CN103125383B - 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法 - Google Patents

一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103125383B
CN103125383B CN201110394036.9A CN201110394036A CN103125383B CN 103125383 B CN103125383 B CN 103125383B CN 201110394036 A CN201110394036 A CN 201110394036A CN 103125383 B CN103125383 B CN 103125383B
Authority
CN
China
Prior art keywords
medium
illumination
dihydrogen phosphate
calcium chloride
embryoid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201110394036.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103125383A (zh
Inventor
梁国平
黄凤翔
管艳
李玲
田海
孙小龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Institute of Tropical Crops
Original Assignee
Yunnan Institute of Tropical Crops
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Institute of Tropical Crops filed Critical Yunnan Institute of Tropical Crops
Priority to CN201110394036.9A priority Critical patent/CN103125383B/zh
Publication of CN103125383A publication Critical patent/CN103125383A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103125383B publication Critical patent/CN103125383B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

本发明提供了一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法。其方法是以橡胶树未授粉胚珠为外植体，在诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到分化培养基上产生胚状体；胚经过成苗培养基诱导出完整植株。本发明工艺流程简单，生产成本低，培养出生长快、产量高、抗逆性强的体胚植株。利用未授粉胚珠来获得体胚植株，克服了花药组培雄蕊剥离困难、白粉病流行季节污染严重的缺点，丰富了橡胶树组培外植体的来源，为橡胶选育种及良种繁育提供了新材料，具有很大的应用价值。

Description

一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法
技术领域
本发明涉及一种橡胶树未授粉胚珠作为外植体，通过体胚发生途径再生橡胶树完整植株的方法，属于细胞工程领域，特别是涉及一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法。
背景技术
巴西橡胶树所产生的胶乳是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。长期以来，橡胶树的品种选育主要采用常规育种方法，而用于选育种的材料均来自1876年魏克汉（H A Wickhem）系统的后代及其衍生物，不仅育种周期长，且遗传基因非常狭窄，很难培育出即高产抗逆性又强的品种。现在生产上主要使用芽接无性系作为种植材料，而这种种植材料受老态和砧木不良的影响，严重影响橡胶树的产胶量。国内外大量研究证明：幼态橡胶植株比老态芽接苗的茎围增长9%～20%，产量增加20%～50%，抗风、抗寒能力显著增强。而砧木不好会降低产量15%，甚至达到40%。
为了获得产量更高且抗逆性更强的橡胶种植材料，从上世纪50年代以来，橡胶育种学家既开始着手研究其组织培养技术，并取得了一定的进展。通过对高产抗寒品种的花药、子房、未授粉胚珠和内种皮培养，获得的体胚植株被认为是一种高产、高效的新型种植材料。然而，橡胶树的组织培养是木本植物中难度较大的树种之一，且品种之间组培难易也存在较大差异，还有许多高产抗寒无性系未获得成功，难以满足生产中对橡胶树优良品种组培苗的大量需求，同时限制了体胚植株在橡胶树育种及遗传转化研究中的进一步应用。因此，开展对高产抗寒橡胶树品种的组培研究具有十分重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是利用橡胶树未授粉胚珠为外植体，为橡胶选育种及良种繁育提供一种生长快、产量高、抗逆性强的体胚植株再生体系的方法。
本发明提供的一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法包括外植体的选择处理过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚状体分化培养过程、植株再生的诱导过程：
1、外植体的选择处理过程：选取优良品种的雌花，花朵呈黄色、未开花前1-2天时为材料，摘下的雌蕊用无菌纱布包好，在超净工作台上用75%的乙醇处理30秒，再用0.1%的升汞消毒10~20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5~6次；
2、胚性愈伤组织诱导过程：用摄子和解剖针剥取雌蕊，取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，进行光照培养，培养温度为26~28℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述诱导胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L 、NAA0.5~3.0 mg/L、6-BA0.5~3.0mg/L、2,4-D1.0~3.0mg/L、半胱氨酸100~450 mg/L、PVP500~1500 mg/L、水解乳蛋白30~70 mg/L、葡萄糖200~600 mg/L、椰子水40~80 mg/L、蔗糖50~80g/L、琼脂4~7 g/L；
3、胚状体分化培养过程：将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，进行光照培养20~60天，培养温度为23~27℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述胚状体分化培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L、NAA0.1~2 .0mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、蔗糖60~90g/L、琼脂4~7 g/L；
4、植株再生的诱导过程：将分化出的成熟胚状体移入成苗培养基，进行光照培养20~50天，培养温度为26~29℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述成苗培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.01~1.0 mg/L、IAA0.1~2.0 mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、5-溴尿嘧啶0.1~1.0 mg/L、蔗糖40~70g/L、琼脂4~7 g/L。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法。利用未授粉胚珠来获得体胚植株，摆脱了不良砧木的影响，并能恢复其幼态特性，为第二代胶园以及我国在周边国家开展的替代种植提供更好的种植材料；本发明工艺流程简单，生产成本低，克服了花药组培雄蕊剥离困难、白粉病流行季节污染严重的缺点，丰富了橡胶树组培外植体的来源，为橡胶选育种及良种繁育提供了新材料，具有很大的应用价值。
2、本发明设计的胚性愈伤组织诱导、胚状体分化培养、植株再生的诱导培养基和添加物及培养条件，适合于橡胶树品种用本发明方法培养出再生植株。
3、本发明工艺流程简单，生产成本低，培育出生长快、产量高、抗逆性强的优良品种体胚植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
本发明所设计的一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法包括：外植体的选择处理过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚状体分化培养过程、植株再生的诱导过程：
1、外植体的选择处理过程：选取优良品种的雌花为材料，未授粉子房和开花前1-2天，花冠呈黄色的胚珠作为外植体，摘下的雌蕊用无菌纱布包好，在超净工作台上用75%的乙醇灭菌30秒，再用0.1%的升汞消毒10~20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5~6次。
2、胚性愈伤组织诱导过程：用摄子和解剖针从消毒好的雌蕊中取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，进行光照培养20~60天，培养温度为26~28℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述诱导胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L 、NAA0.5~3.0 mg/L、6-BA0.5~3.0mg/L、2,4-D1.0~3.0mg/L、半胱氨酸100~450 mg/L、PVP500~1500 mg/L、水解乳蛋白30~70 mg/L、葡萄糖200~600 mg/L、椰子水40~80 mg/L、蔗糖50~80g/L、琼脂4~7 g/L。
3、胚状体分化培养过程：将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，进行光照培养20~60天，培养温度为23~27℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述胚状体分化培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L、NAA0.1~2 .0mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、蔗糖60~90g/L、琼脂4~7 g/L。
4、植株再生的诱导过程：将分化出的成熟胚状体移入成苗培养基，进行光照培养20~50天，培养温度为26~29℃之间，光照10h·d-1，光照度约500lx；所述成苗培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.01~1.0 mg/L、IAA0.1~2.0 mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、5-溴尿嘧啶0.1~1.0 mg/L、蔗糖40~70g/L、琼脂4~7 g/L。
实施例：
一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法，具体步棸是：
1、外植体的选择处理过程
（1）选取优良品种的雌花为材料，未授粉子房和开花前1-2天，花冠呈黄色的胚珠作为外植体。
（2）摘下的雌蕊用无菌纱布包好，将包好的雌蕊移入超净工作台，用75%的乙醇灭菌30秒，再用0.1%的升汞消毒20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5次，每次2分钟。
2、胚性愈伤组织诱导过程
（1）用摄子和解剖针从消毒好的雌蕊中取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，培养基的有效成分为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320mg/L、硝酸钾1520mg/L、磷酸二氢钾136 mg/L、七水硫酸镁296 mg/L、无水氯化钙265mg/L，并添加KT2.0mg/L 、NAA2.0 mg/L、6-BA2.0mg/L、2,4-D3.0mg/L、半胱氨酸400 mg/L、PVP800 mg/L、水解乳蛋白60mg/L、葡萄糖300 mg/L、椰子水50 mg/L、蔗糖75g/L、琼脂6 g/L。
（2）光照培养，光照10h·d-1，光照度约500lx，培养温度为28℃，培养60天。
3、胚状体分化培养过程
（1）将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，培养基的有效成分为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320mg/L、硝酸钾1520mg/L、磷酸二氢钾136 mg/L、七水硫酸镁296 mg/L、无水氯化钙265mg/L，并添加KT2.0 mg/L、NAA0.5mg/L、GA31.2 mg/L、蔗糖85g/L、琼脂6 g/L。
（2）光照培养，光照10h·d-1，光照度约500lx，培养温度为25℃，培养50天。
4、植株再生的诱导过程
（1）将分化出的成熟胚状体移入成苗培养基，成苗培养基有效成分为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸胺、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸胺1320mg/L、硝酸钾1520mg/L、磷酸二氢钾136 mg/L、七水硫酸镁296 mg/L、无水氯化钙265mg/L，并添加KT0.5mg/L、IAA0.5 mg/L、GA31.0 mg/L、5-溴尿嘧啶0.2 mg/L、蔗糖60g/L、琼脂5 g/L。
（2）光照培养，光照10h·d-1，光照度约500lx，培养温度为28℃，培养20天后，成熟胚状体长出主根和侧根，随后抽茎长叶，50天后发育成具有根、茎、叶的完整小植株。

Claims (1)

1.一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法，包括外植体的选择处理过程、胚性愈伤组织诱导过程、胚状体分化培养过程、植株再生的诱导过程，其特征在于：
（1）外植体的选择处理过程：选取优良品种的雌花，花朵呈黄色、未开花前1-2天时为材料，摘下的雌蕊用无菌纱布包好，在超净工作台上用75%的乙醇处理30秒，再用0.1%的升汞消毒10~20分钟，并用镊子不停地搅动，使之彻底灭菌，最后用无菌水冲洗5~6次；
（2）胚性愈伤组织诱导过程：用镊子和解剖针剥取雌蕊，取出幼小胚珠接种于诱导胚性愈伤组织的培养基上，进行光照培养，培养温度为26~28℃之间，光照10h·d-1，光照强度为500lx，培养20~60天后，会从外植体上诱导出新鲜、松散、黄色颗粒状的胚性愈伤组织；所述诱导胚性愈伤组织的培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸铵1320~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L 、NAA0.5~3.0 mg/L、6-BA0.5~3.0mg/L、2,4-D1.0~3.0mg/L、半胱氨酸100~450 mg/L、PVP500~1500 mg/L、水解乳蛋白30~70 mg/L、葡萄糖200~600 mg/L、椰子水40~80 mg/L、蔗糖50~90g/L、琼脂4~7 g/L；
（3）胚状体分化培养过程：将产生的胚性愈伤组织接种于胚状体分化培养基上，进行光照培养，培养温度为23~27℃之间，光照10h·d-1，光照强度为500lx，培养20~60天后，胚性愈伤组织进一步分化胚状体，并将分化出的胚状体转入胚状体分化培养基中进行成熟培养，一个月更换一次新鲜培养基；所述胚状体分化培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸铵1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.5~2.5 mg/L、NAA0.1~2 .0mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、蔗糖60~90g/L、琼脂4~7 g/L；
（4）植株再生的诱导过程：将分化出的成熟胚状体移入成苗培养基，进行光照培养，培养温度为26~29℃之间，光照10h·d-1，光照强度为500lx，培养20天后，成熟胚状体长出主根和侧根，随后抽茎长叶，50天后发育成具有根、茎、叶的完整小植株；所述成苗培养基为MS培养基和附加成分，并将MS培养基中的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、无水氯化钙的含量调整为硝酸铵1300~1650mg/L、硝酸钾1520~1900 mg/L、磷酸二氢钾130~170 mg/L、七水硫酸镁290~370 mg/L、无水氯化钙260~332 mg/L，并添加KT0.01~1.0 mg/L、IAA0.1~2.0 mg/L、GA30.1~1.5 mg/L、5-溴尿嘧啶0.1~1.0 mg/L、蔗糖40~70g/L、琼脂4~7 g/L。
CN201110394036.9A 2011-12-02 2011-12-02 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法 Expired - Fee Related CN103125383B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110394036.9A CN103125383B (zh) 2011-12-02 2011-12-02 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110394036.9A CN103125383B (zh) 2011-12-02 2011-12-02 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103125383A CN103125383A (zh) 2013-06-05
CN103125383B true CN103125383B (zh) 2015-02-25

Family

ID=48486332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110394036.9A Expired - Fee Related CN103125383B (zh) 2011-12-02 2011-12-02 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103125383B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103782912B (zh) * 2014-02-28 2015-04-22 钦州市林业科学研究所 红桂木组织培养培养基
CN104031936A (zh) * 2014-06-16 2014-09-10 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法
CN107182784A (zh) * 2017-06-12 2017-09-22 云南省热带作物科学研究所 一种橡胶树组培苗高效炼苗移栽方法及橡胶树幼苗培育方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582639A (zh) * 2004-05-26 2005-02-23 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种诱发水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法
CN101186927A (zh) * 2007-11-14 2008-05-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法
CN101485290A (zh) * 2008-01-17 2009-07-22 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1582639A (zh) * 2004-05-26 2005-02-23 中国科学院亚热带农业生态研究所 一种诱发水稻抗氯磺隆体细胞突变体的方法
CN101186927A (zh) * 2007-11-14 2008-05-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法
CN101485290A (zh) * 2008-01-17 2009-07-22 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种建立橡胶树内珠被再生体系的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
三叶橡胶树未授粉子房、胚珠培养再生植株研究初报;肖三元等;《云南热作科技》;19941231;第17卷(第3期);18-20 *
巴西橡胶树的组织培养;谭德冠等;《植物生理学通讯》;20051031;第41卷(第5期);674-678 *
橡胶树品种海垦2花药与未授粉胚珠愈伤伤组织诱导及其胚胎发生能力的比较;吴煜等;《热带农业科学》;20080430;第28卷(第2期);1-4 *
郭高发等.离体胚珠诱导巴西橡胶植株(简报).《遗传》.1982,第4卷(第1期),27-28. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103125383A (zh) 2013-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101491215B (zh) 香椿组培快繁方法
CN105075863B (zh) 一种紫斑牡丹快速繁殖方法
CN102771395A (zh) 一种黄精的组织培养方法
CN103583358A (zh) 一种铁皮石斛兰离体培养再生植株的方法
CN104206270A (zh) 一种红火炬郁金的组织培养及根茎膨大方法
CN102187812B (zh) 利用巴西橡胶树胚性细胞悬浮系建立高效植株再生体系的方法
CN103155862B (zh) 麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法
CN103548696B (zh) 一种繁殖蓝莓苗的方法
CN103651137A (zh) 狐狸尾兰原球茎快速繁殖方法
CN102461463A (zh) 一种适用于大规模种植的构树种苗组织培养方法
CN103444523A (zh) 一种花药快速诱导胚性愈伤组织再生植株的方法
CN104137779A (zh) 一种白木乌桕茎段快速诱导再生植株的方法
CN103548691B (zh) 茶树组培苗生根培养的方法
CN103371103A (zh) 一种马缨杜鹃组织培养快速繁殖方法
CN105475129A (zh) 一种竹叶兰组培快繁的方法
CN103125383B (zh) 一种建立橡胶树未授粉胚珠再生体系的方法
CN104823852A (zh) 一种铁皮石斛根尖组培快速繁育方法
CN105519442B (zh) 一种欧李愈伤组织再生体系的培植方法
CN106973796A (zh) 一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法
CN102860257B (zh) 一种鱼腥草地上茎组织培养快速繁殖的方法
CN1331389C (zh) 九节茶药材种苗的组培快繁方法
CN104285815B (zh) 一种尾巨桉dh32-13品种的组培快繁方法
CN105918128A (zh) 一种美国红枫快速繁殖的方法
CN105875410B (zh) 一种墨兰与虎头兰的杂交兰种苗的快速繁殖方法
CN103283602B (zh) 一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150225

Termination date: 20201202

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee