CN105177008B - 玉米ⅱ型h+-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米Ⅱ型H⁺‑焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用，其中所述缺失突变体是位于玉米II型H⁺‑焦磷酸酶基因(ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的连续碱基序列，该缺失突变体命名为玉米Ⅱ型H⁺‑焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8；所述玉米Ⅱ型H⁺‑焦磷酸酶基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。实验证实，本发明的D8启动子能够启动下游基因在转基因植物受体中较高水平表达，且具有明显的盐和干旱胁迫诱导特性，在植物耐盐、抗旱基因工程育种中具有很好的应用价值。

Description

玉米Ⅱ型H+-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用

技术领域

本发明归属于植物基因工程和分子生物学技术领域，尤其涉及一种玉米Ⅱ型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8及其应用。

背景技术

植物生长发育中经常遭受逆境胁迫，其中干旱、高盐等已成为限制农业发展的重要因素。据《中国水旱灾害公报》统计，每年我国有1200万公顷以上的耕地遭受不同程度的干旱胁迫，造成粮食减产约200多亿公斤，占农作物减产总量的60％以上；在我国16亿亩耕地中，盐碱地约占1亿多亩，并且呈现逐年增加趋势。发掘并克隆重要功能基因和调控元件，采用转基因技术培育作物抗逆新品种是保证粮食高产、稳产的有效措施。

近年来，我国已经克隆了一批抗逆基因并用于作物转化，相对而言我国具有自主知识产权的启动子的种类及数量较少，尚不能满足多基因转化的需求。目前国内外用于作物遗传转化的启动子主要是一些组成型启动子，如玉米泛素(Ubiquitin)基因启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和水稻肌动蛋白(Actin)基因启动子。这些启动子调控目标基因在所有组织中表达，且没有时空限制，导致大量目标蛋白在不需要的细胞或发育阶段大量累积，时常造成转基因作物的形态和生理功能异常等，例如Nakashima等利用玉米Ubiquitin启动子在水稻中过表达OsNAC6基因，转基因水稻的抗逆性提高，但同时也导致其植株生长期延长，产量降低。

植物正常的生长发育需要基因的特异性表达，基因的表达调控可发生在染色体、转录、转录后等多个层次水平，其中转录水平上的调控是基因表达调控的一个关键环节，通过顺式作用元件与反式作用因子互作实现。启动子是包含多个顺式作用元件，起始并调控基因转录的一段DNA序列，在基因转录的精确起始和转录效率调控方面发挥重要作用。随着对转基因植物生物安全性要求的提高，同时植物生长发育调控也需要目标基因的特异性表达，诱导型和组织特异型启动子已备受关注。组织特异性启动子可调控目标基因的转录一般只发生在某些特定的器官或组织中，诱导型启动子可根据需要在植物特定的发育阶段或特定的生长环境下快速启动基因转录，即根据植物的实际需求实现目标基因的时空或组织特异性表达，在植物转基因育种中展现出了广阔的应用前景。尽管组织特异性和诱导型启动子与组成型启动子相比在外源基因的精准表达调控方面体现出了独特的优势，但鉴于我国具有自主知识产权的胁迫诱导性启动子资源匮乏，且对其启动子序列上的顺式作用元件缺乏系统的了解，限制了我们对其有效利用，目前已成为作物转基因抗逆遗传改良的瓶颈之一。因此，发掘并分离胁迫诱导型启动子，筛选鉴定其核心功能区段及特异性调控序列具有重要意义。

H⁺-焦磷酸酶是一种与H⁺-ATPase不同的H⁺转运酶，在植物、藻类和光合细菌中广泛存在。植物中H⁺-焦磷酸酶多定位于液泡膜上，其主要功能是利用水解焦磷酸产生的自由能将H⁺从胞质转运到液泡中，起到质子泵的作用，为物质的跨液泡膜运输提供能量，同时起到酸化液泡的作用。已有的研究表明该酶参与植物逆境胁迫响应及生长发育调节。根据H⁺-焦磷酸酶对金属离子的敏感性差异，将其分为两类：一类是对K⁺敏感而对Ca²⁺不敏感的I型H⁺-焦磷酸酶；另一类是对Ca²⁺敏感而对K⁺不敏感的II型H⁺-焦磷酸酶。Sarafian等(1992年)首次克隆了拟南芥AVP1基因，是I型H⁺-焦磷酸酶的典型代表。目前对I型H⁺-焦磷酸酶的研究较多，已从多种植物中克隆出了该酶，其氨基酸序列具有高度相似性，可达到80％以上，该酶广泛参与植物的抗逆性。Carystinos等(1995年)报道水稻I型H⁺-焦磷酸酶基因在缺氧和冷胁迫下转录水平显著上调，解除胁迫后该基因的表达随之恢复至正常水平。Wang等(2001年)用400 mM NaCl处理盐地碱蓬发现其I型H⁺-焦磷酸酶的活性受到显著影响。Guo等(2006年)在拟南芥中过表达碱蓬I型H⁺-焦磷酸酶基因SsVP导致其耐盐、抗旱性显著提高。Gao等(2006年)从盐芥中克隆了I型H⁺-焦磷酸酶基因，命名为TsVP，在烟草中过表达该基因导致其耐盐和抗寒能力显著提高。Li等(2008年)在玉米中过表达盐芥TsVP基因，转基因玉米的耐旱性得到显著的提高。

与I型H⁺-焦磷酸酶相比，II型H⁺-焦磷酸酶的研究相对较少。Oberbeck等(1994年)利用免疫电镜技术在玉米根细胞高尔基体上发现了II型H⁺-焦磷酸酶的存在，但其基因未被克隆。 Drozdowicz等(2000年)从拟南芥中克隆了第一个II型H⁺-焦磷酸酶基因(AVP2)，与拟南芥 I型H⁺-焦磷酸酶的序列相似度仅为35％，Mitsuda等(2001年)发现其定位于高尔基体膜上。本实验室的岳桂东等(2008年)从玉米中克隆了II型H⁺-焦磷酸酶基因ZmVP2(Genebank accession：EF051578.1)，其编码的氨基酸序列具有H⁺-焦磷酸酶的保守结构域，与拟南芥II 型H⁺-焦磷酸酶的氨基酸序列相似性为89％，但与玉米I型H⁺-焦磷酸酶的氨基酸序列相似度仅为39％，转录表达分析表明该基因受干旱、高盐等逆境胁迫的显著诱导，且表达丰度较高。基因的转录表达与启动子密切相关，克隆ZmVP2的启动子序列，分析其高盐和干旱胁迫响应特性，发掘该启动子的核心功能区段及胁迫响应元件具有重要理论意义和很好的应用前景。

发明内容

针对目前的研究现状，本发明主要解决的问题是提供一种可用于植物基因工程育种的高盐和干旱胁迫诱导性的玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8及其应用。

本发明所述的玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体是位于玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的连续碱基序列，该缺失突变体命名为玉米Ⅱ型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8；其中所述玉米Ⅱ型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因的启动子序列是从水分胁迫下苗期玉米叶片的抑制性消减文库中筛选并首先克隆了ZmVP2基因的cDNA序列，利用该cDNA序列在NCBI数据库中与玉米高通量基因组数据进行BLAST比对，获取的ZmVP2基因5’端上游1468bp的核苷酸序列，其为高盐和干旱胁迫诱导型启动子。

利用启动子在线分析软件PLANTCARE和PLACE对ZmVP2基因的启动子序列进行分析，发现在该启动子1468bp序列上存在35个可能起作用的顺式元件，包括光响应元件、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温等逆境胁迫响应元件等(见附图1)。依据上述分析结果及碱基序列，设计ZmVP2启动子5′系列缺失突变体引物，同时在上下游引物的5′端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，利用PCR扩增获得不同长度的启动子缺失片段，利用两端的酶切位点将启动子系列缺失片段定向连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，构建ZmVP2启动子的系列缺失植物表达载体(见附图2中D1～D9启动子片段与GUS基因的连接示意图，ATG中的A为+1)。将上述构建好的植物表达载体导入大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序确认，鉴定正确后将上述质粒分别命名为：D1、D2、D3、 D4、D5、D6、D7、D8和D9，其中D1为ZmVP2全长启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；缺失突变体D8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述用于构建ZmVP2启动子5’端系列缺失突变体的核酸序列可为全长启动子序列D1；亦可为该启动子的片段序列D2-D9；也可为人工修饰改造后仍具有类似该启动子活性的碱基序列。

将上述D1-D9质粒导入农杆菌GV3101中，鉴定正确后用于后续烟草或玉米等作物的遗传转化。

鉴于从事相关研究的本领域专业人员很容易通过定向进化或者点突变等方法对本发明中所表述的启动子及其缺失突变体的碱基序列进行突变，那些经过人工修饰改造但具有与本发明中提供的启动子片段核酸序列同源性≧60％且仍具有启动子活性的碱基序列均视为本发明所述启动子核苷酸序列衍生物，等同于本发明所述序列，属于本专利保护的范畴。

含有上述启动子及其缺失片段的重组载体、转基因细胞系、重组菌和转基因植株均属于本专利保护范围之内。

本发明所描述的玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子及其缺失突变体D8在提高植物抗逆育种中的应用。

其中：所述的提高植物抗逆育种是通过利用玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体D8在植物体内启动抗逆基因的表达实现；其中，所述植物抗逆是指植株在器官、组织、细胞或整株水平上表现出的抗旱或耐盐特征或其组合，所述植物是指双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物是指小麦、棉花、大豆或烟草；所述单子叶植物是指玉米或水稻。

本发明是利用实验室已经克隆的玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)的cDNA序列与 NCBI数据库中的玉米高通量基因组数据进行BLAST，最终获得该基因5′端上游1468bp的碱基序列作为全长启动子D1，以此核苷酸序列为模板设计5′端系列缺失引物，PCR扩增得到不同长度的启动子缺失片段D2-D9，将其分别连入植物表达载体pCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，通过农杆菌介导的遗传转化法转化本生烟草。

具体来讲，是将H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)全长启动子D1及不同长度的缺失片段D2-D9 分别构建植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法转化本生烟草，转化叶盘在含有潮霉素的培养基上诱导和筛选抗性细胞、分化小苗。分化的小苗进一步经PCR检测和GUS组织化学染色鉴定，两者均为阳性的植株收获后代种子进行繁代，后代进行遗传学分析，根据其分离比筛选出T2/T3代单拷贝纯合株系用于后续实验。

通过对D1-D9转基因烟草进行高盐和干旱胁迫处理实验，明确了D1及其缺失突变体 D2-D8为高盐和干旱胁迫诱导型启动子。其中D8序列仅219bp，在D1-D9中启动子活性最高 (见附图3)，并且能够赋予目的基因在转化的细胞中具有明显的高盐和干旱胁迫诱导特性 (见附图4和5)，为具有较高启动基因表达活性的高盐和干旱胁迫诱导性启动子。

D8与D9之间的80bp(-219至-140bp)序列是ZmVP2启动子具有高盐和干旱胁迫响应特性的关键序列，将该80bp序列连接至mini35S启动子前边启动GUS基因的表达，瞬时转化本生烟草叶片，检测高盐和干旱胁迫前后GUS基因的表达强度，发现该80bp序列足以赋予mini35S启动子高盐和干旱胁迫诱导特性，进一步证明了该80bp序列足以赋予D1-D8启动子高盐和干旱胁迫诱导活性(见附图6)。

将筛选获得的D8启动子片段转入玉米中，潮霉素筛选、PCR检测和GUS组织化学染色筛选出阳性植株，连续自交结实获得纯合系种子用于后续的基因表达分析。检测D8启动子调控下的GUS表达模式，明确D8在玉米中也能够高效驱动目的基因的表达。对D8转基因玉米进行高盐和干旱胁迫处理，可显著提高GUS基因的表达水平，表明D8启动子片段是高盐和干旱胁迫诱导型高表达启动子，在玉米抗逆育种中具有很好的应用前景。

综上所述，在本发明中公开了玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子D1的序列，构建了启动子5′系列缺失植物表达载体D2-D9，检测D1-D9在转基因烟草中启动GUS报告基因的特性，确定了D8具有较高的启动子活性，且具有明显的高盐和干旱胁迫诱导特性。进一步在转基因玉米中检验D8启动子的特性，发现D8在玉米中也能够很好地发挥功能，是高盐和干旱胁迫诱导性高表达启动子。本发明的主要价值和效果体现在以下几个方面：

1)为植物耐盐、抗旱转基因育种提供胁迫诱导性启动子D8，该类启动子正是作物耐盐、抗旱遗传改良中所需要的。

2)D8启动子在正常环境下维持基因表达在相对较低的水平，而在植物受到高盐或干旱胁迫时可提高抗逆基因的表达达到正常条件下的2倍以上，以提高植物的抗逆性，因此该D8 启动子可在一定程度上实现抗逆基因的“适时”表达，在提高植株抵抗外界不良环境的能力的同时减少宿主细胞不必要的能量浪费和对植株正常生长的影响，以促进胁迫条件下作物产量的形成。

3)D8启动子不仅具有高盐和干旱胁迫诱导特性和较高的启动基因表达能力，而且其序列仅有219bp，便于基因的重组和植物的遗传转化。

4)D8与D9之间的80bp碱基序列中含有未被报道的高盐或干旱胁迫响应顺式作用元件，该序列可为以后人工改造和创制新的启动子提供有用资源。

附图说明

图1：玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的碱基序列及生物信息学分析结果。

图2：不同长度的ZmVP2启动子片段与GUS报告基因的连接示意图(ATG中的A为+1)。

图3：正常条件下D1-D9转基因本生烟草叶片的GUS酶活测定结果。

图4：盐胁迫处理前后D1-D9转基因烟草植株GUS酶活测定结果。

图5：干旱胁迫处理前后D1-D9转基因烟草植株GUS酶活测定结果。

图6：筛选获得的80bp(-219至-140bp)序列的盐/干旱胁迫诱导活性验证。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅限于以下具体实施例。下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。

实施例1：ZmVP2启动子序列的克隆

1)实验室从水分胁迫下苗期玉米叶片的抑制性消减文库中筛选并克隆了ZmVP2基因的 cDNA序列，此序列已经提交至GenBank database(Genebank accession：EF051578.1)。

2)利用ZmVP2基因的cDNA序列在玉米高通量基因组数据库中进行Nucleotideblast分析，获得ZmVP2基因起始密码子ATG上游约1.5kb的核酸序列用于该启动子克隆的引物设计与筛选。

3)依据上述序列，利用PRIMER5.0设计PCR引物。上游引物为5'CCTGACTTAATCGCAC3'；下游引物为5'GATGGAATATGAGTTTG 3'。

4)采用CTAB法提取玉米基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南Ⅲ》，以提取的DNA 为模板进行PCR，反应体系如下：

PCR反应体系为10mM Tris·Cl，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，200μM dNTP each，0.8μM引物，0.625U高保真DNA polymerase，1μL模板，无菌水补足25μL。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，35个循环；最后72℃延伸5分钟。

5)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收目的条带，凝胶回收具体步骤参见其说明书。利用全式金公司的基因克隆试剂盒将目的片段连接到pEASY-B 克隆载体上转化Trans-1感受态大肠杆菌(试剂盒配套菌株)，具体参照试剂盒说明书进行。向转化的大肠杆菌管中加入约1ml LB培养基37℃ 200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心 5min收菌涂板，涂板用的培养基中含有50mg/L的Kan(用于筛选阳性克隆),其表面均匀涂布有IPTG和X-gal，进行蓝白斑筛选。

6)挑取6-8个白色克隆，在含有50mg/L Kan的LB液体培养液中震荡培养过夜，次日提取质粒并进行酶切鉴定，质粒的提取参见《分子克隆实验指南Ⅲ》24—28页，酶切鉴定按照Ferments公司的酶的说明书进行。酶切正确的质粒送交上海生工测序确认，进一步确认该克隆的正确性。

实施例2：ZmVP2全长启动子及缺失突变体的植物表达载体构建和大肠杆菌及农杆菌的转化

1)利用PLANTCARE和PLACE启动子在线分析软件对ZmVP2的全长启动子序列进行生物信息学分析，发掘其序列上可能存在的顺式作用元件。

2)依据生物信息学分析结果及其全长启动子序列，利用primer5.0软件设计ZmVP2全长启动子及系列缺失突变体的引物，共9对，同时引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，以便于后续的质粒重组。上游引物分别为5′-CCCAAGCTTCCTGACTTAATCGC AC-3′； 5′-CCCAAGCTTTTTGTTGGGCTTAGTG-3′；5′-CCCAAGCTTGCTTCG TTGCTGCCTT-3′； 5′-CCCAAGCTTTCGT GAA ATCAAGTGG-3′；5′-CCCAAGC TTTAGAATCGCTACTTGC-3′； 5′CCCAAGCTTCTACTGCCATTGTCAC-3′；5′-C CCAAGCTTAGAAGGTGTCTGGGTA-3′； 5′-CCCAAGCTTGTAGGCTTGACG G CAA-3′；5′-CCCAAGCTTGTGTTTAACTTTTAGG-3′。下游引物为 5′-CCGGAA TTCGATGGAATATGAGTTTG-3′。

3)以含全长启动子序列的质粒为模板，PCR扩增获得不同长度的启动子片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(具体步骤参考其说明书)。

PCR反应体系：5×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)5μL，引物Ⅰ(10μM) 1μL，引物Ⅱ(10μM)1μL，dNTP(2.5mM)，2μL，高保真DNA polymerase(5U/μl)0.25μL，质粒1μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序:95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟；56℃退火1分钟；72℃延伸1.5 分钟(可依据序列长短进行适当调整)；35个循环；最后72℃延伸5分钟。

4)将目的DNA片段和表达载体pCAMBIA1391Z用HindⅢ和EcoRⅠ两种限制性内切酶进行双酶切(限制性内切酶购自Fermentas公司，具体酶切条件和程序参见说明书)。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收(具体步骤参考其说明书)。

5)将4)中获得的酶切后的目的DNA片段与载体进行连接。通常目的DNA片段与质粒载体连接时的摩尔比为3:1～5:1，连接体系如下：10×buffer 2μL，T4DNA Ligase 1μL，载体50-100ng，DNA片段与载体摩尔比对应的量，ddH2O补足至20μL。轻轻混匀，置于PCR 仪中，程序为22℃条件下10min，65℃条件下10min，10℃条件下10min。连接产物可直接用于大肠杆菌的转化。

6)大肠杆菌的转化

-70℃冰箱中取出50μL感受态大肠杆菌置于冰上，加入连接产物，轻轻混匀；冰浴30min，同时融化固体培养基，待冷却到50℃左右时加入Kan(50mg/L)，倒平板；42℃热激90s，随后迅速将小管冰浴2min；向管中加入700μL无菌的液体LB培养基(不含抗生素)混匀后放入摇床，37℃，180-200rpm，1h，使其复苏；在上述倒好的平板表面上将 100μL IPTG(0.1M)和20μLX-gal(20mg/mL)涂抹均匀，用于后续的蓝白斑筛选；复苏完，5000rpm，离心3min，将上清吸至剩余约100μL左右，轻轻用枪吹打沉淀使菌散开；将其涂布于步骤准备好的平板上，倒置平板，放入培养箱中，37℃，过夜暗培养；挑取单克隆摇菌，保菌并提取质粒进行酶切鉴定，酶切正确的质粒进一步进行测序确认。

7)农杆菌的转化

25mL YEP培养基(含利福平50mg/L)接入约100μL农杆菌GV3101，28℃，200rpm，过夜培养；次日，取2mL菌液加入到25mL含利福平50mg/L的YEP培养基中，培养至OD 值0.8左右；将菌液分装到两个7mL管中，每个5mL，置于冰上30min，在此过程中配20 mM的CaCl₂于7mL管中，混匀后放置在冰上备用；菌液5000rpm离心10min，收菌弃上清，每管加入2mL0.15mol/L NaCl(灭菌且在4℃预冷)，轻轻弹起；4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，每管加入200μL 20mmol/L的CaCl₂，轻轻弹起，混匀后合并成一管，以200μL每管分装于1.5mL离心管中；每管中加入8μL左右重组质粒，轻弹并混匀，静置冰浴30min；液氮速冻90s，迅速置入37℃水浴锅3min；加入1mL未加抗生素的YEP 培养基，28℃,180rpm复苏1h；融化YEP固体培养基，冷却至50℃左右，加入利福平和 Kan(均为50mg/L)倒平板；5000rpm，离心3min收菌涂平板，28℃，倒置暗培养约2 天；挑单克隆，鉴定正确后保菌备用。

实施例3：本生烟草的转化及转基因植株的获得

1)农杆菌介导的烟草叶盘转化的具体步骤如下：

(1)农杆菌阳性菌株过夜培养至对数生长期(OD600＝0.6左右)。

(2)5000rmp离心10分钟，菌体用相同体积的A2液体培养基悬浮。

(3)将提前培养好的烟草无菌苗叶片切割成大约2.5mm²的小块，置入A2悬浮的菌液中，浸染8-10min左右。

(4)取出叶片，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液后转移至A2固体培养基上，26℃暗培养2-3天。

(5)共培养后的叶片切块转移至含15mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的A3选择培养基上，每隔7～9天继代1次，连续筛选3代。

(6)切下抗性小芽转移至含200mg/L头孢霉素的A4培养基上壮苗。

(7)将(6)中小苗转移至A5生根培养基中诱导生根。

(8)生根小苗长到5～6厘米左右后移栽到购买的营养土中。

烟草转化用的培养基如下：

A1培养基(无菌苗培养基)：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，1％蔗糖，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A2培养基(浸染培养基)：B5培养基成分，250mg/L NH₄NO₃，3％蔗糖，0.5g/L MES，0.7％琼脂(for plate)，pH5.8-6.0；

A3培养基(诱导丛生芽培养基)：B5培养基成分，250mg/L NH₄NO₃，2％蔗糖，0.5g/LMES， 1mg/L 6-BA，0.1mg/L IAA，0.7％琼脂，pH5.8-6.0；

A4培养基(壮苗培养基)：A3培养基，去掉IAA，pH5.8-6.0；

A5培养基(生根培养基)：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，3％蔗糖，0.5g/L MES，0.7％琼脂，pH5.8-6.0。

2)转基因植株的鉴定

分化小苗移栽后首先进行PCR检测，PCR阳性植株进一步进行GUS染色鉴定，两者均为阳性的植株用于收获后代种子

(1)PCR检测

CTAB法提取烟草叶片基因组DNA：取适量叶片置于小管中，液氮冷冻后用小型DNA研磨仪研磨；加入400μL 65℃预热的2×CTAB并混匀，65℃温育40min，中间不间断混匀；取出冷至室温后加入400μL氯仿：异戊醇(24:1)的混合液抽提10min；取上清约200μL 加入含有400μL 4℃预冷的无水乙醇的1.5ml离心管中，颠倒混匀，-20℃静置30min； 12500rpm，4℃，离心10min；沉淀用70％的乙醇洗两次(第一次15min，第二次至少3h 或过夜)；DNA晾干后加适量无菌水或TE溶液，65℃水浴溶解30min以上；将提取好的DNA 置于-20℃冻存备用。

PCR反应体系：PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL；引物Ⅰ(10μM) 1μL；引物Ⅱ(10μM)1μL；dNTP(10mM)0.5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.125μL；DNA 模板1μL；ddH₂O补足至25μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸1min； 35个循环；最后72℃延伸5min。

(2)GUS组织化学染色

GUS染色液的配制：0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)0.5mL，Fe²⁺10μL，Fe³⁺10μL，Trition-100(10％)10μL，EDTA(0.5M,pH＝8.0)20μL，X-GLUC 20μL，H₂O补足至1mL。

GUS染色的具体步骤：用打孔器取适当大小的叶片，浸入上述GUS染液中；避光条件下 0.05MPa抽真空约15min；37℃染色10-16h；用70％的乙醇脱色后观察。

实施例4：D1～D9转基因烟草的GUS酶活测定

为进一步明确不同长度的启动子片段在正常条件下启动基因表达的能力，便于后续筛选 ZmVP2启动子中驱动目的基因高效表达的核心序列区段，我们以D1-D9突变体烟草叶片为材料进行了GUS酶活测定。

1)GUS酶活测定相关试剂的配制

反应缓冲液：0.1M磷酸缓冲液(pH＝7.0)50mL，10％十二烷基肌氨酸钠1mL，0.5MEDTA (pH＝8.0)2mL，10％Trition 1001mL，β-巯基乙醇100μL，水补至100mL。

10mM 4-MUG母液的配制：5mg 4-MUG加到1.42mL反应缓冲液中。

1mM 4-MUG检测液的配制：450μL反应缓冲液+50μL 10mM/L 4-MUG母液。

反应终止液(0.2mol/L NaCO3)：NaCO₃10.6g，水定容至500mL。

2)GUS酶活标准曲线的制定

用反应终止液将1mM的4-MU母液稀释成10nM，100nM，500nM，1μM，2μM，4μM 的浓度梯度，利用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10s，狭缝宽度5nm，电压550V的条件下测定各浓度溶液的荧光值，并绘制标准曲线。

3)GUS荧光活性的测定

用打孔器取适量叶片，加1mL 4℃预冷的反应缓冲液快速磨碎，转入1.5ml离心管中置于冰上约10min，期间不断颠倒混匀；12500rpm，4℃，离心10min；取100μL上清加入到37℃预热的1mL检测液中迅速混匀，即刻取出80μL加入到720μL反应终止液中终止反应，并将该管的酶活值作为酶促反应空白对照。剩余上清液用于蛋白含量的测定；分别在10min、20min、30min、40min、60min时取出80μL上述检测液加入到720μL终止液中，并迅速混匀；利用荧光分光光度计测定上述终止液的荧光值，测定条件是激发波长365 nm、发射波长455nm，狭缝宽度5nm，扫描时间10s，电压550V；各样品酶活力的计算 (单位：nM 4-MU/minmg protein)：依据上述2)中绘制的标准曲线求出相应的4-MU含量，以反应时间对4-MU的含量作图，直线部分的斜率为酶反应的速率。

4)蛋白含量的测定

取叶片提取液30μl，采用Bradford法测定蛋白含量(Bradford MM,A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein–dye binding.Ann.Biochem.,1976，72:248–254.)。

酶活测定结果显示D1-D9在转基因烟草叶片中启动GUS表达的能力上存在很大差异。 D1-D3突变体植株启动GUS表达的能力最弱，D4的酶活性可达到D3的4倍左右，D4-D9的GUS荧光活性相对较强，其中D8在ZmVP2启动子的系列缺失片段中表现出了最高的启动子活性，可达到全长启动子D1的6倍左右。D8片段(-219至-1bp)为ZmVP2基因起始密码子ATG 上游的219bp的DNA序列，该片段可能是ZmVP2启动子高效启动基因表达的关键序列(见附图3)。

实施例5：D1～D9转基因本生烟草的盐胁迫响应特性分析

1)选取生长状态一致的8周龄大小的D1-D9转基因T3代纯合株系植株和WT(阴性对照)为材料。

2)盐胁迫处理组浇灌含200mM NaCl的1/2MS营养液，对照组浇灌等量的1/2MS营养液，实验设7个重复。

3)胁迫处理24h后分别收取处理组和对照组植株相同部位的叶片，进行GUS组织化学染色和荧光活性测定。

4)D1-D3和WT植株叶盘GUS染色24h，D4-D9植株叶盘GUS染色6h后脱色拍照观察；GUS组织化学染色具体步骤按照实例3中的程序进行。

5)对GUS酶活测定结果统计分析，计算其酶活速率；GUS酶活测定具体步骤按照实例4中的程序进行。

结果表明D1-D8突变体烟草在200mM NaCl处理24小时后其叶片GUS荧光活性可达到处理前的2.4倍左右，即D1-D8启动子片段具有明显的盐胁迫诱导特性，而D9突变体在盐胁迫前后其酶活强度无显著差异。上述结果表明了D8和D9之间的片段(-219～-149bp)极有可能存在着盐胁迫响应相关元件。酶活结果也进一步明确了盐胁迫处理前后D8启动子片段在D1-D9系列缺失片段中均具有最高的启动子活性，在盐胁迫前后D8突变体中的GUS酶活性均可达到全长启动子D1的5.8倍左右。在正常条件下D8突变体叶片的GUS酶活性是D9的1.4倍左右，而盐胁迫处理24h后可达到D9的3.3倍左右。该结果表明了D8片段(219bp)为ZmVP2启动子启动基因高效表达的关键序列区段，而且伴随着较高的盐胁迫响应特性，为盐胁迫诱导性启动子。盐胁迫下D8片段启动目的基因表达可达到一个较高的水平，在作物耐盐基因工程育种中体现出了很好的应用前景。

实施例6：D1～D9转基因本生烟草的干旱胁迫响应特性分析

1)选取生长状态一致的8周龄大小的D1-D9转基因T3代纯合株系植株和WT(阴性对照)为材料。

2)实验组控水，对照组根据具体情况浇适量水，实验设7个重复。

3)干旱胁迫处理24h后分别收取处理组和对照组植株相同部位的叶片，进行GUS组织化学染色和荧光活性测定。

4)D1-D3和WT植株叶盘GUS染色24h，D4-D9植株叶盘GUS染色6h后脱色拍照观察；GUS 组织化学染色具体步骤按照实例3中的程序进行。

5)对GUS酶活测定结果统计分析，计算其酶活速率；GUS酶活测定具体步骤按照实例4中的程序进行。

结果表明D1-D8突变体烟草在干旱处理24h后其叶片GUS荧光活性可达到处理前的2.0倍左右，明确了D1-D8片段的启动子活性受渗透胁迫的诱导。干旱处理24h的D9突变体转基因烟草的GUS荧光活性与未处理的对照相比却无显著差异。上述结果表明D8与D9之间的71bp片段 (-219至-149bp)极有可能存在着干旱胁迫响应相关元件。此外，GUS酶活结果也表明了干旱胁迫前后D8片段在D1-D9系列启动子片段中均具有最高的启动基因表达的能力，胁迫前后均可达到全长启动子D1的6倍左右。正常条件下D8突变体叶片的GUS酶活性是D9的1.4倍左右，而干旱胁迫处理24h后可达到D9的3.0倍左右。该结果表明了D8片段(219bp；-219至-1bp) 是ZmVP2启动子中具有干旱胁迫诱导活性的高效启动基因表达的关键序列，在作物抗旱育种中具有很好的应用潜质。

实施例7：80bp(-219～-140bp)片段的干旱和高盐胁迫诱导活性验证

1)为防止高盐/干旱胁迫响应元件位于D8和D9之间的71bp的右边界，我们向右顺延了9个碱基。依据80bp DNA序列设计引物(引入酶切位点BamHI和PstI)：上游引物为5'-TAAGGATCCGTAGGCTTGACGGCA-3'，下游引物为5'–AAACT GCAGGTAAACACA TCCAGA-3'。PCR 扩增片段连入mini35S启动子(-46至+10bp)上游启动GUS表达，命名为P-80bp-mini35S。质粒经鉴定正确后转入农杆菌GV3101中，用于后续烟草的瞬时转化。

2)携带mini35S和P-80bp-mini35S质粒的农杆菌GV3101培养至对数生长期(OD600＝0.6 左右)。5000rpm，常温下离心10min收菌，弃上清，沉淀用等体积含10mM MES，10mMMgSO₄和100μM AS的水溶液重悬，黑暗处室温下静置3h以上。

3)将静置后的菌液轻轻混匀，通过叶脉注射法瞬时转化烟草叶片，每个菌株注射30株烟草，注射后烟草植株置于培养室中恢复24h。

4)取注射侵染过的叶片中心区域，用打孔器取材，1/3叶盘作为对照置于1/2MS溶液中； 1/3叶盘置于含200mM NaCl的1/2MS溶液中进行盐胁迫处理；1/3叶盘置于含18％PEG6000的 1/2MS溶液中模拟干旱处理。

5)处理24h后，每个植株胁迫处理的和未处理的叶盘各取5片，GUS染色24h后拍照观察；同时各取5片用于GUS酶活测定，统计其酶活速率。

实验结果表明P-80bp-mini35S质粒侵染的烟草叶盘在盐和PEG胁迫处理24h后的GUS 酶活性分别达到处理前的2.5倍和2.2倍，而mini35S启动子质粒侵染的烟草叶盘在盐和PEG 胁迫处理前后的GUS酶活无显著变化。说明上述80bp片度(-219至-140bp)确实赋予了mini35S启动子明显的高盐和PEG胁迫响应特性，极有可能含有盐/干旱胁迫相关的顺式作用元件。

实施例8：D8启动子转化玉米评估其在玉米抗逆遗传改良中的应用价值

1)选取玉米齐319自交系进行农杆菌介导的遗传转化。种子灭菌后萌发，其茎尖离体培养产生丛生芽，最终以丛生芽作为受体进行转化。培养基如下：

种子萌发培养基：KNO₃1900mg/l，KI 0.83mg/l，CaCl₂·2H₂O 440mg/l，KH₂PO₄·H₂O170mg/l，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/l，H₃BO₃10mg/l，MgSO₄·7H₂O 370mg/l，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/l，NH4NO₃1650mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/l，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/l，Na₂MoO₄·2 H₂O0.5mg/l，ZnSO₄·7H₂O 10mg/l，盐酸吡哆醇1.0mg/l，盐酸硫胺素10.0mg/l，甘氨酸2.0mg/l，烟酸1.0mg/l，酪蛋白水解物500mg/l,蔗糖30g/l,肌醇100.0mg/l，生物素 0.05mg/l，琼脂粉7g/l，pH 5.8-6.0，用于种子萌发(液体培养基中不加琼脂)。

A培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-BA 4.5-9.0μmol/l和2,4—D 1.0-3.0 mol/l。

B培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加IBA(吲哚丁酸)1.8μmol/l和6-BA4.5 mol/l。

成苗培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加IBA 3.6μmol/l和6-BA 2.25μmol/l。

生根培养基：在上述种子萌发培养基的基础上添加IBA 2.8-3.6μmol/l。

培养基经高温高压灭菌，抗生素及除草剂等活性成分应经高压过滤灭菌。

2)种子的灭菌与萌发：将玉米种子用70％乙醇灭菌8min，0.1％氯化汞溶液灭菌10min，最后用无菌水洗涤5-7遍。将灭菌后的种子置于培养瓶中(培养瓶封口且瓶内放少量无菌水)，于28℃黑暗处萌发2天。当种子露白后，将其转移到基本培养基中继续培养(28℃，黑暗)。

3)茎尖的离体培养：当萌发种子的胚芽长到3-5厘米左右时，将胚芽鞘和幼叶进行剥离，最后将5毫米左右的上胚轴和茎尖切取并接种在A培养基中26℃暗培养(在此过程中要注意及时切除伸长的下胚轴和幼叶)。

4)丛生芽组织的诱导、继代与分化：离体茎尖在培养7-10天左右后开始发生不规则的膨大，在膨大的分生组织处有瘤状和指状的突起。20天后，在突起的表面开始有不定芽和胚状体的生成。一般情况下4周进行1次继代。在继代培养的过程中，如若发现在丛生芽组织块上丛生小芽过多，则将2,4-D浓度调整为3.0μmol/l；如若发现在丛生芽组织块上愈伤组织化较严重而不定芽很少，则将2，4-D浓度降至1.0μmol/l，进行继代培养直至产生大量的瘤状或指状突起(在A培养基上进行培养的组织块中，有少数材料可能会产生不定根，不定根的出现与幼叶一样会影响到组织块的膨大和胚状体或丛生芽的产生，所以要注意及时切除)。将丛生芽组织块再次转移到B培养基上培养2-3天后，其质地变得较为柔韧，色泽则慢慢变黄。利用扫描电镜观察可看到各个时期的胚状体和不定芽。胚状体和不定芽迅速发育，在其表面上产生丛生小芽。

5)以丛生芽组织块为受体进行农杆菌介导的遗传转化

将含有D8质粒的农杆菌GV3101在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中震荡培养(28℃， 200rpm)至对数生长期。3500rpm,离心10min，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(种子萌发培养基成分浓度减半，且不加琼脂粉)进行洗涤，离心收菌。用含100μM/L的乙酰丁香酮的1/2浓度的丛生芽诱导培养基进行悬浮(稀释5-20倍)后用于遗传转化。

以准备好的已培养12-18天的丛生芽组织块为受体进行转化，转化后在黑暗处进行恢复培养。将经农杆菌感染后的丛生芽或者组织块在含250mg/L头孢霉素(Cefotaxime)的培养基上进行抑菌培养(黑暗处)，然后将丛生芽或组织块转移到筛选培养基中进行筛选(一般3-4代)。筛选过程中大量丛生芽组织块死掉，将存活的组织块转移到不含筛选剂且不含 2,4-D的A培养基上进行培养，直至产生抗性小芽。

将抗性小芽切下并转移到成苗培养基上培养(光强约2000-3000lx，光照14-16h/d)。当小苗至3-4叶期时再次转移到生根培养基中以诱导生根。将生根后的小苗移栽到蛭石中进行生长(移栽时洗去粘附的培养基)。植株的生长条件为：自然光下，日温22-28℃，夜温16-21℃，隔天浇灌含1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分的营养液。大约两周后移植苗产生大量根系，最后将其定植在田间生长。

6)转基因植株的鉴定

取移栽成活的玉米植株的叶片提取DNA并进行PCR，将PCR结果为阳性的植株进一步进行叶片的GUS染色。两者均为阳性的植株收获种子繁殖后代。玉米少量叶片DNA的提取同实例 3中烟草叶片的提取程序；PCR反应体系及程序和转基因玉米的GUS组织化学染色程序同实例3中所述。

7)以D8T3代转基因纯合玉米植株为材料，开展盐和干旱胁迫处理实验

盐胁迫处理实验:将种子播种在砂盆中，从三叶期开始一半浇灌0.7％NaCl水溶液，另外一半浇灌等量水作为阴性对照。在胁迫处理至1、3、7、10天后分别取材进行GUS染色和 GUS酶活测定。实验结果表明D8在玉米种仍具有较高的启动基因表达的能力，并且明显受到盐胁迫的诱导，为盐胁迫诱导型启动子。

干旱胁迫处理实验：将种子播种在砂盆中，从五叶期开始一半植株开始进行控水处理，另外一半怎浇灌适量水作为阴性对照。控水处理1、3、5、7天后取材进行GUS染色和GUS酶活测定。实验结果表明D8能够受到干旱胁迫的诱导，为干旱胁迫诱导型启动子。

综上所述，D8在玉米中具有较高的启动基因表达的能力，且能够受到盐、干旱胁迫的诱导，为盐和干旱胁迫诱导型启动子，在玉米的抗逆遗传改良中具有重要的应用价值。

Claims (4)

1.一种玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变体是位于玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的连续碱基序列，该缺失突变体命名为玉米Ⅱ型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8；其中所述玉米Ⅱ型H⁺-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体在提高烟草抗逆育种中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的提高烟草抗逆育种是通过利用玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体D8在植物体内启动抗逆基因的表达实现；其中，所述烟草抗逆是指烟草在器官、组织、细胞或整株水平上表现出的抗旱或耐盐特征或其组合。

4.权利要求1所述玉米II型H⁺-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体在玉米耐盐和抗旱育种中的应用。