CN102226180A - 甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子（PBnPABP5-3）的制备方法及其应用。利用基因组步移方法克隆PBnPABP5-3序列：应用SDS裂解法提取基因组DNA，在不同体系中，分别用核酸内切酶DraI、EcoRⅤ、PvuII和StuI酶切DNA，和接头片断连接后，以其为模板进行第一轮PCR扩增，第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液为模板进行扩增，获得PBnPABP5-3。PBnPABP5-3在植物花药、花粉粒、根尖、胚珠中的应用。该启动子具有驱动外源基因表达的功能，其表达部位在植物的花药、花粉粒、根尖、胚珠中，在油菜食用油安全性和提高抗逆性，抗倒伏，提高作物品质方面，人工创建不育系、恢复系，丰富种质资源等方面，该启动子具有应用潜力。

Description

甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。具体涉及一种甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子(命名为P_BnPABP5-3，以下相同)，同时还涉及一种甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法。本发明还涉及含有该启动子或其同源核苷酸序列的载体和涉及利用该启动子在油菜及其它植物基因工程中的应用。

背景技术

植物启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平调控、翻译水平调控以及蛋白质加工水平调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。

启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和特异型两类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002，23(2)：52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(Jia S-R.Environment and food biosafty assessment of transgenic plants.Advanced of Bioengineer.1997，17(6)：37-42；Morris S H，Adley C.C.Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology：an overview with a focus on GM foods.Trends in Biotechnology，2001，19(2)：43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002，23(2)：52-56)。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四环素(tetracycline)都对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就。在不同组织中特异性表达的各类启动子已不断得到研究(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报。2007，(4)：21-24)。

油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。随着转基因技术的成熟，转基因油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用在油菜种子中完全不表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法。达到既提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险的目的。

因此，本发明开发了一个甘蓝型油菜内源启动子。通过荧光定量PCR检测表明该启动子驱动的内源基因在植株的根、茎、叶片、花蕾、角果中高量表达。通过检测报告基因GUS的表达特征证明启动子驱动的基因在根部、茎部、叶片、花蕾以及角果皮中高量表达而种子中不表达。我们的结果预示着该基因的启动子在转基因植物中具有相当的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子，该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。可应用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。

本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子的制备方法。该方法通过对甘蓝型油菜基因组进行基因组步移，获得甘蓝型油菜P_BnPABP5-3序列。操作简单，结果稳定可靠。

本发明的再一个目的是在于提供了一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

本发明还有一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子在花药、花粉粒、根尖、胚珠中的应用。P_BnPABP5-3的功能能够反映油菜BnPABP5-3基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的花药、花粉粒、根尖、胚珠中精细表达，而成熟种子中完全不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物中提高抗逆性、创建不育系、人工创建种质资源等基因工程和转基因安全(食用、花粉漂流)中具有应用价值。

为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：

为了获得本发明，发明人对油菜发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现一种新的启动子。该启动子驱动的内源基因在植物的花药、花粉粒、根尖、胚珠中高效表达。

根据本发明的一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够特异性驱动基因在植物中高效表达，所述启动子含有SEQ ID No.1核苷酸序列或与SEQ ID No.1实质上同源的核苷酸序列。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。

根据本发明的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。

1一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子的制备方法，其步骤是：

利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取基因组DNA，按照基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat.No.638904)操作程序，进行基因组步移。具体步骤为：提取基因组DNA 25μL(0.1μg/μL)，分别用核酸内切酶Dra I、EcoR V、PvuII和Stu I酶切，纯化后加入接头形成四个不同的基因组DNA库，用作首次基因组步移第一轮PCR模板，根据目的基因保守序列设计特异性引物GSP1(表2)与基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat.No.638904)内上游接头引物AP1(表2)进行扩增。第二轮PCR以第一轮PCR产物的50倍稀释液(水稀释液)为模板，同样方法设计的特异性引物GSP2(表2)和接头引物AP2(表2)进行扩增，随后进行第二轮基因组步移。所有PCR反应均为50μL扩增体系：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，LA Taq酶1.25单位，10×LA-PCRbuffer(含MgCl₂)5μL，补水至50μL。反应条件均为：94℃预变性1min；98℃10s，72℃6min 7个循环；98℃10s，67℃6min 33个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司，以下相同)，转化gold菌株(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)的感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切验证后测序，得到目的基因上游的侧翼序列，此序列包括P_BnPABP5-3驱动的内源基因的起始密码子至GSP2之间的区段和该基因的启动子序列。根据获得的序列，设计扩增启动子区域片段的引物P_BnPABP5-3S：5′-CAGAAGCTT(HindIII)ATCGGAAGAGGTCCCCGACAAG-3′和P_BnPABP5-3A：5′-GACATCTAGA(XbalI)CGCCGTCGTCGGGGCA-3′，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。所有引物的5′端含有Hind III酶切位点，3′端含有Xba I酶切位点。反应体系为25μL内含：1×PCR buffer，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，根据具体情况设置循环参数。PCR产物经1.0％(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶检测，凝胶回收试剂盒回收各目的缺失片段。按各回收的缺失片段：载体(0.3pmol缺失片段∶0.1pmol载体片段)＝3∶1的比例混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，1×反应缓冲液，无菌水补充体积至25ml，16℃过夜连接反应。冻融法转化大肠杆菌gold菌(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社，96-99)感受态细胞中。涂布于含有氨苄青霉素50μg/mL的LB固体培养基(配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用)平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测(反应体系为25μL内含：1×PCR buffer.，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，用灭菌的牙签挑取少量菌斑做模版，根据具体情况设置循环参数)，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的液体LB培养基(配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用)，37℃下200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)提取质粒，Hind III/Xba I酶切质粒1μg，0.8％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测。检测正确的阳性重组克隆，命名为pMD18-P_BnPABP5-3(将目的片段连入pMD18-T载体构建而成，以下相同)，为了确保载体中启动子的序列信息，以M13F/M13R为引物(M13F5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；M13R5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’)，将pMD18-P_BnPABP5-3进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的启动子P_BnPABP5-3，其序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。启动子中含有重组载体pBI-P_BnPABP5-3。

2、一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子在转基因植株的花药、花粉粒、根尖、胚珠中的应用，其步骤是：

2.1P_BnPABP5-3植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司以下相同)的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121(购自TaKaRa公司)上的35S启动子用技术方案1中克隆得到P_BnPABP5-3片段替换而来。为完成此目的，首先用Xba I/Hind III双酶切克隆载体pMD18-P_BnPABP5-3的启动子片段，同时用Xba I/Hind III酶切pBI121(Chen，P.Y.，Wang，C.K.，Soong，S.C.To，K.Y.Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants.Mol.Breed.11，287-293)质粒。酶切反应在37度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1％(质量体积比。以下相同)琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体pMD18-P_BnPABP5-3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒(前面已述)回收。按pMD18-P_BnPABP5-3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段∶50ng大片段)＝3∶1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，经酶切验证正确的重组质粒命名为pBI-P_BnPABP5-3。利用冻融法(步骤如下：1：取0.2ml感受态农杆菌，于冰水中缓慢融化。2：加入约2μg重组质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min后，投入液氮速冻1min，然后37℃水浴5min，融化细胞。3：加入800μl不含抗生素YEP液体培养基，28℃轻摇培养4-5h。4：12000rpm，30s，去上清，细胞重悬于0.2mlYEP培养基。5将培养物均匀涂布在含Rif(50mg/L)，Str(50mg/L)和Kan(50mg/L)的琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌检测)将pBI-P_BnPABP5-3转入根癌农杆菌EHA105(购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证。

2.2P_BnPABP5-3的功能分析：

2.2.1P_BnPABP5-3植物表达载体pBI-P_BnPABP5-3在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选：

参照文献中的方法进行拟南芥转化(Zhang X.R.et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature，2006，1：1-6)。制备含有构建好载体的根癌农杆菌EHA105(前面已述)菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50μg/ml、利福平50μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL 1300)于276nm纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温(20-25℃，以下相同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％蔗糖(质量体积比)中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的Silwet 1-77(购自北京五洲元业科贸中心，以下相同)。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15秒，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)酒精和0.01％(质量比)的升汞分别表面消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，然后均匀地吹打到MS固体筛选培养基(MS大量元素母液100ml；MS微量元素母液10ml；MS有机母液10ml；MS铁盐10ml；肌醇10ml；蔗糖30g；用1M NaOH调PH至5.8，12g琼脂粉，定容至1L，高压121度灭菌后备用。加入8g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1)表面。4℃春化4-6天，放入恒温培养箱(光周期16(白天)/8(黑暗)小时，温度：白天22℃，暗周期20℃)培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。叶片长到足够大小时(3-4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测(反应体系为25μL内含：1×PCR buffer.，MgCI 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L(毫摩尔每升)、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng，根据具体情况设置循环参数)，结果表明获得了转基因阳性苗。

表1MS培养基母液配方

2.2.2P_BnPABP5-3功能分析：

用P_BnPABP5-3替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI-P_BnPABP5-3重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_BnPABP5-3的调控。利用根癌农杆菌EHA105(前面已述)介导的花序侵染法转化拟南芥。T1代利用卡那霉素抗性和PCR检测筛选得到阳性植株(前面已述)。

将PCR验证是阳性的T1代转基因植株种子在MS(前面已述)培养基上播种，4℃春化后在生长箱中萌发，出苗后5-7天开始取样染色。染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-100 0.001％(体积比)，甲醇20％(体积比)中，真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗数次(5～7次)，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。通过检测不同时空下GUS基因的表达部位和表达强度来探索P_BnPABP5-3的时空表达模式。

该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药、花粉粒、根尖、胚珠中高效表达，但是成熟种子中不表达。说明该启动子具有驱动下游基因在植物的花药、花粉粒、根尖、胚珠中高效表达，而在成熟种子不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有应用价值。如可以通过构建含有该启动子驱动引起花药败育的基因的载体，转化受体植株，人工创造雄性不育材料，应用在杂交育种的生产，或是控制转基因植物通过花粉飘逸造成的转基因的逃逸，或是通过启动子驱动某些提高花粉营养成分的基因，改善花粉营养；或可以通过构建含有该启动子驱动引起根伸长的基因的载体，转化受体植株，人工创造抗旱植株。同时由于P_BnPABP5-3驱动的基因在种子中不表达，因此在成熟种子中不会出现外源导入基因的蛋白产物，在转基因食物安全领域具有重要的应用价值。

一种油菜P_BnPABP5-3启动子全长序列SEQ ID NO：1在植物组织中功能性表达的描述。通过荧光定量PCR分析，结果显示该启动子驱动的内源基因在花、角果、根、茎、叶中的Ct值分别是23.03、25.95、27.60、25.84、28.28，而在上述组织中的Actin的Ct值分别是18.40、18.93、18.56、16.43、16.21，表明该启动子是一个在花中表达的强启动子。利用基因组步移法克隆得到甘蓝型油菜BnPABP3基因的5′上游序列。P_BnPABP5-3驱动的内源基因在花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，其它组织中不表达。这说明P_BnPABP5-3驱动的内源基因是一个在花药、花粉粒、根尖、胚珠中高效表达的基因，证明P_BnPABP5-3是一个花药、花粉粒、根尖、胚珠中高效表达启动子。

一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子在花药、花粉粒、根尖、胚珠中的应用的描述。利用基因组步移法克隆得到油菜P_BnPABP5-3驱动的内源基因的5′上游序列。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI-P_BnPABP5-3(前面已述)。采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，成熟种子中完全不表达(图4)的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在人工创建种质资源、植物基因工程和转基因安全(食用)、提高作物抗旱性等中具有应用价值，如利用该启动子驱和花粉粒发育或和根尖生长相关的目的基因，首先构建P_BnPABP5-3驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_BnPABP5-3启动子的驱动下，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，种子中完全不表达，不会引起食品安全问题。

本发明的优点：

1、所提供的启动子克隆方法克隆到的启动子能够通过对GUS基因的调控和组化分析，获得具有组织特异性表达功能的油菜启动子。

2、克隆到油菜来源的P_BnPABP5-3。从油菜食用油安全性和利用转基因作物品质，人工创建种质资源或提高作物抗旱性等方面来考虑，这种启动子具有应用潜力。用P_BnPABP5-3替换pBI121(前面已述)质粒上的35S启动子序列，形成pBI-P_BnPABP5-3重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_BnPABP5-3的调控。通过转基因实验证明，该启动子在花药、花粉粒、根尖、胚珠中的高强度驱动GUS基因的表达以及在成熟种子中完全不驱动GUS基因的表达的特性启示申请人可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来驱动和花粉、根尖、胚珠发育相关的基因，使得该基因在花粉、根尖、胚珠中过量表达，人工创造不育系、恢复系，丰富种质资源，提高根的生长或提高转基因植物的生物安全性，抑制外源基因的扩散，防止基因漂流。

附图说明

图1为一种基因组步移扩增P_BnPABP5-3片段电泳图。

泳道1、2、3、4分别代表经Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I酶切后形成的四个基因组DNA“库”中的PCR扩增结果；泳道M代表DL2000的核酸Marker。

图2为一种构建的pBI-P_BnPABP5-3载体示意图。

图3为一种转化载体pBI-P_BnPABP5-3的部分转基因植株PCR鉴定图

泳道M代表核酸Marker；泳道1代表pBI-P_BnPABP5-3阳性质粒的PCR扩增结果；泳道2、3、4、5、6阳性株的PCR扩增结果：泳道7野生型拟南芥的PCR扩增结果。

图4为一种P_BnPABP5-3驱动的GUS基因的组织化学染色结果。

A：15日苗(根尖蓝色)；B：花序(花药蓝色)；C：未开放花蕾(花药蓝色)；D：角果(成熟种子无色)；E角果(胚珠蓝色)；F：花药和柱头(花药蓝色)；G：花药(蓝色)；H：花粉粒(蓝色)；Bar＝100μm。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子的制备方法，其步骤是：

A、油菜P_BnPABP5-3启动子引物设计：

利用SDS裂解法提取油菜DNA(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南(第三版)科学出版社)，按照基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat.No.638904)操作程序，进行基因组步移，步移进行两轮PCR扩增，克隆获得油菜P_BnPABP5-3(942bp)。步移所用引物如表2。

表2基因组步移克隆P_BnPABP5-3所用引物

B、甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子制备是：

根据基因组步移试剂盒(购自Clontech公司，产品代号Cat.No.638904)说明，分别用产生平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI在100μl体系内酶切大约2.5μg的基因组DNA，建立四个经限制性内切酶处理的、连接有特异性接头的DNA的“库”，以其为模板进行两轮PCR反应。取1μlDNA(1μg/μL)用Dra I酶切，检测其纯度。体系如下：DNA 5μl，Dra I(10单位/μl)1.6μl，10×buffer 2μl，无菌水补齐至20μl。37℃，过夜，用1％(前面已述)琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。分别用DraI、EcoRV、PvuII和StuI酶切DNA，反应体系如下：DNA(0.1μg/μl)25μl，EcoRV(10单位/μl)8μl，10×buffer 10μl，无菌水补齐至100μl，37℃过夜。向酶切液中加入10μl的3M NaOAc和50μl的95％(体积比，以下相同)乙醇，-20℃下沉淀3小时以上，然后12000rpm离心5分钟，70％(体积比，以下相同)乙醇洗涤两遍，12000rpm离心5分钟，室温下(20-25℃)晾干，用20μl无菌水溶解晾干的DNA。特异性接头连接的反应体系如下：10×T4 ligase buffer 2.0μl，酶切处理的DNA 8.0μl，T4 ligase(1单位/μl)1μl，AP1(25μM)4.0μl，无菌水补至20μl，16℃过夜。将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃。以基因组步移特异性引物GSP1(表2)进行第一轮PCR反应，体系如下：10×buffer(MgCl₂ free)5μl，dNTPs mixture(10mM)1.0μl，GSP1(10μM)2.5μl，AP1(10μM)2.5μl，Taq polymerase(5单位/μl)0.2μl，连接液0.1μl，无菌水补至50μl。反应程序如下：94℃1min；98℃10s，72℃2min，共7个循环；98℃10s，68℃2min，共33个循环；72℃10min。用双蒸水稀释第一轮PCR反应产物50倍做为第二轮PCR反应的模板，以基因组步移特异性引物GSP2(表2)进行第二轮PCR反应，反应体系如下：10×buffer(无MgCl₂)5μl，dNTPs mixture(10mM)1.0μl，GSP2(10μM)2.5μl，AP2(10μM)2.5μl，Taq聚合酶(5单位/μl)0.2μl，模板溶液1.0μl，无菌水补至50μl。反应程序同第一轮PCR反应，PCR扩增结果如图1。回收纯化第二轮PCR产物，并于测序T载体(前面已述)连接，转化大肠杆菌感受态(前面已述)，测序。获得P_BnPABP5-3全长序列，命名为P_BnPABP5-3，一种分离的启动子，其系列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或与SEQ ID No.1实质上同源的核苷酸序列。

油菜P_BnPABP5-3重组表达载体的构建及根癌农杆菌转化：

用Xba I/Hind III双酶切连接有P_BnPABP5-3的pMD 18-P_BnPABP5-3(前面已述)和pBI121(前面已述)质粒。凝胶回收酶切下来的各个启动子片段和pBI121(前面已述)片段，连接，转化大肠杆菌(方法前面已述)，构建成植物表达载体pBI-P_BnPABP5-3(前面已述)(图2)。最后用冻融法(前面已述)将该载体转入根癌农杆菌EHA105(前面已述)，在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)双抗性平板上挑选阳性克隆后，用PCR验证是否含有目标片段。

实施例2：

pBI-P_BnPABP5-3的拟南芥转化及PCR检测：

按照上述文献(Zhang X R.et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature，2006，1：1-6)中转化方法转化拟南芥。根据转基因植株所特有的卡那霉素抗性，在含有浓度为50mg/L卡那霉素的MS(前面已述)培养基上生长，获得的绿苗初步认为是阳性苗。待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待植株出现花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA(前面已述)，做PCR鉴定。引物序列为，5′-GAATTGTGAGCGGATAAC-3′和5′-ACATAAGGGACTGACCAC-3′；PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL(约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2ul、25mMMgCL₂ 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物各0.2ul、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃2min32循环，72℃延伸5min。用1％琼脂糖凝胶电泳(前面已述)检测PCR反应产物，结果表明P_BnPABP5-3表达载体pBI-P_BnPABP5-3已经成功转入拟南芥(图3)。共获得10株阳性苗。

实施例3：

甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子的功能分析：

本发明首次克隆得到P_BnPABP5-3的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，拟南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代)。取T2代10个株系的不同时期组织进行GUS染色。

T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液(X-gluc 0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA 10mmol/L，Triton-x-100 0.001％，甲醇20％(体积比)真空抽气5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸(体积比为1∶1)进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗3-5次，体式显微镜(OLYMPUS SZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子去开花后10天左右的种子。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。

染色结果发现(表3、图4)：在拟南芥的整个生长过程中，花药、花粉粒、根尖、胚珠中被染成蓝色；在角果中，成熟种子未出现蓝色，在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，其它组织中不表达。

实验结果表明，油菜P_BnPABP5-3具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，在其它组织中不表达。P_BnPABP5-3调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明P_BnPABP5-3具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的花药、花粉粒、根尖、胚珠中精细表达，而在其它组织中完全不表达(表3、图4)。

这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有应用价值。

一种甘蓝型油菜P_BnPABP5-3启动子在花药、花粉粒、根尖、胚珠中的应用。利用基因组步移法克隆得到油菜P_BnPABP5-3驱动的内源基因的5′上游序列。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI-P_BnPABP5-3(前面已述)。采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS(前面已述)培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因株系进行GUS染色。GUS组织化学法染色表明，该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，其它组织中完全不表达(图4)的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(食用)中具有应用价值，如利用该启动子驱动花粉育性或和含油量相关、根生长相关的目的基因，首先构建P_BnPABP5-3驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_BnPABP5-3启动子的驱动下，在花药、花粉粒、根尖、胚珠中表达，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，种子中完全不表达，不会引起食品安全问题。

表3 P_BnPABP5-3转基因拟南芥T2代株系的GUS染色统计表

株系号

阳性

根

茎

叶片

花药

角果皮

花粉粒

种子

野生型(CK)

NO

NO

NO

NO

NO

NO

NO

NO

PBnPABP5-3-1

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-2

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-3

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-4

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-5

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-6

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-7

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-8

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-9

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

PBnPABP5-3-10

NO

NO

NO

NO

YES

NO

YES

NO

SEQUENCE LISTING

<110>  中国农业科学院油料作物研究所

<120>  甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法及其应用

<130>  甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法及其应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1488

<212>  DNA

<213>  甘蓝型油菜BnPABP5-3启动子的制备方法及其应用

<400>  1

atcggaagag gtccccgaca aggtcctcag actcgcgatt tcatctcgga acaagagtac     60

aagatggggg agctcttact tacgcaactg atagtggagg caagagaaac cagatgaggc    120

agcgaaagga ccgttgagga agatgcagag acaatattcg aaccgggcga acctcagacg    180

tatatctgac ccagatccaa agaaatacaa accctagatc taccaaacaa acgatgcctc    240

ctacaaaaaa cctaacaagc acaaccttgc tttctcactc cagagacact ggggacacac    300

ccatatgtct atttggacac cagatctggc ctcgctctct ctccggtgac acttagatgc    360

acccagatgt cgatttggat gccggatccg gcgagaacca gagaaagaaa acaaagtgga    420

agtgagaagc atgtagcact tacgagagga agagaaatta aataagcgga gagactaggg    480

ttgggggacc aatggaaata ggtccatcgc cggccatctg agggaagcat aggagaaacg    540

ccgaagagag aaaaattgct tctctcacct ccctctcctc cccattagag ttgctctaat    600

tcatctacaa aaacgggtat gtaactaggt acaaactaaa atatagcaag acaaatgtca    660

gagacaaatt gatttaactt gaccatattg ttcctaatca gtgccggccc attgaatgtg    720

aggcccagaa gctaaaaaaa tttgagattg aatgtgaggc ccagaagcta aaaaaatttg    780

agggccgtgg tattatcaac gttcaaaaga ttttgatggg aaggaggttc gaagtcatca    840

cctatagact atacacacca tgactaccac taagctacgg acaatttatt ataattctac    900

ggccggtaaa acatatatat ttttttgggc cggaagctgg aacttcctat gcttggtatc    960

agggcagcta cggttcctaa tacaaaactg tacacttgtt caaagtcctg aaagactcat   1020

aagcaacgca ggaacaaaat aaatatcatt tgatttggtc agaatattac caaatctcaa   1080

aatgcataaa atggcgacaa aaagaaagaa caaggaccaa aaaaaggtac acgtggcatc   1140

cacagacgtc ctttcgtcag tttcaacaaa aagcccatga tggccccaca aggtcccgcg   1200

taaatctcgg tctaaatctg aagagacgca tcaaagatcc gtaggaaccg attcgttaat   1260

tagcgaacgt ataaatacag acaaaaccgt agtgcactct ctttacttcc tttcgtgagt   1320

taacctaaaa acgaaaaaaa tagaaaataa aaaataaaaa ataaaaaaga tatatatcgc   1380

agaaatttgg aaacacacaa aatctctcgc tgtcttgcac acacacgcga aaaaacccta   1440

aatatcagcg gtatggcggc ggcatctgga attgccccaa cgacagcg                1488

 

Claims (7)

1.一种分离的启动子P _BnPABP5-3 ，其序列为SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种分离的启动子，其特征在于：所述的启动子含有重组载体pBI-P _BnPABP5-3 。

3.权利要求1所述的一种甘蓝型油菜P _BnPABP5-3 启动子的制备方法，其步骤是： 

A、油菜P _BnPABP5-3 启动子引物设计：

利用SDS裂解法提取油菜DNA，按照基因组步移试剂盒操作程序，进行基因组步移，步移分两轮PCR进行扩增，克隆获得油菜P _BnPABP5-3 ，步移所用引物是：

AP1：5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；GSP1：5'–CCACTTGGTT GAAGAGATCCAAGAGATGCGCCT–3'；AP2：5'–ACTATAGGGCACGCGTGGT–3'；GSP2：5'–CCGTCGTGGGGGCAGTTCCA GATGCCGCCGC–3'；

B、甘蓝型油菜P _BnPABP5-3 启动子制备是：

根据基因组步移试剂盒说明，取5μl DNA用DraⅠ酶切，检测其纯度，体系如下：DNA 5 μl， DraⅠ1.6μl，10×buffer 2 μl，无菌水补齐至20μl，37℃，过夜，用1％质量体积比琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，分别用产生平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI在100μl体系内酶切2.5μg的基因组DNA，四种限制性内切酶的反应体系如下：DNA 2.5 μg ， 限制性内切酶 8 μl，10×buffer 10 μl，无菌水补齐至100 μl，37℃过夜，酶切完成后纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10μl 的3M NaOAc和50 μl 的95%体积比乙醇， - 20℃下沉淀3小时，然后12000rpm离心15 分钟，70%体积比乙醇洗涤两遍，12000 rpm离心5 分钟，室温下晾干，用20 μl无菌水溶解，纯化完成后加入特异性接头，反应体系如下：10×T4 ligase buffer 2.0 μl，上述酶切处理的DNA 8.0 μl， T4 ligase 1 μl，特异性接头 14.0 μl，无菌水补至 20 μl，16℃过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃，建立了四个经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库，以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSP1和AP1为引物，体系如下：10×buffer 5 μl，dNTPs mixture 1.0 μl，GSP1 2.5 μl，AP1 2.5 μl，Taq 酶 0.2 μl，稀释的DNA库0.1μl，无菌水补至50μl，反应程序如下：94℃ 1min；98℃ 10s ，72℃ 2min，共7个循环；98℃ 10s，68℃ 2min，共 33个循环；72℃ 10min；

第二轮PCR以第一轮PCR反应产物50倍稀释液做为模板，以GSP2和AP2为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer 5μl，dNTPs mixture 1.0 μl，GSP2 2.5 μl，AP2 2.5 μl，Taq 酶 0.2 μl，稀释模板溶液 1.0 μl，无菌水补至50 μl，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得P _BnPABP5-3 全长序列，为P _BnPABP5-3 。

4.权利要求书1所述的一种分离的启动子P _BnPABP5-3 在花药中的应用。

5.权利要求书1所述的一种分离的启动子P _BnPABP5-3 在花粉粒中的应用。

6.权利要求书1所述的一种分离的启动子P _BnPABP5-3 在根尖中的应用。

7.权利要求书1所述的一种分离的启动子P _BnPABP5-3 在胚珠中的应用。

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