CN102002464B

CN102002464B - 一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基

Info

Publication number: CN102002464B
Application number: CN2010105314702A
Authority: CN
Inventors: 涂敏; 蔡海滨; 华玉伟; 黄华孙
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: CN102002464A

Abstract

本发明公开了一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基，属于植物病理技术领域。本发明所述的橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤：A)营养液和培养盘准备：B)离体叶片准备：C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75％酒精中消毒晾干后毛笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于23℃、湿度为90％的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。本发明所述的橡胶树白粉病菌离体培养方法简便、长期高效，能大规模培养橡胶树白粉病菌，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体培养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。

Description

一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基

技术领域

本发明属于植物病理技术领域，尤其是涉及一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基。

背景技术

橡胶树白粉病是由橡胶树粉孢属(oidium heveae B.A.Steinm)真菌侵染引起的巴西橡胶树最重要叶部病害之一，自从1918年在印度尼西亚爪哇首次发现以来，迄今已遍布全球各橡胶种植区。发病严重时，白粉病引起橡胶树落叶、落花，使胶乳减产、橡胶树生势衰弱，新梢枯死，对橡胶树生长和产量影响非常大。

橡胶树白粉病作为一种气候病害，主要在春季气候冷凉、阴湿的条件下爆发流行，且橡胶树白粉菌属于专性寄生菌，在人工配制的培养基上不能生长，只能在鲜活的植物组织材料上培养和保存。研究所需的橡胶树白粉病材料，只有在春季白粉病爆发时从大田中采集。因此，橡胶树白粉病存在受自然条件影响大、存在时间短、不容易控制保存等缺陷，给研究带来不便。

在橡胶树白粉病的病害鉴定、抗病育种等实验研究中，人工培养和保存橡胶树白粉病的方法主要是在保证温湿度的条件下，将橡胶树白粉病孢子接种在橡胶树袋装苗的幼嫩叶片上，使其发病保存。但袋装苗保存法存在占地面积较大，可使用的幼嫩叶片较少等缺点，很难达到试验需求。

发明内容

本发明提供一种简便、长期高效、规模较大的橡胶树白粉病菌培养保存的方法，利用保鲜营养液使橡胶树叶片保持较长时间生活力，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体培养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤：

A)营养液和培养盘准备：

A1、配制营养液：氯化钙100～200mg/L、6-苄氨基嘌呤5～10mg/L、水杨酸10～80mg/L、维生素C 0.2～0.8mg/L、硫代硫酸钠0.2～0.8g/L、活性炭1～5g/L、0.2倍MS培养基大量元素，所述0.2倍MS培养基大量元素包括：硝酸铵3.3g/L、硝酸钾3.8g/L、二水氯化钙0.88g/L、七水硫酸镁0.74g/L、磷酸二氢钾0.34g/L；

A2、在无菌培养盘中装入过40目或以下细筛的细沙，以不超过沙面的无菌水保持细沙湿润，将PCR板置于沙中，用移液枪转营养液入PCR板孔内；

B)离体叶片准备：

B1、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；

B2、将采集的新鲜橡胶树叶片用无菌水冲洗二至三遍后，在0.3-0.5％次氯酸钠溶液中浸泡3-5分钟，再用无菌水冲洗二至三遍，沥干；

C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75％酒精中消毒晾干后毛笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于23℃、湿度为90％的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。

本发明目的之二在于提供一种用于橡胶树白粉病菌离体培养的培养基，包括：

氯化钙100～200mg/L、6-苄氨基嘌呤5～10mg/L、水杨酸10～80mg/L、维生素C 0.2～0.8mg/L、硫代硫酸钠0.2～0.8g/L、活性炭1～5g/L、0.2倍MS培养基大量元素(硝酸铵3.3g/L、硝酸钾3.8g/L、二水氯化钙0.88g/L、七水硫酸镁0.74g/L、磷酸二氢钾0.34g/L)。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明通过大量的探索研究，配置出能使橡胶树离体叶片保持较长时间生活力的保鲜营养液(培养基)，通过6-苄氨基嘌呤、水杨酸、维生素C与0.2倍MS培养基大量元素协同作用，模拟橡胶树白粉病菌最佳生长环境，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体培养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。本发明所述方法简单，操作方便，占用空间小，通过橡胶树离体叶片进行白粉病菌培养，能在短期内繁殖出大量的白粉病菌用于橡胶树种质资源的人工接种，解决橡胶树白粉病抗性鉴定的重要问题，并促进橡胶树白粉病形态学、生物学和分子生物学的研究，为即时、高效地开展橡胶树白粉病菌研究奠定了基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

1、离体叶片准备

A、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；

B、将采集的新鲜橡胶树叶片用无菌水冲洗三遍后，在0.5％次氯酸钠溶液中浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三遍，沥干；

2、菌种选择：选择橡胶树病叶上新鲜的橡胶树白粉病无性分生孢子；

3、营养液和培养盘准备

A、采用如下配方配制营养液：氯化钙100～200mg/L、6-苄氨基嘌呤5～10mg/L、水杨酸10～80mg/L、维生素C 0.2～0.8mg/L、硫代硫酸钠0.2～0.8g/L、活性炭1～5g/L、0.2倍MS培养基大量元素(硝酸铵3.3g/L、硝酸钾3.8g/L、二水氯化钙0.88g/L、七水硫酸镁0.74g/L、磷酸二氢钾0.34g/L)；

B、在白磁盘中装入过40目筛的细沙，以不超过沙面的无菌水保持细沙湿润，将PCR板置于沙中，用移液枪转营养液入PCR板孔内；

4、接种培养

将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，毛笔在75％酒精中消毒晾干后，轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌于经过营养液处理的离体叶片上，置于23℃、湿度为90％的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。

本实施例所述橡胶树白粉病菌离体培养方法：

1、实现了白粉病菌离体培养，可快速、长期培养保存橡胶树白粉病菌。橡胶树白粉病菌是一种专性寄生菌，只能寄生在鲜活的橡胶树嫩叶、嫩芽、嫩梢和花序上，且生长条件严格，在自然界中常常因为温度、湿度和橡胶树物候期等原因很难获得大量的橡胶树白粉病病菌。本方法克服了橡胶树白粉病病害研究受气候、物候等外部条件制约的困难，可以长期、快捷地培养可用于研究的橡胶树白粉病病菌。

2、实现了白粉病菌的规模化培养。本方法操作简单，占用空间小，采集巴西橡胶树嫩叶，利用人工培养箱短期就可繁殖出大量白粉病菌，如此规模化的病菌离体培养是进行橡胶树白粉病研究的有效手段。

Claims

1.一种橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤：

A)营养液和培养盘准备：

A1、配置营养液：氯化钙100～200mg/L、6-苄氨基嘌呤5～10mg/L、水杨酸10～80mg/L、维生素C0.2～0.8mg/L、硫代硫酸钠0.2～0.8g/L、活性炭1～5g/L、0.2倍MS培养基大量元素，所述0.2倍MS培养基大量元素为：硝酸铵3.3g/L、硝酸钾3.8g/L、二水氯化钙0.88g/L、七水硫酸镁0.74g/L、磷酸二氢钾0.34g/L；

B)离体叶片准备：

B1、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；

C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75％酒精中消毒晾干后的毛笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于23℃、湿度为90％的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。

2.一种用于橡胶树白粉病菌离体培养的培养基，包括：

氯化钙100～200mg/L、6-苄氨基嘌呤5～10mg/L、水杨酸10～80mg/L、维生素C0.2～0.8mg/L、硫代硫酸钠0.2～0.8g/L、活性炭1～5g/L、0.2倍MS培养基大量元素，所述0.2倍MS培养基大量元素包括：硝酸铵3.3g/L、硝酸钾3.8g/L、二水氯化钙0.88g/L、七水硫酸镁0.74g/L、磷酸二氢钾0.34g/L。