CN104031936A - 一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法 - Google Patents

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CN104031936A CN201410267627.3A CN201410267627A CN104031936A CN 104031936 A CN104031936 A CN 104031936A CN 201410267627 A CN201410267627 A CN 201410267627A CN 104031936 A CN104031936 A CN 104031936A
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李哲
毕政鸿
戴雪梅
黄华孙
林位夫
周建南
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Abstract

本发明公开了一种转AtWUS基因促进橡胶树(Heveabrasiliensis)侧芽发生的方法，采用拟南芥(Arabidopsisthaliana)WUS(WUSCHEL)基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织进行遗传转化、得到转基因材料，促进了橡胶树侧芽发生，并形成侧枝，验证了AtWUS基因的功能，表明WUS基因对橡胶树侧芽发生、侧枝形成起着重要作用，所取得的侧芽、侧枝有实际应用的潜力。本发明根据植物干细胞决定基因WUS对植物分生组织起关键作用、并促进体细胞胚发生和/或器官发生的性质，利用农杆菌介导法，构建植物表达载体，把AtWUS基因转入橡胶树愈伤组织，得到转基因材料，以期促进橡胶树体细胞胚发生或器官发生，促进形成再生植株或芽条的能力，从橡胶树基因工程这一条新途径服务于应用和生产。

Description

一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法。
背景技术
植物体细胞胚发生和器官发生是极其复杂的过程。近年来的研究表明，众多基因参与了植物体细胞胚发生的调控，其中WUS(WUSCHEL)基因是一个典型的干细胞决定基因。1996年Laux等利用EMS诱变技术鉴定了WUS，发现其基因突变体影响着顶端分生组织和花分生组织的发育，由此推断WUS在顶端分生组织和花分生组织中起着关键性的作用，并维持着结构和功能的统一。Mayer等研究发现WUS编码291个氨基酸，是同源域蛋白(homeodomainprotein)中的一个新亚型。在植物胚胎发育过程中，WUS基因在16细胞胚的中央4个细胞中表达，鱼雷胚时期表达区域下移到第3层细胞，而在胚晚期以及胚后茎尖分生组织中，WUS在第3层细胞之下表达。在顶端分生组织中，干细胞组织中心表达的WUS决定其上的细胞成为干细胞，而由干细胞所表达的CLV3蛋白通过细胞间隙移动到干细胞组织中心的周边，通过WUS/CLV3之间的反馈调节环来完成器官的启动和干细胞的维持。Zuo等(2002)用T-DNA标签法筛选出pga6突变体，用一种化学诱导的激活标签系统鉴定了拟南芥PGA6基因的两个等位基因，当它们被诱导过度表达时，在不添加任何外部激素的情况下，所有被检测的组织和器官高频率地形成体细胞胚。当诱导剂取消时，所有这些体细胞胚可以直接萌发成可育的成年植株。经分析PGA6与WUSCHEL(WUS)相同。研究结果表明WUS/PGA6在体细胞胚发生过程中也有关键作用，可能是通过促进营养性向胚性的转变、和/或保持胚性干细胞的性质而起作用的。
Li等(2004)用含有35S-35S-WUS的植物表达载体pBKB转化烟草使WUS基因增强表达，结果转基因烟草地上部分出现许多异常的细胞分裂和异位器官发生，形成许多突起，扫描电子显微镜分析表明突起由许多小而密集的细胞组成，类似分生组织细胞；部分突起能够发育成分生组织或花芽，表明WUS基因与器官发生有关。Arroyo-Herrera等(2008)利用诱导型启动子将WUS基因转入咖啡中诱导WUS基因的超表达，结果体细胞胚的发生提高了4倍。
天然橡胶是国家重要战略资源，天然橡胶的主要来源是橡胶树(Heveabrasiliensis)，橡胶树组织培养体细胞胚发生和植株再生是橡胶树生物技术研究的重要内容。当前，从橡胶树组织培养高频率地得到再生植株仍然存在着困难。植物体细胞胚发生和器官发生重要基因的分子机理研究为橡胶树组织培养植株再生的遗传性状改良提供了一条新的途径。目前生产上橡胶树种植主要是用芽接树，用生产上表现性状良好的母本植株的芽条作为接穗，以实生苗作为砧木进行嫁接。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，以解决橡胶树组织培养过程中侧芽发生难的问题，所取得的侧芽、侧枝有实际应用于嫁接的潜力。
本发明实施例是这样实现的，一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，该转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括：
步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；
步骤二，根据uidA基因瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；
步骤三，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有一定Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；
步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；
步骤五，组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)，结果表明外源基因AtWUS已整合入橡胶树植株基因组中，得到了转基因植株。
进一步，步骤一具体包括：
称取0.5克拟南芥新鲜叶片，提取拟南芥RNA，采用Transtart IIFirst-strandcDNAsynthesissupermix试剂盒合成cDNA，根据NCBI中登录号为NM_127349的AtWUS基因ORF设计一对特异引物，上游引物为WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物为WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一个BamHI和SacI酶切位点；
以合成的AtWUScDNA为模版，WF、WR为特异引物，用聚合酶链式反应扩增AtWUS基因，PCR产物通过琼脂糖凝胶1.0％电泳和凝胶成像系统的观察，切下预期大小的目的片段，称重，然后用WizardDNAClean-UpKit回收纯化目的片段，用pEASY-T1CloningKit对目的片段进行TA克隆，16℃过夜连接，得到pEASY-T1克隆载体连接反应液；
制备大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，在冰上按照100μL/管分装，取出1管大肠杆菌感受态细胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆载体连接反应液，以转化E.coliJM109感受态细胞；
挑选固体培养基上的几个单菌落分别以WF和WR为引物，挑选的菌体为模板，2×EasyTaqPCRSuperMix进行PCR，对转化重组子进行PCR检测，提取大肠杆菌质粒DNA，用BamHI和SacI双酶切，以鉴定菌落PCR阳性重组子，将PCR阳性克隆的菌液送往深圳华大基因公司进行测序检测；
中间植物表达载体pCAMBIA2301-uidA的构建：分别用HindIII2.0μL和EcoRI2.0μL双酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA两载体，分别回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，将回收的两片段用T4-DNAligase1.0μL连接，重组子进行双酶切检测；
植物表达载体pCAMBIA2301-AtWUS的构建：用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分别回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌JM109；对重组子进行双酶切检测。
进一步，在步骤二中，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件为：预培养时间为0天，菌液浓度为OD600＝0.7，AS浓度为200μM，侵染时间为7min，共培养温度为25℃，共培养时间为5天。
进一步，在步骤二中，橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基(改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2250mg/L，MnSO4·H2O35mg/L，CuSO4·5H2O0.2mg/L)，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min，易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃；
进一步，在步骤三中，在含有0,25,50,100,125,150,200mg/L等7个不同Kan浓度的继代增殖培养基中对愈伤组织进行28天的培养，根据公式(W2-W1)/W1，计算愈伤组织的净增鲜重，研究结果表明：100～125mg/L的Kan对经过侵染的橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织筛选效果较好，所以选用此浓度进行筛选。
进一步，在步骤五中，组织化学检测、分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)结果表明外源基因AtWUS已整合入橡胶树植株基因组中，得到了转基因植株，转基因材料子叶基部出现许多芽状突起，继而形成侧芽，侧芽长大形成侧枝。
本发明提供的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，采用拟南芥AtWUS基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织进行遗传转化，得到转基因材料，促进了橡胶树侧芽发生，并形成侧枝，验证了AtWUS基因的功能，表明WUS基因对橡胶树侧芽发生、侧枝形成起着重要作用，所取得的侧芽、侧枝有实际应用的潜力。本发明根据植物干细胞决定基因WUS对植物分生组织起关键作用、并促进体细胞胚发生和/或器官发生的性质，利用农杆菌介导法，构建植物表达载体，把AtWUS基因转入橡胶树外植体，得到转基因材料，以期促进橡胶树体细胞胚发生或器官发生，促进形成再生植株或芽条的能力，从橡胶树基因工程这一条新途径服务于应用和生产。
附图说明
图1是本发明实施例提供的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括以下步骤：
S101：拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；
S102：根据uidA基因瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；
S103：以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有一定Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；
S104：抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性(蓝色)的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；
S105：组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)，分子检测结果表明外源基因AtWUS已整合入橡胶树植株基因组中，得到了转基因植株。
在步骤S102中，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件为：预培养时间为0天，菌液浓度为OD600＝0.7，AS浓度为200μM，侵染时间为7min，共培养温度为25℃，共培养时间为5天。
在步骤S105中，组织化学检测、分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)结果表明得到了转基因植株，转基因材料子叶基部出现许多芽状突起，继而形成侧芽，侧芽长大形成侧枝。
本发明的具体步骤为：
步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；
称取0.5克拟南芥新鲜叶片，提取拟南芥RNA，采用Transtart IIFirst-strandcDNAsynthesissupermix试剂盒合成cDNA，根据NCBI中登录号为NM_127349的AtWUS基因ORF设计一对特异引物，上游引物为WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物为WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一个BamHI和SacI酶切位点；
以合成的AtWUScDNA为模版，WF、WR为特异引物，用PCR(聚合酶链式反应)扩增AtWUS基因，PCR产物通过琼脂糖凝胶(1.0％)电泳和凝胶成像系统的观察，切下预期大小的目的片段，称重，然后用WizardDNAClean-UpKit回收纯化目的片段，用pEASY-T1CloningKit对目的片段进行TA克隆，16℃过夜连接，得到pEASY-T1克隆载体连接反应液；
制备大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，在冰上按照100μL/管分装，取出1管大肠杆菌感受态细胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆载体连接反应液，以转化E.coliJM109感受态细胞；
挑选固体培养基上的几个单菌落分别以WF和WR为引物，挑选的菌体为模板，2×EasyTaqPCRSuperMix进行PCR，对转化重组子进行PCR检测，提取大肠杆菌质粒DNA，用BamHI和SacI双酶切，以鉴定菌落PCR阳性重组子，将PCR阳性克隆的菌液送往深圳华大基因公司进行测序检测；
中间植物表达载体pCAMBIA2301-uidA的构建：分别用HindIII(2.0μL)和EcoRI(2.0μL)双酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA两载体，分别回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，将回收的两片段用T4-DNAligase(1.0μL)连接，重组子进行双酶切检测；
植物表达载体pCAMBIA2301-AtWUS的构建：用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分别回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌JM109；对重组子进行双酶切检测；
步骤二，根癌农杆菌介导的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化的影响因素的研究；
用橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织作为转化受体材料，侵染所用的根癌农杆菌菌株为EHA105，植物表达载体为pCAMBIA2301-AtWUS，载体上包含了由CaMV355启动子驱动的β-葡糖醛酸酶基因uidA(用于组织化学染色鉴定)、新霉素磷酸转移酶基因nptII(用于卡那霉素抗性筛选)；
根癌农杆菌介导遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织各培养基成分及根癌农杆菌培养所用培养基见表1；
表1：橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分
*AAM培养基具体成分见附表1,
橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基(改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2250mg/L，MnSO4·H2O35mg/L，CuSO4·5H2O0.2mg/L)，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min，易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃；
取适量的易碎胚性愈伤组织按正交设计表格L25(56)要求进行实验，影响因素包括：预培养天数、菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度、农杆菌侵染时间、共培养温度、共培养时间，通过进一步的分析得出了各个因子的最佳水平，确定橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件为：预培养时间为0天，菌液浓度为OD600＝0.7，AS浓度为200μM，侵染时间为7min，共培养温度为25℃，共培养时间为5天；
步骤三，橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织对卡那霉素(kanamycin,Kan)敏感性研究，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有一定Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；
在含有0,25,50,100,125,150,200mg/L等7个不同Kan浓度的继代增殖培养基中对愈伤组织进行28天的培养，根据公式(W2-W1)/W1，计算愈伤组织的净增鲜重(倍)，研究结果表明：100～125mg/L的Kan对经过侵染的橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织筛选效果较好，所以选用此浓度进行筛选；
步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，再将它们转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从热研88-13愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株，橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分见表1；
步骤五，组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测，组织化学检测、分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)结果表明得到了转基因植株，转基因材料子叶基部出现许多芽状突起，继而形成侧芽，侧芽长大形成侧枝。
结合本发明的实施例对本发明做进一步的说明：
实施例1：
1)拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；
称取0.5克拟南芥新鲜叶片，提取拟南芥RNA，采用Transtart IIFirst-strandcDNAsynthesissupermix试剂盒合成cDNA，根据NCBI中登录号为NM_127349的AtWUS基因ORF设计一对特异引物，上游引物为WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物为WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一个BamHI和SacI酶切位点；
以合成的AtWUScDNA为模版，WF、WR为特异引物，用PCR(聚合酶链式反应)扩增AtWUS基因，PCR产物通过琼脂糖凝胶(1.0％)电泳和凝胶成像系统的观察，切下预期大小的目的片段，称重，然后用WizardDNAClean-UpKit回收纯化目的片段，用pEASY-T1CloningKit对目的片段进行TA克隆，16℃过夜连接，得到pEASY-T1克隆载体连接反应液；
制备大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞，在冰上按照100μL/管分装，取出1管大肠杆菌感受态细胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆载体连接反应液，以转化E.coliJM109感受态细胞；
挑选固体培养基上的几个单菌落分别以WF和WR为引物，挑选的菌体为模板，2×EasyTaqPCRSuperMix进行PCR，对转化重组子进行PCR检测，提取大肠杆菌质粒DNA，用BamHI和SacI双酶切，以鉴定菌落PCR阳性重组子，将PCR阳性克隆的菌液送往深圳华大基因公司进行测序检测；
中间植物表达载体pCAMBIA2301-uidA的构建：分别用HindIII(2.0μL)和EcoRI(2.0μL)双酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA两载体，分别回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，将回收的两片段用T4-DNAligase(1.0μL)连接，重组子进行双酶切检测；
植物表达载体pCAMBIA2301-AtWUS的构建：用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分别回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌JM109；对重组子进行双酶切检测；
2)根癌农杆菌介导的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化的影响因素的研究：
用本实验室的橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织作为转化受体材料，侵染所用的根癌农杆菌菌株为EHA105，植物表达载体为pCAMBIA2301-AtWUS，载体上包含了由CaMV355启动子驱动的β-葡糖醛酸酶基因uidA(用于组织化学染色鉴定)、新霉素磷酸转移酶基因nptII(用于卡那霉素抗性筛选)；
橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基(改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2250mg/L，MnSO4·H2O35mg/L，CuSO4·5H2O0.2mg/L)，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min，易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃；
取适量的易碎胚性愈伤组织按正交设计表格L25(56)要求进行实验，实验设计及处理见表2：
表2 L25(56)正交实验因素及水平
以下为根癌农杆菌介导的橡胶树易碎胚性愈伤组织转化的正交
实验方案表L25(56)：
表3 遗传转化的正交设计表L25(56)
注：预培养基为M培养基去除氯化钙后的培养基，
按照正交设计表，共做25个处理，每个处理2次重复，采用SAS9.0软件进行方差分析，从SAS运算结果得知，实验6因子都达极显著，所以通过进一步的分析得出了各个因子的最佳水平，确定橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件为：预培养时间为0天，菌液浓度为OD600＝0.7，AS浓度为200μM，侵染时间为7min，共培养温度为25℃，共培养时间为5天；
3)橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织对卡那霉素(kanamycin,Kan)敏感性研究，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有一定Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；
在含有0,25,50,100,125,150,200mg/L等7个不同Kan浓度的继代增殖培养基中对愈伤组织进行28天的培养，根据公式(W2-W1)/W1，计算愈伤组织的净增鲜重(倍)，研究结果表明：橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在不同Kan浓度的继代培养基中都受到不同程度的抑制，在50～75mg/LKan浓度下愈伤生长几乎未受到抑制，色泽和对照组一样比较鲜黄；但在添加有100mg/LKan的M培养基中，愈伤组织增长速度受到影响的程度较大，愈伤组织生长缓慢，色泽也稍稍变暗；当Kan浓度提高至125mg/L时，愈伤组织生长受到严重影响，生长非常缓慢，颜色暗黄，但是愈伤组织并没有表现出褐化死亡的现象；在含有150mg/L、200mg/LKan的培养基里的愈伤组织状态和含有125mg/LKan的培养基里的愈伤组织状态相似，说明橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan的抑制作用不是很敏感，本发明采用100～125mg/L的Kan对侵染的橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织进行筛选；
4)抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，再将它们转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从热研88-13愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株，橡胶树组织培养和遗传转化中使用的培养基及成分见表1；
5)组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测，组织化学检测、分子检测(PCR检测、PCR产物测序分析、Southern杂交)结果表明得到了转基因植株，转基因材料子叶基部出现许多芽状突起，继而形成侧芽，侧芽长大形成侧枝。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，该转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法包括：
步骤一，拟南芥AtWUS基因克隆和植物表达载体构建，克隆拟南芥AtWUS基因，构建pCAMBIA2301-35s-AtWUS植物表达载体；
步骤二，根据β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)瞬时表达率的多少和细胞存活率的高低，结合影响根癌农杆菌遗传转化的相关因素，相关因素包括预培养时间、菌液浓度、乙酰丁香酮AS浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度，设计实验，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件；
步骤三，以橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织在含有Kan浓度梯度的继代增殖培养基中的生长速率为指标，测定热研88-13易碎胚性愈伤组织对Kan敏感浓度为100～125mg/L，用于抗性愈伤组织的筛选；
步骤四，抗性愈伤组织、胚状体和再生植株的获得，共培养结束后，将热研88-13易碎胚性愈伤组织转入抑菌培养基中进行抑菌处理，18天后，转移到卡那霉素为100～125mg/L的筛选培养基中，经过4个月的筛选，长出鲜黄色的抗性愈伤组织，把经过GUS染色为阳性的愈伤组织增殖1～2个月后诱导胚状体和植株再生，结果从热研88-13获得了5个抗性易碎胚性愈伤组织系，从抗性愈伤组织共诱导出了843个胚状体，21株拟转化植株；
步骤五，组织化学检测和分子检测，切取14株热研88-13抗性拟转化植株的子叶进行GUS染色，结果有6株呈蓝色阳性，并且阳性植株具有一定表型特征，选取7株热研88-13抗性植株和3株对照一起进行分子检测。
2.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，步骤一具体包括：
称取0.5克拟南芥新鲜叶片，提取拟南芥RNA，采用Transtart IIFirst-strandcDNAsynthesissupermix试剂盒合成cDNA，根据NCBI中登录号为NM_127349的AtWUS基因ORF设计一对特异引物，上游引物为WF:5‘CGGGATCCCGATGGAGCCGCCACAGC3’，下游引物为WR：5‘GCGAGCTCGCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAGAGAAG3’，在上下游引物5‘端各加一个BamHI和SacI酶切位点；
以合成的AtWUScDNA为模版，WF、WR为特异引物，用聚合酶链式反应扩增AtWUS基因，PCR产物通过琼脂糖凝胶1.0％电泳和凝胶成像系统的观察，切下预期大小的目的片段，称重，然后用WizardDNAClean-UpKit回收纯化目的片段，用pEASY-T1CloningKit对目的片段进行TA克隆，16℃过夜连接，得到pEASY-T1克隆载体连接反应液；
制备大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞，在冰上按照100μL/管分装，取出1管大肠杆菌感受态细胞置于冰上，待溶解后加入5.0μlpEASY-T1克隆载体连接反应液，以转化E.coliJM109感受态细胞；
挑选固体培养基上的几个单菌落分别以WF和WR为引物，挑选的菌体为模板，2×EasyTaqPCRSuperMix进行PCR，对转化重组子进行PCR检测，提取大肠杆菌质粒DNA，用BamHI和SacI双酶切，以鉴定菌落PCR阳性重组子，将PCR阳性克隆的菌液送往深圳华大基因公司进行测序检测；
中间植物表达载体pCAMBIA2301-uidA的构建：分别用HindIII2.0μL和EcoRI2.0μL双酶切pCAMBIA2301-MCS和pBI121-uidA两载体，分别回收pCAMBIA2301-MCS大片段和pBI121-uidA小片段，将回收的两片段用T4-DNAligase1.0μL连接，重组子进行双酶切检测；
植物表达载体pCAMBIA2301-AtWUS的构建：用BamHI和SacI分别双酶切pCAMBIA2301-uidA和pEASY-T1-AtWUS；分别回收pCAMBIA2301-uidA大片段和pEASY-T1-AtWUS小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；将连接产物转化大肠杆菌JM109；对重组子进行双酶切检测。
3.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，在步骤二中，确定橡胶树连续继代易碎胚性愈伤组织遗传转化的优化条件为：预培养时间为0天，菌液浓度为OD600＝0.7，AS浓度为200μM，侵染时间为7min，共培养温度为25℃，共培养时间为5天。
4.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，在步骤二中，橡胶树愈伤组织培养培养基为经改良的MS培养基，改良成份为MgSO4·7H2O500mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2250mg/L，MnSO4·H2O35mg/L，CuSO4·5H2O0.2mg/L，再添加不同的其他培养基成分，pH值为5.8，在0.2MPa压力、121℃条件下高温高压灭菌20min，易碎胚性愈伤组织继代增殖培养、胚状体诱导均采用暗培养，植株再生在光照条件下进行，培养温度均为25～27℃。
5.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，在步骤三中，组织化学检测、分子检测结果表明外源基因AtWUS已整合入橡胶树植株基因组中，得到了转基因植株，转基因材料子叶基部出现许多芽状突起，继而形成侧芽，侧芽长大形成侧枝。
6.如权利要求1所述的转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法，其特征在于，在步骤三中，在含有0,25,50,100,125,150,200mg/L7个不同Kan浓度的继代增殖培养基中对愈伤组织进行28天的培养，根据公式(W2-W1)/W1，计算愈伤组织的净增鲜重，结果表明：100～125mg/L的Kan对经过侵染的橡胶树品种热研88-13易碎胚性愈伤组织筛选效果较好，所以选用此浓度进行筛选。
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