CN101485290A

CN101485290A - 一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法

Info

Publication number: CN101485290A
Application number: CNA2008100014526A
Authority: CN
Inventors: 黄天带; 黄华孙; 李维国; 李哲; 孙爱花; 周权男
Original assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Rubber Research Institute Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2008-01-17
Filing date: 2008-01-17
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2028-01-17
Also published as: CN101485290B

Abstract

本发明涉及一种橡胶树内珠被作为外植体，特别是涉及一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法，主要步骤包括：对幼果的选择及处理，对外植体的选择及处理，愈伤组织的诱导、继代，体细胞胚状体的分化和植株再生。本发明所提供的橡胶树内珠被再生体系建立方法工艺流程简单，生产成本低。利用内珠被来获得幼态自根无性系，克服了花药培养雄蕊剥离困难、白粉病流行季节污染严重的缺点，扩大了外植体的来源，具有容易获得外植体、再生植株健壮的特点，为幼态自根无性系的推广和砧木选育提供了良好的再生体系，为遗传转化提供了良好的受体，也为可长期继代的胚性愈伤组织提供了新的来源，因此具有广阔的应用前景。

Description

一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法

技术领域

本发明涉及一种橡胶树内珠被作为外植体，通过体胚发生途径再生橡胶树小植株的方法，属于植物组织和细胞工程领域，特别是涉及一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法。

背景技术

橡胶树生产上最早使用的种植材料是实生苗，实生苗来自自由授粉的种子，具有生长快、经济寿命长、抗逆性强的优点，但存在株间差异大、平均产量低(仅为芽接树的1/3)、不能保持母本优良性状的缺点(王泽云，陈雄庭，吴胡蝶。橡胶树新型种植材料-体胚植株。热带农业科学，2001，(6)：11-15)。目前普遍使用的种植材料是芽接苗，芽接苗减少了株间产量的差异，大幅度提高了产量，但也有生长慢、抗逆性差的不足之处，而且产量常常受到砧木的影响。自根幼态无性系是新型的种植材料，目前获得自根幼态无性系有两种方法：通过花药再生植株和通过内珠被再生植株(王泽云，曾宪松，陈传琴等。从离体花药诱导巴西橡胶植株。热带作物科技通讯，1978，(4)：1-7；Carron MP，Enjalric F.Embryogenèse somatique à patir du tegument interne de lagraine d’Heveabrasiliensis(Kunth)Müll-Arg.C R Acad Sci Paris，1985，300(III)17：653-658)。花药(内珠被)植株经过了类似于合子胚的途径，恢复了幼态，又属体细胞无性繁殖，因此保持了供体植株的遗传信息。由此可见，这类植株集中了实生苗和芽接苗的优点，具有生长快、产量高、茎干圆锥度大的优点，花药植株产量较供体老态无性系增加了29.9～46.3％(陈雄庭，王泽云，吴蝴蝶，张秀娟。橡胶树新种植材料-自根幼态无性系，热带作物学报，2002，23(1)：19-23)内珠被微繁植株较芽接树产量提高了20％(Carron MP，Laerdet L，Leconte A et al.Fieldgrowth and rubber yield of Hevea brasiliensis(

.-Arg.)from budded versus invitro micropropagated plants from clone IRCA 18.First international symposium onacclimatization and establishment of micropropagated plants，Sani-Halkidiki，2001，19-22September，p283-293)，而且克服了芽接苗中砧木的不良影响，被称为“自根幼态无性系”，正成为新型种植材料。

然而花药培养取材季节大都是白粉病流行的时候，因此存在真菌污染严重的问题；而且花药较小，剥离困难，生产成本高，无法满足生产上对自根幼态无性系的大量需求。法国内珠被紧实愈伤再生体系经过多年的发展，已取得了较大进展：胚性愈伤诱导率达到60～100％，由体胚再生植株的频率达到30％(M P Carron，J d’Auzac，H.Etienne et al.Biochemical and histological features of somaticembryogenesis in Hevea brasiliensis.Indian Journal of Natural Rubber Research，1992，5(1&2)：7-17)。改良的培养基如下：诱导愈伤培养基为改良的MS培养基添加6-BA、3，4-D、AgNO₃、蔗糖和gelrite；胚状体分化培养基基本同愈伤诱导培养基但添加亚精胺；胚状体成熟培养基基本同分化培养基但去除AgNO₃，降低BA和3，4-D浓度。培养温度为20℃，暗培养。上述改良的MS培养基修改的部分为：大量元素(mg/L)：NH₄NO₃：1601；KNO₃：2022；MgSO₄·7H₂O：739；NaH₂PO₄·H₂O：276；微量元素(mg/L)：H₃BO₃：9.28；ZnSO₄·7H₂O：11.5；CuSO₄·5H₂O：0.37；CoCl₂·6H₂O：0.24；Na₂SO₄：92.37；有机元素(mg/L)：肌醇：5.4；烟酸：0.46；盐酸硫胺素：0.67；盐酸吡多醇：0.62；生物素：0.048；D-泛酸钙：0.48；抗坏血酸：0.17；氯化胆碱：0.14；L-半胱氨酸盐酸盐：0.46；甘氨酸：0.37；核黄素：0.37。但是，实践证明用该方法无法建立国内品种的内珠被再生体系，相关研究仍处于摸索阶段(丛明.人血清白蛋白cDNA转化橡胶树的研究，华南热带农业大学硕士论文，2005)。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法，通过体细胞胚胎发生和植株再生技术研究，获得橡胶树再生植株，以满足生产和实验的需要。

为了达到上述目的，本发明的目的是这样实现的：一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法，它包括对幼果的选择及处理，对外植体的选择及处理，愈伤组织的诱导、继代，体细胞胚状体的分化和植株再生的过程；

(1)对幼果的选择及处理过程：选取6～10周的幼果，先用洗衣粉洗涤，再用流动的自来水充分冲洗后，将幼果移入无菌环境，先用70～75％乙醇消毒1分钟，接着用0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次；

(2)对外植体的选择及处理过程：对幼果的选择及处理过程已消毒好的幼果切开，取出胚珠，将胚珠的外珠被切掉，保留内珠被及珠心，将其切成大小为0.3～1.0cm，厚0.5～1mm的片状；

(3)愈伤组织的诱导过程：所述片状外植体，接种于愈伤组织诱导培养基暗培养15～30天，以诱导愈伤组织，培养温度在24℃～30℃之间；愈伤组织诱导培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基修改的成份为七水硫酸镁400～600mg/L，磷酸二氢钾350～500mg/L，无水氯化钙200～350mg/L，一水硫酸锰20～40mg/L，五水硫酸铜0.1～0.3mg/L，附加成份为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5～3mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5～3mg/L、硝酸银(AgNO₃)5～10mg/L、植物凝胶(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L；

(4)愈伤组织的继代过程：将所述诱导的愈伤组织转入继代培养基暗培养15～30天，培养温度在24℃～30℃之间；继代培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加2，4-二氯苯氧乙酸0.1～2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.1～2mg/L、脱落酸(ABA)0.05～2mg/L、植物凝胶2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L；

(5)体细胞胚状体的分化过程：将得到的愈伤组织接种于分化培养基暗培养20～50天，以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度在20℃～28℃之间；分化培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加6-苄氨基腺嘌呤0.5～2mg/L、激动素(KT)0.5～4mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.05～1mg/L、赤霉素(GA₃)0.01-1mg/L、植物凝胶2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L；

(6)植株再生的过程：将体细胞胚状体的分化过程得到的成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在20℃～30℃之间；出苗培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加激动素0.1～2mg/L、赤霉素0.1～4mg/L、生长素(IAA)0.01～1mg/L、植物凝胶2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L；

本发明一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法的有益效果是：(1)本发明所使用的愈伤组织诱导、继代、体胚分化和出苗基本培养基及培养基添加的激素和附加物及培养条件与法国不同，适宜国内橡胶树品种。国内原来巴西橡胶树通过体胚发生途径的获得再生植株的方法只有花药再生体系，使得基于组织培养的研究和生产受花季限制，内珠被再生体系的建立使花季过后还可以取内珠被作外植体，延长了获取外植体的时间、种类，加速该领域的发展。

(2)本发明与花药再生体系相比，剥离花药费工、费钱，而内珠被获得简单、快捷，大大提高了实验和生产效率；橡胶树开花季节往往也是白粉病流行的时候，而花萼幼嫩，无法抵挡菌丝的侵入，因此花药接种污染率常较高，严重时达到50％-70％。而胚珠成熟过程均处于封闭状态，受到厚厚的果皮的保护，因此胚珠基本是无菌的，所以内珠被接种污染率很低，一般少于5％，极大地提高了实验和生产效率。

(3)本发明为极有前途的新型种植材料“自根幼态无性系”在国内的推广，为生产上遗传背景一致的砧木的获取，为巴西橡胶树研究领域一直关心的砧穗关系的研究提供了新的选择。自根幼态无性系结合了芽接苗和实生苗的优点，很有推广价值；而橡胶树的砧木一直都是采用自然授粉状态下的种子再生苗，因而遗传背景差异大，导致来自同一基因型接穗的芽接树产量差别较大，因此砧木无性系有很大的市场潜力；该材料也为砧穗关系的研究奠定基础，从而为选择最优的砧穗组合提供了可能。

(4)本发明为国内可长期继代的胚性愈伤组织提供了新的来源。可长期继代的胚性愈伤组织是一类有别于以花药和内珠被为外植体诱导出来的愈伤组织，直接诱导的愈伤组织不耐继代，多次继代后胚性丧失，而可长期继代的胚性愈伤组织经过5年的继代仍能保持胚性。实践证明，花药和内珠被均能诱导这类胚性愈伤组织。

本发明工艺流程简单，生产成本低，胚状体诱导率高，再生植株健壮，具有很大的应用价值。

具体实施方式

下面举例对本发明作进一步详细说明：

本发明所设计的建立内珠被再生体系的方法：包括幼果的选择和处理，外植体的选择和处理，愈伤组织的诱导和继代，体细胞胚诱导和植株再生过程：

(1)对幼果的选择及处理过程是指选取6～10周的幼果，先用洗衣粉洗涤，再用流动的自来水充分冲洗后，移入无菌环境，先用70～75％乙醇消毒1分钟，接着用0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。

(2)对外植体的选择及处理过程是指已消毒好的幼果切开，取出胚珠，将胚珠的外珠被切掉，保留内珠被及珠心，将其切成大小为0.3～1.0cm，厚0.5～1mm的片状。

(3)愈伤组织的诱导过程是指所述片状外植体，接种于愈伤组织诱导培养基暗培养15～30天，以诱导愈伤组织，培养温度在24℃～30℃之间。愈伤组织诱导培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基修改的成份为七水硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)400～600mg/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)350～500mg/L，无水氯化钙(CaCl₂)200～350mg/L，一水硫酸锰(MnSO₄.H₂O)20～40mg/L，五水硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)0.1～0.3mg/L(以下步骤同)，附加成份为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5～3mg/L、、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5～3mg/L、硝酸银(AgNO₃)5～10mg/L、植物凝胶(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

(4)愈伤组织的继代过程是指诱导的愈伤组织转入继代培养基暗培养。培养温度在24℃～30℃之间。所述继代培养基的有效成分为上述改良的MS培养基和附加成份，附加成份为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.1～2mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.1～2mg/L、脱落酸(ABA)0.05～2mg/L、植物凝胶(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L。

(5)体细胞胚状体的分化过程是得到的愈伤组织接种于分化培养基暗培养20～50天，以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度在20℃～28℃之间。分化培养基的有效成分为上述改良的MS培养基和附加成份，附加成份为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5～2mg/L、激动素(KT)0.5～4mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.05～1mg/L、赤霉素(GA₃)0.01-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。

(6)植株再生的过程是得到的成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在20℃～30℃之间。出苗培养基的有效成分为改良的MS培养基和附加成份，附加成份为：激动素(KT)0.1～2mg/L、赤霉素(GA₃0).1～4mg/L、生长素(IAA)0.01～1mg/L、植物凝胶(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。

实施例

一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法，具体步骤是：

(1)对幼果的选择及处理：选取6～10周的热研88-13幼果，先用洗衣粉洗涤，再用流动的自来水充分冲洗后，移入无菌环境，先用75％乙醇消毒1分钟，接着用0.1％升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗3～5次，每次3分钟。

(2)对外植体的选择及处理：将消毒好的幼果切开，取出胚珠，将胚珠的外珠被切掉，保留内珠被及珠心，将其切成大小为0.3～1.0cm，厚0.5～1mm的片状。

(3)愈伤组织的诱导过程：将上述片状外植体，接种于愈伤组织诱导培养基暗培养15～30天，培养温度在24℃～28℃之间。外植体在上述培养基中膨大、部分愈伤化、颜色由白色变成鲜黄。所述愈伤组织诱导培养基的有效成份为改良的MS培养基和附加成份，MS培养基修改的成份为MgSO₄.7H₂O 500mg/L，KH₂PO₄ 400mg/L，CaCl₂ 250mg/L，MnSO₄.H2O 35mg/L，CuSO₄.5H₂O 0.2mg/L(以下步骤同)，附加成份为2，4-D1.2mg/L、6-BA 2mg/L、AgNO₃ 5mg/L、Phytagel2g/L、蔗糖50g/L、椰子水50ml/L。

(4)愈伤组织的继代过程：将愈伤组织转入继代培养基暗培养15～30天，培养温度在24℃～28℃之间。部分愈伤化的外植体在继代培养基中进一步愈伤化，形成鲜黄、紧实的愈伤组织。所述继代培养基的有效成分为改良的MS培养基和附加成份，附加成份为2，4-D 0.5mg/L、6-BA 1mg/L、ABA0.5mg/L、Phytagel2g/L、蔗糖50g/L、椰子水50ml/L。

(5)体细胞胚状体的分化过程：将继代后的愈伤组织接种于分化培养基暗培养30天，以促进体细胞胚状体的分化、成熟，培养温度在20℃～28℃之间。30天后，紧实的愈伤组织表面出现了长势旺盛的乳白色各个阶段的小胚状体及子叶形胚状体，一个愈伤可分化一至数十个胚状体。分化培养基的有效成分为改良的MS培养基和附加成份，附加成份为6-BA 0.5mg/L、KT 1mg/L、NAA0.05mg/L、GA₃ 1mg/L、Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、活性碳1g/L、椰子水50ml/L。

(6)植株再生的过程：将成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在20℃～30℃之间。成熟的子叶形胚状体转入出苗培养基后20天开始陆续有小植株再生，再生的小植株健壮，主根发达。出苗培养基的有效成分为改良的MS培养基和附加成份，附加成份为KT 1mg/L、GA₃1mg/L、IAA 0.01mg/L、Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、活性碳1g/L、椰子水50ml/L。

Claims

1、一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法，它包括对幼果的选择及处理，对外植体的选择及处理，愈伤组织的诱导、继代，体细胞胚状体的分化和植株再生的过程，其特征在于：

(6)植株再生的过程：将体细胞胚状体的分化过程得到的成熟胚状体接种到出苗培养基，光照培养，以促其再生出完整植株，培养温度在20℃～30℃之间；出苗培养基的有效成分为改良的MS培养基，并添加激动素0.1～2mg/L、赤霉素0.1～4mg/L、生长素(IAA)0.01～1mg/L、植物凝胶2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。