CN105918133B - 猪血木组织培养快速繁育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括外植体选择与消毒、从生芽诱导、丛生芽增殖、生根培养、壮苗培养和苗床培养等步骤。与猪血木传统育苗方法相比，本发明的方法不采用猪血木种子，而是利用猪血木当年生新梢育苗，其所需植株原料少，可短时大量繁殖，品种遗传变异小，幼苗品质好，幼苗成活率高达90％，移栽苗成活率高达80％，且移栽后，苗木长势好，无“小老头苗”现象产生，有效解决了猪血木野生资源日益减少，种群自然更新困难的问题，为猪血木这一珍稀濒危植物的有效保护提供了技术支持。

Description

猪血木组织培养快速繁育方法
技术领域
本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及一种猪血木组织培养快速繁育方法。
背景技术
猪血木(Euryodendron excelsum H.T.Chang)属于山茶科(Theaceae)猪血木属多年生木本植物，为我国特有单型属的珍稀濒危植物，已被列为国家二级保护植物。猪血木的系统学位置特殊，是研究山茶科系统发育和形态演化的重要材料，同时，其树干挺直，心材美观，木材极其坚硬，是优良的建筑用材和家具用材，具有一定的经济价值。目前，猪血木仅分布于广东省阳春县八甲镇地区，且仅残存一个居群，居群内个体数量仅100余株，其生长环境受人为干扰影响严重，自然种群面临灭绝的危险。
猪血木在自然状况下以有性繁殖为唯一繁殖方式，但其种子萌发和幼苗生长受环境影响严重，种群自然更新困难。通过人工繁育幼苗扩大种群数量并进行物种种群回归自然是对濒危物种进行有效保护的重要途径，但传统的播种育苗方法对种子需要量大，严重制约猪血木这一珍稀濒危物种的保护和大量繁殖，且传统育苗方法幼苗死亡率高达80％以上，生长极其缓慢或停止生长的“小老头苗”现象严重。组织培养是一种植株快速繁殖技术，其所需植株原材料少，不受生长季节限制，培养周期短，变异低，可保持母本的优良遗传特性，可用于拯救濒危植物，解决其无法短时大量繁殖的难题。但目前关于猪血木的组织培养研究还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种猪血木组织培养快速繁育方法，利用猪血木当年生新梢进行组织培养，获得猪血木幼苗，并将幼苗移栽到苗床中继续培养获得猪血木移栽苗，该繁育方法可有效提高猪血木的繁育系数，保留猪血木的优良遗传特性，幼苗成活率高达90％，移栽苗成活率高达80％，且移栽后，苗木长势好，无“小老头苗”现象产生，解决了猪血木野生资源日益减少，种群自然更新困难的问题，有利于猪血木这一珍稀濒危植物的有效保护。
本发明还有一个目的是提供一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端5-10cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗15-20min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗3-5次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将10-12重量份大蒜、7-9重量份柠檬草、6-8重量份代代、6-8重量份白千层、5-7重量份蓝桉和3-5重量份丁香粉碎至50-100目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取2-4h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.5-0.8cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于22-26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养28-30天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0-4.0mg/L ZT(玉米素)，1.0-1.5mg/L 6-KT(激动素)，1.5-2.0mg/L 2.4.5-T(2.4.5-三氯苯氧乙酸)，3-5g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为8-10h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有1-2个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于22-26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养28-30天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0-3.5mg/L ZT，1.0-1.5mg/L 6-KT，1.0-1.5mg/L NAA(α-萘乙酸)，4-6g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第二光照条件下培养时，光照强度1800-2000lux，光照时间为10-12h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根养基中，于26-28℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养18-20天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.0-1.5mg/L NAA，0.5-1.0mg/L IBA(吲哚丁酸)，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第三光照条件下培养时，光照强度2000-2200lux，光照时间为10-12h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养28-30天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.0-1.5mg/L NAA，1.0-1.5mg/L ZT，0.5-1.0mg/L多效唑，3-5g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第四光照条件下培养时，光照强度2000-2200lux，光照时间为10-12h/天，光照时培养温度为22-26℃，非光照时培养温度为16-20℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养5-6个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，苗床中培养时，培养温度为34-37℃、湿度为70-80％、阴蔽度为60-80％。
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体，其包括：
床架，其为上表面开口的中空长方体，其长为3-9m、宽为1-1.8m、高为15-20cm；所述床架的平行于长度方向的右侧面和与其相邻的前侧面、后侧面及底面可拆卸连接；所述右侧面的下方设有与竖直方向呈30-60°的向下倾斜的滑槽，所述滑槽与所述底面边缘固定连接；
喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头；
温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管；
自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板。
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述基质，其包括：
第一基质层，其由15-20重量份稻壳、10-12重量份锯末、5-8重量份草木灰和5-8重量份珍珠岩经高温灭菌制得，其厚度为6-8cm；
第二基质层，其位于所述第一基质层上方，其由20-25重量份黄壤土、15-20重量份废蜜液、10-15重量份豆渣、10-15重量份秸秆、5-10重量份厩肥和0.3-0.5份酵素菌经发酵制得，其厚度为8-10cm；
第三基质层，其位于所述第二基质层上方，其为厚度为1-2cm的表层腐殖土。
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述丛生芽诱导培养基中ZT浓度为3.5mg/L，6-KT浓度为1.2mg/L，2.4.5-T浓度为1.5mg/L，大豆肽浓度为4g/L，pH值为5.8；
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述增殖培养基中ZT浓度为3.2mg/L，6-KT浓度为1.2mg/L，NAA浓度为1.2mg/L，大豆肽浓度为5/L，pH值为5.8；
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述生根培养基中NAA浓度为1.2mg/L，IBA浓度为0.8mg/L，pH值为5.8。
优选的是，所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述壮苗培养基中NAA浓度为1.2mg/L，ZT浓度为1.2mg/L，多效唑浓度为0.8mg/L，活性炭浓度为4g/L，pH值为5.8。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、与猪血木传统育苗方法相比，本发明的方法不采用猪血木种子，而是利用猪血木当年生新梢育苗，其所需植株原料少，可短时大量繁殖，品种遗传变异小，幼苗品质好，幼苗成活率高达90％，移栽苗成活率高达80％，且移栽后，苗木长势好，无“小老头苗”现象产生，有效解决了猪血木野生资源日益减少，种群自然更新困难的问题，为猪血木这一珍稀濒危植物的有效保护提供了技术支持；
第二、利用天然消毒液对外植体进行消毒，可避免传统的酒精和升汞消毒法对外植体的损害，降低组织培养过程中产生畸形苗的概率；
第三、通过将ZT、6-KT和大豆肽以适宜比例加入MS培养基中制备丛生芽诱导培养基，ZT和6-KT组合，可刺激猪血木外植体内酶的活性，促进猪血木细胞的分裂和分化，大豆肽中的小分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分进一步促进了猪血木细胞的生长、繁殖，培养28-30天即可得到健壮的第一丛生芽；
第四、通过将ZT、6-KT、NAA和大豆肽以适宜的比例加入MS培养基中制备增殖培养基，可显著提高第一丛生芽的增殖效果，增殖系数高，平均增殖系数达4.9；
第五、通过将NAA和IBA以适宜的比例加入3/4MS培养基中制备生根培养基，可刺激第二丛生芽基部的细胞分裂，诱导生根，生根率高达98％，且根系发达；
第六、通过将NAA、ZT、多效唑和活性炭以适宜的比例加入MS培养基中制备壮苗培养基，NAA，ZT和多效唑可有效促进植株根系和茎叶的生长或伸展，活性炭的加入，可使生长调节剂NAA、ZT和多效唑在壮苗培养过程中缓慢释放，使植株在壮苗培养期内均健壮生长；
第七、通过床体自动控制系统将苗床的温度和湿度控制在适宜范围，可避免传统大棚培养中温湿度控制不均的问题，提高幼苗的成活率，避免“小老头苗”的产生；
第八、根据猪血木幼苗的生长特点和营养需要配制专用的培养基质，基质中的第一基质层由稻壳、锯末、草木灰和珍珠岩经杀菌制得，其疏松通气，吸水保水且不含病原菌；第二基质层由黄壤土、废蜜液、豆渣、秸秆、厩肥和酵素菌经发酵制得，其可为幼苗生长提供丰富的易于吸收的营养，发酵还可使第二基质层中产生大量的有益细菌，可增强幼苗的抗病虫害能力；第三基质层为表层腐殖土，可为幼苗生长提供一定营养并减缓第二基质层中养分和水分的散失，确保幼苗在其上长势好，无病虫害，所得移栽苗健壮，将其进行野外移栽后，成活率高，长势好。
本发明的其他优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明床体的结构示意图。
其中，1、床架；11、右侧面；12、前侧面；13、后侧面；14、底面；15、滑槽；2、进水管；3、旋转喷头；4、热交换管；5、温湿度传感器；6、控制面板。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
实施例1：
一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端5cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗15min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗3次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将10重量份大蒜、7重量份柠檬草、6重量份代代、6重量份白千层、5重量份蓝桉和3重量份丁香粉碎至50目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取2h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.5cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于22℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养28天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0mg/L ZT，1.0mg/L6-KT，1.5mg/L 2.4.5-T，3g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.5；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为8h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有1个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于22℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养28天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0mg/L ZT，1.0mg/L 6-KT，1.0mg/L NAA，4g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.5；
第二光照条件下培养时，光照强度1800lux，光照时间为10h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根养基中，于26℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养18天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.0mg/L NAA，0.5mg/LIBA，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5；
第三光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为10h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养28天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.0mg/L NAA，1.0mg/L ZT，0.5mg/L多效唑，3g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5；
第四光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为10h/天，光照时培养温度为22℃，非光照时培养温度为16℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养5个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，苗床中培养时，培养温度为34℃、湿度为70％、阴蔽度为60％。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体如图1所示，其包括：
床架1，其为上表面开口的中空长方体，其长为3m、宽为1m、高为15cm；所述床架1的平行于长度方向的右侧面11和与其相邻的前侧面12、后侧面13及底面14可拆卸连接；所述右侧面11的下方设有与竖直方向呈60°的向下倾斜的滑槽15，所述滑槽15与所述底面14边缘固定连接；喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管2和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头3；温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管4；自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器5和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板6。
所述床架自动控温控湿的工作原理为，温湿度传感器将采集到的温湿度信息传递给控制面板，控制面板通过比对程序与设定值进行对比，当测定值与设定值不相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置工作，直至测定值与设定值相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置停止工作。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述基质，其包括：
第一基质层，其由15重量份稻壳、10重量份锯末、5重量份草木灰和5重量份珍珠岩经高温灭菌制得，其厚度为6cm；
第二基质层，其位于所述第一基质层上方，其由20重量份黄壤土、15重量份废蜜液、10重量份豆渣、10重量份秸秆、5重量份厩肥和0.3份酵素菌经发酵制得，其厚度为8cm；
第三基质层，其位于所述第二基质层上方，其为厚度为1cm的表层腐殖土。
实施例2：
一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端8cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗18min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗4次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将11重量份大蒜、8重量份柠檬草、7重量份代代、7重量份白千层、6重量份蓝桉和4重量份丁香粉碎至80目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取3h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.6cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于24℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养29天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.5mg/L ZT，1.2mg/L6-KT，1.5mg/L 2.4.5-T，4g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.8；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为9h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有2个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于24℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养29天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.2mg/L ZT，1.2mg/L 6-KT，1.2mg/L NAA，5g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8；
第二光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为11h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根养基中，于27℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养19天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.2mg/L NAA，0.8mg/LIBA，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；
第三光照条件下培养时，光照强度2100lux，光照时间为11h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养29天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.2mg/L NAA，1.2mg/L ZT，0.8mg/L多效唑，4g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；
第四光照条件下培养时，光照强度2100lux，光照时间为11h/天，光照时培养温度为24℃，非光照时培养温度为18℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养5.5个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，苗床中培养时，培养温度为36℃、湿度为75％、阴蔽度为70％。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体如图1所示，其包括：
床架1，其为上表面开口的中空长方体，其长为6m、宽为1.4m、高为18cm；所述床架1的平行于长度方向的右侧面11和与其相邻的前侧面12、后侧面13及底面14可拆卸连接；所述右侧面11的下方设有与竖直方向呈60°的向下倾斜的滑槽15，所述滑槽15与所述底面14边缘固定连接；喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管2和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头3；温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管4；自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器5和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板6。
所述床架自动控温控湿的工作原理为，温湿度传感器将采集到的温湿度信息传递给控制面板，控制面板通过比对程序与设定值进行对比，当测定值与设定值不相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置工作，直至测定值与设定值相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置停止工作。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述基质，其包括：
第一基质层，其由18重量份稻壳、11重量份锯末、6重量份草木灰和6重量份珍珠岩经高温灭菌制得，其厚度为7cm；
第二基质层，其位于所述第一基质层上方，其由23重量份黄壤土、17重量份废蜜液、12重量份豆渣、12重量份秸秆、8重量份厩肥和0.4份酵素菌经发酵制得，其厚度为9cm；
第三基质层，其位于所述第二基质层上方，其为厚度为2cm的表层腐殖土。
实施例3：
一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端10cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗20min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗5次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将12重量份大蒜、9重量份柠檬草、8重量份代代、8重量份白千层、7重量份蓝桉和5重量份丁香粉碎至100目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取4h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.8cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养30天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括4.0mg/L ZT，1.5mg/L6-KT，2.0mg/L 2.4.5-T，5g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.8；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为10h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有2个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养30天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.5mg/L ZT，1.5mg/L 6-KT，1.5mg/L NAA，6g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8；
第二光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为12h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根养基中，于28℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养20天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L NAA，1.0mg/LIBA，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；
第三光照条件下培养时，光照强度2200lux，光照时间为12h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养30天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L NAA，1.5mg/L ZT，1.0mg/L多效唑，5g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.8；
第四光照条件下培养时，光照强度2200lux，光照时间为12h/天，光照时培养温度为26℃，非光照时培养温度为20℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养6个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，苗床中培养时，培养温度为37℃、湿度为80％、阴蔽度为80％。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体如图1所示，其包括：
床架1，其为上表面开口的中空长方体，其长为9m、宽为1.8m、高为20cm；所述床架1的平行于长度方向的右侧面11和与其相邻的前侧面12、后侧面13及底面14可拆卸连接；所述右侧面11的下方设有与竖直方向呈60°的向下倾斜的滑槽15，所述滑槽15与所述底面14边缘固定连接；喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管2和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头3；温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管4；自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器5和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板6。
所述床架自动控温控湿的工作原理为，温湿度传感器将采集到的温湿度信息传递给控制面板，控制面板通过比对程序与设定值进行对比，当测定值与设定值不相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置工作，直至测定值与设定值相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置停止工作。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述基质，其包括：
第一基质层，其由20重量份稻壳、12重量份锯末、8重量份草木灰和8重量份珍珠岩经高温灭菌制得，其厚度为8cm；
第二基质层，其位于所述第一基质层上方，其由25重量份黄壤土、20重量份废蜜液、15重量份豆渣、15重量份秸秆、10重量份厩肥和0.5份酵素菌经发酵制得，其厚度为10cm；
第三基质层，其位于所述第二基质层上方，其为厚度为2cm的表层腐殖土。
实施例4：
一种猪血木组织培养快速繁育方法，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端6cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗20min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗5次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将12重量份大蒜、7重量份柠檬草、6重量份代代、6重量份白千层、5重量份蓝桉和5重量份丁香粉碎至100目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取4h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.8cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于25℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养30天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.8mg/L ZT，1.4mg/L6-KT，1.5mg/L 2.4.5-T，5g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.6；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为10h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有1个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于25℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养30天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.5mg/L ZT，1.0mg/L 6-KT，1.5mg/L NAA，6g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.6；
第二光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为12h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根养基中，于28℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养20天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L NAA，0.8mg/LIBA，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.6；
第三光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为12h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养30天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.5mg/L NAA，1.2mg/L ZT，0.5mg/L多效唑，3g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.6；
第四光照条件下培养时，光照强度2000lux，光照时间为12h/天，光照时培养温度为26℃，非光照时培养温度为16℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养6个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，苗床中培养时，培养温度为35℃、湿度为80％、阴蔽度为70％。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体如图1所示，其包括：
床架1，其为上表面开口的中空长方体，其长为6m、宽为1.5m、高为20cm；所述床架1的平行于长度方向的右侧面11和与其相邻的前侧面12、后侧面13及底面14可拆卸连接；所述右侧面11的下方设有与竖直方向呈60°的向下倾斜的滑槽15，所述滑槽15与所述底面14边缘固定连接；喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管2和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头3；温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管4；自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器5和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板6。
所述床架自动控温控湿的工作原理为，温湿度传感器将采集到的温湿度信息传递给控制面板，控制面板通过比对程序与设定值进行对比，当测定值与设定值不相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置工作，直至测定值与设定值相等时，控制面板则通过控制程序控制热交换管和喷雾装置停止工作。
所述的猪血木组织培养快速繁育方法，所述基质，其包括：
第一基质层，其由20重量份稻壳、10重量份锯末、8重量份草木灰和8重量份珍珠岩经高温灭菌制得，其厚度为8cm；
第二基质层，其位于所述第一基质层上方，其由25重量份黄壤土、17重量份废蜜液、12重量份豆渣、15重量份秸秆、10重量份厩肥和0.5份酵素菌经发酵制得，其厚度为10cm；
第三基质层，其位于所述第二基质层上方，其为厚度为2cm的表层腐殖土。
对比例1：
通过对比例1来进一步说明本发明天然消毒液的有益效果。其中，对照组的外植体消毒采用传统酒精和升汞消毒法，对照组的其余操作条件同实施例2，实验结果见表1。
表1不同消毒方法对猪血木幼苗的影响
消毒方法 增殖系数(倍) 畸形苗率(％)
天然消毒液消毒 4.9 0.3
酒精和升汞消毒 4.8 7
由表1可知，消毒方法对猪血木幼苗的增殖系数影响不显著，但对畸形苗率有显著影响，采用天然消毒液的猪血木幼苗畸形苗率仅为0.3％，而采用酒精和升汞消毒法的猪血木幼苗畸形率高达7％，说明天然消毒液消毒可显著降低猪血木幼苗的畸形苗率。
对比例2：
通过对比例2来进一步说明本发明苗床的有益效果。其中，对照组在所述步骤F中幼苗培养时采用沙床培养，通过大棚控制温度，人工加水控制湿度，对照组的其余操作条件同实施例2，实验结果见表2。
表2不同培养方式对猪血木幼苗的影响
培养方式 成活率(％) 平均株高(cm) 平均叶片数(片)
苗床 90 14.5 12
沙床 32 7.7 9
由表2可知，采用苗床培养，猪血木幼苗的成活率、平均株高和平均叶片数均显著高于沙床培养，其中，成活率提高181.3％，平均株高提高88.3％，平均叶片数提高33.3％，说明采用本发明苗床培养不仅能提高猪血木幼苗的成活率，还能促进幼苗的生长。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (7)

1.一种猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、剪取猪血木当年生新梢，取其顶端5-10cm的枝条，将所述枝条用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡20min，取出，用线状自来水冲洗15-20min，再放入天然消毒液中浸泡30min，最后将所述枝条用无菌水冲洗3-5次并用消毒滤纸除去其表面水分，得外植体，其中，
所述天然消毒液的制备方法为：将10-12重量份大蒜、7-9重量份柠檬草、6-8重量份代代、6-8重量份白千层、5-7重量份蓝桉和3-5重量份丁香粉碎至50-100目，加入500重量份的水室温下浸泡1h，再于60℃下真空回流提取2-4h，过滤，所得滤液即为所述天然消毒液；
B、将步骤A中得到的所述外植体用无菌解剖刀切割成0.5-0.8cm的小段并转接到丛生芽诱导培养基中，于22-26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第一光照条件下培养28-30天，得第一丛生芽，其中，
所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0-4.0mg/L ZT，1.0-1.5mg/L 6-KT，1.5-2.0mg/L 2.4.5-T，3-5g/L大豆肽，30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第一光照条件下培养时，光照强度为1500lux，光照时间为8-10h/天；
C、将步骤B中得到的所述第一丛生芽用无菌解剖刀切割成带有1-2个芽的小块并分别转接到增殖培养基中，于22-26℃，黑暗条件下培养2天后，转入第二光照条件下培养28-30天，得第二丛生芽，其中，
所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括3.0-3.5mg/L ZT，1.0-1.5mg/L6-KT，1.0-1.5mg/L NAA，4-6g/L大豆肽，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第二光照条件下培养时，光照强度1800-2000lux，光照时间为10-12h/天；
D、将步骤C中得到的所述第二丛生芽转接到生根培 养基中，于26-28℃，黑暗条件下培养6天后，转入第三光照条件下培养18-20天，得完整植株，其中，
所述生根培养基是以3/4MS培养基为基本培养基，还包括1.0-1.5mg/L NAA，0.5-1.0mg/L IBA，35g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第三光照条件下培养时，光照强度2000-2200lux，光照时间为10-12h/天；
E、向所述生根培养基中加入0.5cm厚的无菌水，敞口培养7天后，将所述完整植株取出，转入壮苗培养基中，第四光照条件下培养28-30天，得幼苗，其中，
所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，还包括1.0-1.5mg/L NAA，1.0-1.5mg/LZT，0.5-1.0mg/L多效唑，3-5g/L活性炭，30g/L蔗糖和10g/L琼脂，pH值为5.5-5.8；
第四光照条件下培养时，光照强度2000-2200lux，光照时间为10-12h/天，光照时培养温度为22-26℃，非光照时培养温度为16-20℃；
F、将步骤E中得到的所述幼苗移栽到苗床中继续培养5-6个月，得猪血木移栽苗，最后将所述猪血木移栽苗进行野外移栽。
2.如权利要求1所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，苗床中培养时，培养温度为34-37℃、湿度为70-80％、阴蔽度为60-80％。
3.如权利要求2所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，所述苗床由床体和基质组成，其中，所述床体，其包括：
床架，其为上表面开口的中空长方体，其长为3-9m、宽为1-1.8m、高为15-20cm；所述床架的平行于长度方向的右侧面和与其相邻的前侧面、后侧面及底面可拆卸连接；所述右侧面的下方设有与竖直方向呈30-60°的向下倾斜的滑槽，所述滑槽与所述底面边缘固定连接；
喷雾装置，其包括间隔设置在所述床架的内部上方并与所述床架的长度方向平行的多个进水管和间隔设置在所述进水管上的多个旋转喷头；
温控装置，其为设置在所述床架的内部下方的呈波浪形排列的热交换管；
自动控制系统，其包括设置在所述床架的内部的多个温湿度传感器和设置在所述前侧面的外表面上的控制面板。
4.如权利要求1所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，所述丛生芽诱导培养基中ZT浓度为3.5mg/L，6-KT浓度为1.2mg/L，2.4.5-T浓度为1.5mg/L，大豆肽浓度为4g/L，pH值为5.8。
5.如权利要求1所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，所述增殖培养基中ZT浓度为3.2mg/L，6-KT浓度为1.2mg/L，NAA浓度为1.2mg/L，大豆肽浓度为5/L，pH值为5.8。
6.如权利要求1所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，所述生根培养基中NAA浓度为1.2mg/L，IBA浓度为0.8mg/L，pH值为5.8。
7.如权利要求1所述的猪血木组织培养快速繁育方法，其特征在于，所述壮苗培养基中NAA浓度为1.2mg/L，ZT浓度为1.2mg/L，多效唑浓度为0.8mg/L，活性炭浓度为4g/L，pH值为5.8。
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山茶科植物组织培养研究进展;胡莹等;《江苏农业科学》;20080415(第2期);第6-9页 *
山茶科濒危植物猪血木（Euryodendron excelsum H.T.Chang）的扦插繁殖;王跃华等;《云南大学学报（自然科学版）》;20020630;第24卷(第3期);第227-228页 *
山茶科濒危植物猪血木的生态与繁殖特性;王跃华等;《云南植物研究》;20021231;第24卷(第6期);第725-732页 *
濒危植物猪血木（Euryodendron excelsum H.T.Chang）自然种群结构及动态;申仕康等;《生态学报》;20080531;第28卷(第5期);第2404-2412页 *

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