CN113331057B - 一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，涉及植物组织培养技术领域。首先，通过选择未成熟花序，清洗消毒，切取幼嫩花蕾作为外植体，每个外植体均含有花蕾，并且外植体表面覆盖有花萼；将外植体接种到愈伤组织培养基中，从花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织，再将愈伤组织接种到体细胞分化培养基中，分化培养，即得体细胞胚。本发明中，由于选用花萼诱导体细胞胚，克服了雄蕊或者内珠被诱导发生的缺陷，丰富了橡胶树体胚苗的快繁方法，另外，本发明方案简单可靠，降低了采集难度和对操作人员的要求。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法。
背景技术
橡胶树[Hevea brasiliensis(Willd.ex A. Juss.) Muell.Arg.]是大戟科橡胶树属植物，是热带雨林上层的多年生热带高大乔木，经济寿命高达30-40年，所分泌的胶乳是重要的工业原料，而且，橡胶树的木材质轻，花纹美观，加工性能好，经化学处理后可制作高级家具、纤维板、胶合板、纸浆等，具有较高的经济价值。
橡胶树为圆锥花序，着生于叶腋或鳞片腋，雌雄同株，同序异花；雌花着生于花枝梗顶端，通常每个花序具有雌花3-20朵，雌花基部具一绿色花盘；子房上位，花柱短或无，柱头着生于子房上，中轴胎座，通常3室，每室有一侧生胚珠；雄花较雌花小，数量多，无绿色花盘无花瓣，花萼基部合生，花萼5齿裂或5深裂，米黄色，雄蕊5-10枚，两轮排列与合生额花丝柱上，药室中有大量花粉。橡胶树实生树5-6龄开花，芽接树3-4龄开花；一般每年开花两次，3-4月为春花，5-6月为夏花，春花为主花期。橡胶树的雌花花期10-25天，雄花花期12-27天。
目前，主流种苗培育方式为自根幼态无性系繁殖技术，具有速生、高产和高抗的优良效果。具体而言，此项技术主要通过体细胞胚发生途径获得再生植株，具体包括3个过程：愈伤组织诱导，体细胞胚发生，植株再生。其中，体细胞胚发生是最主要的步骤。
现有技术中，主要使用雄蕊和内珠被作为外植体诱导橡胶树体细胞胚发生。利用雄蕊诱导橡胶树体细胞胚发生技术，主要通过采集雄花并剥取雄蕊诱导愈伤组织，然后用愈伤组织诱导体细胞胚发生（参考文献：王泽云, 曾宪松, 陈传琴, 等. 1980.用离体花药诱导巴西橡胶植株的研究. 热带作物学报, 1(1): 16-26.）。利用内珠被诱导橡胶树体细胞胚发生技术，主要通过采集幼果并切片诱导内珠被愈伤组织，然后用愈伤组织诱导体细胞胚发生（Carron, M.-P., Etienne, H., Michaux-Ferrière, N. and Montoro, P.1995. Somatic embryogenesis in rubber tree (Hevea brasiliensisMuell. Arg.).p.353-369. In: Y.P.S.Bajaj (ed.), Somatic embryogenesis and synthetic seed.1, vol. 30. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Springer, Berlin,Germany.）。
但是在实际应用过程中，利用雄蕊诱导橡胶树体细胞胚发生技术，需要用解剖针和镊子剥开雄花花萼，挑出雄蕊，因雄蕊较小只有1-2mm，操作困难，取样成功率不高，且取样受花粉发育时期限制，另外多个橡胶树优良品种雄蕊败育，只形成花蕾，无法形成适合离体培养的雄蕊。而利用内珠被诱导橡胶树体细胞胚发生技术，因幼果期橡胶树枝繁叶茂，所需幼嫩阶段的幼果难以辨别和采集，对操作人员要求较高，且多个橡胶树优良品种常年无果实。另外，因雄蕊中含有单倍体花粉，幼果中含有授精合子胚和三倍体胚乳，因此利用雄蕊和内珠被作为外植体诱导的愈伤组织和体细胞胚有来自非体细胞的风险。
因此，迫切需要研发出取样方便、易于采集、成功率高、纯粹来自体细胞的外植体诱导体细胞发生的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，通过选择未成熟花序，清洗消毒，切取幼嫩花蕾作为外植体，每个外植体含有0.5-3个花蕾，并且外植体表面覆盖有花萼；将外植体接种到愈伤组织培养基中，从花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织，再将愈伤组织接种到体细胞胚分化培养基中，分化培养，即得体细胞胚。
本发明中，由于选用花萼诱导体细胞胚，克服了雄蕊或者内珠被诱导发生的缺陷，丰富了橡胶树体胚苗的快繁方法，另外，本发明方案简单可靠，降低了采集难度和对操作人员的要求。
为实现上述目的，本发明提供了一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，具体包括以下步骤：外植体选择，清洗消毒，诱导外植体形成愈伤组织，诱导体细胞胚发生。
在一优选的实施方式中，外植体选择步骤中，具体包括：在橡胶树的花处于花蕾状态时，取下健康未成熟花序，将花序切分为单外植体，每个外植体包括0.5-3朵花蕾，每个外植体需覆盖有花萼。
在一优选的实施方式中，清洗消毒步骤中，具体包括：将覆盖花萼的外植体用流水冲洗5-10min，置超净工作台上；先用质量分数为0.05-0.1%的多菌灵表面消毒2-4min，再用体积分数为70-75%酒精表面消毒20-40s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒4-6min，最后用无菌水冲洗3-6次，每次3-5min。
在一优选的实施方式中，诱导外植体形成愈伤组织步骤中，愈伤组织诱导培养基成分：以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330-1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1-0.3mg/L，烟酸浓度为2.5-7.5mg/L，VB1浓度为0.25-0.75mg/L，生物素0.01-0.1mg/L，叶酸0.1-1mg/L，天冬酰胺100-600mg/L，水解酪蛋白100-600mg/L，蔗糖50-90g/L，Phytagel2-3g/L，椰子水40-90 ml/L和激素组合物，pH5.8。
在一优选的实施方式中，所述激素组合物由以下质量浓度的组分组成：2,4-D0.2-2mg/L、反式-玉米素核苷 0.2-2mg/L和Picloram 0.2-2mg/L。
在一优选的实施方式中，诱导体细胞胚发生培养条件为：将花序切成含0.5-3个花蕾的外植体，保证每片外植体覆盖有花萼，接种到愈伤组织诱导培养基上，在24-28℃，相对湿度65-75%，暗培养5-8周，得到胚性愈伤组织。
在一优选的实施方式中，诱导体细胞胚发生步骤中，体细胞胚分化培养基成分：以MS培养基为基本培养基，减少大量元素用量至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，活性炭1g/L，Phytagel 2.2g/L，不加激素，pH5.8。
在一优选的实施方式中，诱导体细胞胚发生培养条件为：24-28℃，相对湿度65-75%，暗培养7-8周，得到体细胞胚。
与现有技术相比，根据本发明的一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法具有如下优点：
1、用雄蕊作为外植体诱导体细胞胚发生受花粉发育时期限制，开发花萼诱导体细胞胚的方法，增加了外植体种类，扩展了用花序开展体细胞胚诱导研究的时期，丰富了橡胶树体胚苗快繁方法。
2、许多橡胶树优良品种雄蕊败育或常年无果，开发花萼诱导体细胞胚的方法，为这些品种体胚苗的繁育提供了途径。
3、雄蕊中含有单倍体花粉，幼果中含有授精合子胚和三倍体胚乳，利用雄蕊和内珠被作为外植体诱导的愈伤组织和体细胞胚有来自非体细胞的风险，而花萼组织全部为体细胞，诱导的愈伤组织和体细胞胚无来自非体细胞胚的风险。
4、本发明直接接种花蕾，易分辨易操作，极大简化了外植体采集步骤，减少对操作人员技术要求。
5、传统消毒技术无法有效保护娇嫩花萼，会造成花萼褐化，无法诱导出胚性愈伤组织，但本申请的消毒技术对花萼无损伤，适用于娇嫩组织消毒。附图说明
图1是根据本发明外植体的采集和制备过程，a.为未成熟花序；
b.为制备得到的外植体，其中，b1为一个外植体含3个花蕾，b2为一个外植体含1个花蕾，b3将单个花蕾切开接种，即一个外植体含0.5个花蕾。
图2是将本发明覆盖有花萼的外植体，接种到愈伤组织培养基后，花萼逐渐膨大、打开。
图3是将本发明覆盖有花萼的外植体，在花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织。
图4是将本发明胚性愈伤组织接种到体细胞胚分化培养基中，分化培养，得到的体细胞胚。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
实施例1
在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集未成熟花序，用流水冲洗5分钟，然后将花序剪成易于消毒的花序小枝，再次用流水冲洗后置于超净工作台上。先用质量分数为0.05%的多菌灵表面消毒3min，再用体积分数为75%酒精表面消毒30s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，每次3min。
用镊子和手术刀将花蕾外植体从花序小枝上切下来作为外植体，每个外植体包括3朵花蕾，并且，外植体上必须覆盖有花萼。接种到愈伤组织诱导培养基上培养6周，培养条件为：温度27℃，相对湿度65%，暗培养。此过程中，花萼膨大打开、在花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织。胚性愈伤组织诱导率84.4%。
后将其接种至体细胞胚分化培养基上培养8周，培养条件为：温度25℃，相对湿度65%，暗培养。此过程中，胚性愈伤组织表面分化形成体细胞胚并发育成熟。体细胞胚分化率63.5%。
使用的愈伤组织诱导培养基成分为：愈伤组织诱导培养基成分：以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1mg/L，烟酸浓度为2.5mg/L，VB1（维生素B1）浓度为0.25mg/L，生物素0.01mg/L，叶酸0.1mg/L，天冬酰胺100mg/L，水解酪蛋白100mg/L，蔗糖50g/L，Phytagel（植物凝胶） 2g/L，椰子水40 ml/L、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸） 0.5mg/L、反式-玉米素核苷 0.5mg/L和Picloram（毒莠定） 0.5mg/L，pH5.8。
使用的体细胞胚分化培养基成分为以MS培养基为基本培养基，减少大量元素用量至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，活性炭1g/L，Phytagel 2.2g/L，pH5.8。
实施例2
在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集未成熟花序，用流水冲洗5分钟，然后将花序剪成易于消毒的花序小枝，再次用流水冲洗后置于超净工作台上。先用质量分数为0.05%的多菌灵表面消毒3min，再用体积分数为75%酒精表面消毒30s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，每次3min。
用镊子和手术刀将花蕾外植体从花序小枝上切下来作为外植体，每个外植体包括0.5朵花蕾，并且，外植体上必须覆盖有花萼。接种到愈伤组织诱导培养基上培养6周，培养条件为：温度27℃，相对湿度75%，暗培养。此过程中，花萼膨大打开、在花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织。胚性愈伤组织诱导率44.2%。
后将其接种至体细胞胚分化培养基上培养8周，培养条件为：温度25℃，相对湿度75%，暗培养。此过程中，胚性愈伤组织表面分化形成体细胞胚并发育成熟。体细胞胚分化率59.5%。
使用的愈伤组织诱导培养基成分为：愈伤组织诱导培养基成分：以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.3mg/L，烟酸浓度为7.5mg/L，VB1浓度为0.75mg/L，生物素0.1mg/L，叶酸1mg/L，天冬酰胺600mg/L，水解酪蛋白600mg/L，蔗糖60g/L，Phytagel3g/L，椰子水40-90 ml/L、2,4-D2mg/L、反式-玉米素核苷 2mg/L和Picloram2mg/L，pH5.8。
使用的体细胞胚分化培养基成分为以MS培养基为基本培养基，减少大量元素用量至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，活性炭1g/L，Phytagel 2.2g/L，pH5.8。
实施例3
在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集未成熟花序，用流水冲洗5分钟，然后将花序剪成易于消毒的花序小枝，再次用流水冲洗后置于超净工作台上。先用质量分数为0.05%的多菌灵表面消毒3min，再用体积分数为75%酒精表面消毒30s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，每次3min。
用镊子和手术刀将花蕾外植体从花序小枝上切下来作为外植体，每个外植体包括1朵花蕾，并且，外植体上必须覆盖有花萼。接种到愈伤组织诱导培养基上培养6周，培养条件为：温度26℃，相对湿度66%，暗培养。此过程中，花萼膨大打开、在花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织。胚性愈伤组织诱导率53.9%。
后将其接种至体细胞胚分化培养基上培养8周，培养条件为：温度25℃，相对湿度66%，暗培养。此过程中，胚性愈伤组织表面分化形成体细胞胚并发育成熟。体细胞胚分化率57.6%。
使用的愈伤组织诱导培养基成分为：愈伤组织诱导培养基成分：以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为390mg/L，五水硫酸铜浓度为0.15mg/L，烟酸浓度为5.5mg/L，VB1浓度为0.65mg/L，生物素0.65mg/L，叶酸0.34mg/L，天冬酰胺550mg/L，水解酪蛋白450mg/L，蔗糖80g/L，Phytagel2.3g/L，椰子水60 ml/L、2,4-D1.2mg/L、反式-玉米素核苷1.2mg/L和Picloram1.6mg/L，pH5.8。
使用的体细胞胚分化培养基成分为以MS培养基为基本培养基，减少大量元素用量至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，活性炭1g/L，Phytagel 2.2g/L，pH5.8。
对比例1
在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集未成熟花序，用流水冲洗5分钟，然后将花序剪成易于消毒的花序小枝，再次用流水冲洗后置于超净工作台上。先用体积分数为75%酒精表面消毒60s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒10min，最后用无菌水冲洗5次，每次3min。用镊子和手术刀将花蕾外植体从花序小枝上切下来作为外植体，每个外植体包括1朵花蕾，并且，外植体上必须覆盖有花萼。接种到愈伤组织诱导培养基上，第二天发现褐化严重，应为消毒损伤，培养5-6周未有胚性愈伤组织形成。
对比例2
在连续2天以上天气晴朗的早晨，挑选生长健壮、无病虫害的母株，采集未成熟花序，用流水冲洗5分钟，然后将花序剪成易于消毒的花序小枝，再次用流水冲洗后置于超净工作台上。先用质量分数为0.05%的多菌灵表面消毒3min，再用体积分数为75%酒精表面消毒30s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒5min，最后用无菌水冲洗5次，每次3min。
由于橡胶花蕾结构没有花瓣，拨开花萼里面就是雄蕊，即传统的雄蕊诱导橡胶树体细胞胚发生技术。因此，发明人尝试使用花柄和花序枝梗作为外植体，外植体均不包括花萼部分。再接种到愈伤组织诱导培养基上，观察发现，花柄和花序枝梗均能膨大，但培养5-6周均未有胚性愈伤组织形成，无法体胚发生。
由此可见，本方案实施例1-3均能利用橡胶树花萼诱导体细胞发生，增加了外植体种类，克服了雄蕊或者内珠被诱导发生的缺陷，丰富了橡胶树体胚苗快繁方法，本方案中胚性愈伤组织诱导率可达84.4%，体细胞胚分化率可达63.5%。而对比例1用酒精和升汞消毒剂消毒时间过长，导致外植体严重褐化损伤，无法形成愈伤组织；对比例2的外植体无花萼覆盖，导致无法从花萼部位诱导长出愈伤组织，无法体胚发生。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (4)
1.一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，其特征在于，选择未成熟花序，清洗消毒，切取幼嫩花蕾作为外植体，每个外植体均含有花蕾，并且外植体表面覆盖有花萼；将外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，从花萼边缘和近轴面形成胚性愈伤组织，再将愈伤组织接种到体细胞胚分化培养基中，分化培养，即得体细胞胚；
其中，所述清洗消毒具体包括：将覆盖花萼的外植体用流水冲洗5-10min，置超净工作台上；先用质量分数为0.05-0.1%的多菌灵表面消毒2-4min，再用体积分数为70-75%酒精表面消毒20-40s，之后立即用质量分数为0.1%氯化汞消毒4-6min，最后用无菌水冲洗3-6次，每次3-5min；
所述愈伤组织诱导培养基成分：以MS培养基为基本培养基，调整硝酸铵的浓度为330-1800mg/L，五水硫酸铜浓度为0.1-0.3mg/L，烟酸浓度为2.5-7.5mg/L，VB1浓度为0.25-0.75mg/L，生物素0.01-0.1mg/L，叶酸0.1-1mg/L，天冬酰胺100-600mg/L，水解酪蛋白100-600mg/L，蔗糖50-90g/L，Phytagel 2-3g/L，椰子水40-90 ml/L和激素组合物，pH5.8，所述激素组合物由以下质量浓度的组分组成：2,4-D 0.2-2mg/L、反式-玉米素核苷 0.2-2mg/L和Picloram 0.2-2mg/L；
所述体细胞胚分化培养基：以MS培养基为基本培养基，减少大量元素用量至原来的4/5，添加蔗糖70g/L，活性炭1g/L，Phytagel 2.2g/L，不加激素，pH5.8。
2.如权利要求1所述的一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，其特征在于，所述外植体选择步骤中，具体包括：在橡胶树的花处于花蕾状态时，取下健康未成熟花序，将花序切分为单外植体，每个外植体包括0.5-3朵花蕾，每个外植体需覆盖有花萼。
3.如权利要求1所述的一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，其特征在于，所述诱导胚性愈伤组织培养条件为： 24-28℃，相对湿度65-75%，暗培养5-8周，得到胚性愈伤组织。
4.如权利要求1所述的一种用橡胶树花萼诱导体细胞胚发生的方法，其特征在于，所述诱导体细胞胚分化培养条件为：24-28℃，相对湿度65-75%，暗培养7-8周，得到体细胞胚。
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