定根根系浅，易早衰，油茶林衰退严重。尤其是海南省属热带季风气候区，受季风环流的影响，台风是海南省最严重和普遍的自然灾害，平均每年直接登陆或影响该省的台风达8-9个，且主要集中在7-10月份。每次海南油茶适生区台风登陆过后，油茶林不但出现生理性落花、落果现象，更为严重的是，用扦插苗种植的油茶林，因为扦插苗无主根，根系不发达，种植的油茶植株出现不同程度的倾倒，加上扦插苗本身生长势比较弱、容易早衰，严重的甚至造成油茶植株死亡，台风对扦插苗种植的油茶植株造成的二次伤害给油茶种植户造成重大损失。

还有，与其他油茶产区省份相比，海南省油茶的种质资源收集和保存、育种和研究工作起步较晚，很多本土高产或抗风的优质油茶资源却因扩大经济开发用地等人为因素正面临丢失的危急。另外，每年的5-9月是海南油茶的果实膨大期，恰逢台风和暴风雨频繁月份，花期和结果期的落花落果使得海南白花油茶杂交育种困难重重，有些杂种胚在未成熟前就因遭受风雨肆虐而提前落果夭折。

组织培养技术是植物快速繁殖、创造优良品种的一种行之有效的方法，经生产验证，组培苗在长势、抗性、结果、产量和质量等方面均得到大幅度提高。当前制约海南省油茶产业健康、稳进地发展的关键因素是匮乏改造现有低劣茶林和新建优良油茶林所需的大批量适应本土生长的良种壮苗，通过生产油茶组培苗来提供油茶优良种苗是解决海南油茶优质种苗匮乏的有效方法。

油茶在全国各地品种繁多，由于不同地区的生态环境、不同品种的生长习性的不同，不同地区、不同品种的油茶离体培养的培养基组成差别大。20世纪80年代以来，国内外对油茶组织培养相关的研究从未中断过。早在1980年，隆振雄就利用油茶幼胚胚状体诱导出不定芽和不定根，但未获得健壮的再生植株；1982年，卢天玲研究了油茶未成熟子叶与幼胚离体培养分化成苗的过程，证明了油茶体细胞具有强烈的脱分化与再分化能；2004年，毕方铖研究了离体条件下带芽的茎段、幼胚、子叶的愈伤组织的形成和植株再生技术，为油茶快繁提供了新的途径；张智俊等以子叶为外植体诱导获得组培苗，但前皆以湖南、广西地区的油茶作为研究对象，不同省份和地区的油茶组培适宜基本培养基也涉及到MS、White、WPM和N₆等不同配方，可见因为油茶生长区域的不同，气候土壤条件差异大，其离体培养的基本培养基和培养条件也因地而异。经检索，对海南区域种植的白花油茶研究报导鲜见。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法，利用组织培养技术，选择合适的外植体进行油茶组培快繁以生产油茶组培苗木，为海南油茶生产提供充足的良种壮苗，也为开展油茶植株再生的发生及其调控机制以及再生植株遗传与变异的研究，为后期的油茶功能基因研究以及利用基因工程定向培育高产、优质、高抗油茶新品种做技术保障和储备。

本发明所采用的技术方案：

一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法，包括外植体选择、初代培养(脱分化诱导胚性愈伤组织和不定芽)、继代培养(增殖和再分化)和植株再生(体细胞胚成熟诱导和植株再生)的过程，其具体过程如下：

1、外植体选择

取开花后170～190d发育时期的油茶果实进行消毒后解剖刀切开，剖开胚乳，夹取幼胚子叶，切成薄片，备用。选用油茶种子未成熟胚子叶作为外植体，其外面有果皮、种皮和胚乳包被保护，处于无菌状态，有效降低了因外植体消毒不彻底而使培养物遭受污染的机率。

2、初代培养

将胚子叶薄片平铺接种在初代培养基上诱导培养，培养温度23～27℃，每天光照13～16h，光照强度为1500～2000lx。每25d继代一次，直至外植体脱分化诱导出结节胚性愈伤组织。一般诱导培养约第70d即可诱导出结节胚性愈伤组织。所述初代培养基是以改良MS作为基本培养基，并添加Kt 2.0mg·L^-1、NAA0.2mg·L^-1、Zt 5.0mg·L^-1(Zt为过滤灭菌)、椰汁5％、蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5。根据诱导培养结果，筛选优化出适宜的外植体。

3、继代培养

将适宜外植体诱导出的结节胚性组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，诱导胚性愈伤组织增殖，每25d继代一次，30～40d增殖系数约4.7～5.0；将增殖后的胚性组织转接到再分化培养基上诱导体细胞胚发生，40～50d后即可再分化出体细胞胚，子叶形体细胞胚再分化率约75％。所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 1.0～2.0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、椰汁10％、蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5。所述再分化培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 0.7mg·L^-1、NAA 0.1mg·L^-1、ABA 0.05mg·L^-1、椰汁10％、水解酪蛋白400mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、植物凝胶2.3g·L^-1和0.1％活性炭，pH5.5。

4、植株再生

待子叶形体细胞胚成熟后，单独剔剥下来，转接至植株再生诱导培养基上诱导植株再生，30～40d后形成具健壮胚芽和主根的体细胞胚再生植株。所述植株再生诱导培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 0.35mg·L^-1、NAA 0.05mg·L^-1、水解酪蛋白200mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、植物凝胶2.3g·L^-1和0.1％活性炭，pH5.5。

所述改良MS是将大量元素降低至2/3，并将MS的有机成份改成B₅有机成份(海南地区典型土壤为赤红壤，矿质养分较贫乏，有机质含量低，土壤偏酸，针对土壤的理化特性，本发明将大量元素降低至2/3，并将MS有机成份改成B₅有机成份)。

本发明利用组织培养，选择花后180d油茶果发育时期的种子未成熟胚子叶为外植体进行油茶组培快繁，建立一整套经体细胞胚发生途径获得油茶再生植株的体系，为海南地区白花油茶工厂化育苗提供技术依据，并为海南地区白花油茶的基因工程改良奠定了材料和技术基础。

附图说明

图1为海南白花油茶不同果实发育时期未成熟胚诱导情况。

A.开花后约60d未成熟胚诱导情况 B.开花后约120d青果幼胚诱导情况C.开花后约180d中果幼胚诱导情况 D.开花后约270d未成熟胚诱导情况。

图2为开花后约180d中果幼胚子叶诱导、增殖与再分化情况。

A.幼胚子叶脱分化诱导结节胚性组织 B.结节胚性组织的增殖 C.胚性组织再分化 D.再分化出的体细胞胚 E.具胚芽胚根的成熟体细胞胚 F.胚性组织经体细胞胚发生途径形成再生植株。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一、外植体的选择

试验从2013年10至2015年4月，所用的油茶外植体以琼海市会山镇中酒村白花油茶优株“油茶王”树开花后60d、120d、180d和270d的油茶果实的未成熟胚作为外植体进行诱导培养，每种外植体接种20个，3次重复取平均值。诱导培养35d时统计胚萌发率和诱导生长情况，150d时统计诱导结果。效果见图1，试验数据见表1。通过比较油茶果不同发育时期的未成熟胚诱导培养的结果，来确定开花后约180d发育时期的油茶种子未成熟胚子叶适宜作为诱导胚性组织和不定芽的合适外植体。

表1 油茶果不同发育时期对未成熟胚诱导培养的影响

注：表中同一列数字后不同小写字母间表示差异达显著水平(p＝0.05)。诱导结果类型：I愈伤组织，II不定丛芽，III结节胚性组织。所用培养基为预实验后的改良MS+Kt2.0mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+Zt 5.0mg·L^-1+椰汁5％+蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5。

实施例二、幼胚子叶诱导、增殖与再分化

1、取开花后170～190d发育时期的油茶果实用70％酒精浸泡1min，无菌水冲洗1遍，然后0.1％HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗5遍。用解剖刀切开果实，剖开胚乳，夹取幼胚子叶，用解剖刀切成2mm×1mm×0.5mm薄片，备用。

2、将胚子叶薄片平铺接种在初代培养基(改良MS+Kt 2.0mg·L^-1+NAA 0.2mg·L^-1+Zt 5.0mg·L^-1+椰汁5％+蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5)上诱导培养，培养温度23～27℃，每天光照13-16h，光照强度为1500～2000lx。每25d继代一次，诱导培养约第70d即可诱导出结节胚性组织(图2A)。

3、将结节胚性组织接种到增殖培养基(改良MS+Kt 1.0～2.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+椰汁10％+蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5)上进行增殖培养，诱导胚性组织增殖，每25d继代一次，30～40d增殖系数约4.7～5.0(图2B)。

不同增殖培养基条件下，诱导培养每25d继代和统计增殖结果，每块结节块含三个瘤状胚性组织，每瓶3块，每个处理接10瓶，三次重复取平均值。筛选优化出胚性组织增殖的适宜培养基，结果见表2。

表2 结节胚性组织的增殖情况

注：表中同一列数字后不同小写字母间表示差异达显著水平(p＝0.05)。

将增殖后的胚性组织转接到再分化培养基(改良MS+Kt 0.7mg·L^-1+NAA 0.1mg·L^-1+ABA 0.05mg·L^-1+椰汁10％+水解酪蛋白400mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+植物凝胶2.3g·L^-1+0.1％活性炭，pH5.5)上诱导体细胞胚发生，40～50d后即可再分化出体细胞胚，子叶形体细胞胚再分化率约75％(图2C、D、E)。

不同再分化培养基条件下，诱导培养50d时统计再分化结果，每块结节块含三个瘤状胚性组织，每瓶3块，每个处理接10瓶，三次重复取平均值。筛选优化出胚性组织再分化的适宜培养基，结果见表3。

表3 结节胚性组织的再分化情况

注：表中同一列数字后不同小写字母间表示差异达显著水平(p＝0.05)。

4、待子叶形体细胞胚成熟后，单独剔剥下来，转接至植株再生诱导培养基(改良MS+Kt 0.35mg·L^-1+NAA 0.05mg·L^-1+水解酪蛋白200mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+植物凝胶2.3g·L^-1+0.1％活性炭，pH5.5)上诱导植株再生，30～40d后形成具健壮胚芽和主根的体细胞胚再生植株(图2F)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种海南地区白花油茶组培苗的生产方法，其特征在于，包括外植体选择、初代培养、继代培养和植株再生的过程，其具体过程如下：

1)、外植体选择

取开花后170～190d发育时期的油茶果实进行消毒后解剖刀切开，剖开胚乳，夹取幼胚子叶，切成薄片，备用；

2)、初代培养

将胚子叶薄片平铺接种在初代培养基上诱导培养，培养温度23～27℃，每天光照13～16h，光照强度为1500～2000lx；每25d继代一次，直至外植体脱分化诱导出结节胚性愈伤组织；所述初代培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 2.0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、Zt5.0mg·L^-1、椰汁5％、蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH5.5；

3)、继代培养

将结节胚性愈伤组织接种到增殖培养基上进行增殖培养，诱导胚性组织增殖，每25d继代一次，30～40d增殖系数4.7～5.0；将增殖后的胚性组织转接到再分化培养基上诱导体细胞胚发生，40～50d后即可再分化出体细胞胚；所述增殖培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 1.0～2.0mg·L^-1、NAA 0.2mg·L^-1、椰汁10％、蔗糖30g·L^-1和植物凝胶2.2g·L^-1，pH 5.5；所述再分化培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 0.7mg·L^-1、NAA0.1mg·L^-1、ABA 0.05mg·L^-1、椰汁10％、水解酪蛋白400mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、植物凝胶2.3g·L^-1和0.1％活性炭，pH5.5；

4)、植株再生

待子叶形体细胞胚成熟后，单独剔剥下来，转接至植株再生诱导培养基上诱导植株再生，30～40d后形成具健壮胚芽和主根的体细胞胚再生植株；所述植株再生诱导培养基是以改良MS为基本培养基，并添加Kt 0.35mg·L^-1、NAA0.05mg·L^-1、水解酪蛋白200mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、植物凝胶2.3g·L^-1和0.1％活性炭，pH 5.5；

所述改良MS是将大量元素降低至2/3，并将MS的有机成份改成B₅有机成份。