CN104975027B - 花生Δ9‑硬脂酰‑ACP脱氢酶AhSAD启动子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生Δ⁹‑硬脂酰‑ACP脱氢酶基因AhSAD启动子（P _AhSAD ）及制备方法和应用。该启动子如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，利用基因组步移方法克隆P _AhSAD 序列，用SDS裂解法提取基因组DNA，在不同体系中分别用平末端核酸内切酶酶切DNA，和接头片断连接后，以GSP1和AP1为引物进行第一轮PCR扩增，以GSP2和AP2为引物进行第二轮扩增，获得含有P _AhSAD 的DNA序列。本发明的启动子P _AhSAD 具有驱动外源基因表达的功能，其表达部位在植物的根部、茎部、叶片、果针及种子中，这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程中具有重要应用价值。

Description

花生Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶AhSAD启动子及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种花生AhSAD启动子（命名为P _AhSAD ）及制备方法和应用。

背景技术

植物启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平调控、翻译水平调控以及蛋白质加工水平调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。

启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子3类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV) 的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S 启动子的质粒载体。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题。因此，组织特异性启动子和诱导型启动子的研究及应用日益受到育种工作者的重视。

在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激、激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长，而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱氢皮质醇(dex, dexamethasone) 、雌二醇(estradiol) 和四环素( tetracycline) 都对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就，在不同组织中特异性表达的各类启动子已不断得到研究。

花生是世界范围内广泛栽培的油料作物，是重要的油脂来源。花生油含有不饱和脂肪酸以及多种营养保健成份，是许多固定消费人群的主要食用油。近年来我国花生生产取得了长足发展，已经是世界上最大的花生生产国，但是目前中国花生油市场的供给量不能满足花生油的需求量，因此加强花生育种研究，提高花生产量对国家的食用油供给安全具有重要的现实意义。随着转基因技术的日益成熟，转基因花生研究必然在花生高产、高抗、品质改良等方面发挥越来越重要的作用，也是实现花生高产、高抗品质改良的重要手段。克隆并鉴定高效花生启动子是花生转基因研究的重要内容。

发明内容

本发明的目的：在于提供一种花生P _AhSAD 启动子，该启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物的基因工程研究和花生的安全转基因研究。

本发明的另一个目的：在于提供一种花生P _AhSAD 启动子的制备方法，该方法通过对花生基因组进行基因组步移，获得花生P _AhSAD 启动子序列，方法操作简单，结果稳定可靠。

本发明的再一个目的：在于提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测；通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

本发明还有一个目的：在于提供一种花生启动子P _AhSAD 在根部、茎部、叶片、果针及种子中的应用。花生P _AhSAD 启动子的功能能够反映花生AhSAD基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、果针及种子中精细表达。这一启动子在植物抗病、抗倒伏、提高光合作用、含油量、抗逆等基因工程中具有应用价值。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种分离的花生启动子P _AhSAD ，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

花生启动子P _AhSAD 的制备方法，包括以下步骤：

（1）花生启动子P _AhSAD 的引物序列：

AP1：5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；

GSP1：5'–CCATGCGGAACCTTGGAGATCTGAGG–3'；

AP2：5'–ACTATAGGGCACGCGTGGT–3'；

GSP2：5'–GAAGGGTTAGGGTTCAGCCTCAGAGCCAT–3'；

（2）花生启动子P _AhSAD 制备的步骤：

根据基因组步移试剂盒说明，取5 μL花生的 DNA，用DraⅠ酶切，反应体系如下：DNA5 μL，DraⅠ1.6μL，10×buffer 2 μL，用无菌水补齐至20 μL，37℃过夜，用质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；

分别用产生平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV、PvuII、StuI和SmaI在100μL体系内酶切2.0-3.0 μg的基因组DNA，反应体系如下：DNA 2.5 μg，限制性内切酶8 μL，10×buffer 10 μL，无菌水补齐至100 μL，37℃过夜；

酶切完成后进行纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10 μL 的3M 醋酸钠和50 μL 体积比为95%的乙醇溶液，-20℃沉淀3h，然后12000 rpm离心15 min，用体积比70%的乙醇洗涤两遍，12000 rpm离心5 min，室温下晾干，用20 μL无菌水溶解；

纯化完成后加入试剂盒提供的特异性接头Genome Walker Adaptor，反应体系如下：10×T4 ligase buffer 2.0 μL，酶切处理的DNA 8.0 μL，T4 ligase 1 μL，特异性接头Genome Walker Adaptor 14.0 μL，无菌水补至 20 μL，16℃过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃；由此建立五种经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库；

以建立的经五种限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库为模板，进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSP1和AP1为引物，体系如下：10×buffer 5 μL，10mM 的dNTPsmixture 1.0 μL，10 μM的 GSP1 2.5 μL，10 μM的AP1 2.5 μL，5单位/μL的Taq 酶 0.2 μL，稀释的DNA库0.1 μL，无菌水补至50 μL；反应程序如下：94℃预变性1 min；98℃变性10 s，72℃延伸2 min，共7个循环；98℃变性10 s，68℃延伸2 min，共 33个循环；72℃ 10 min；

第二轮PCR反应，以第一轮PCR反应产物的50倍稀释液作为模板，以GSP2和AP2为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer 5 μL，10mM 的dNTPs mixture 1.0 μL，10 μM 的GSP2 2.5 μL，10 μM的AP2 2.5 μL，5单位/μL 的Taq 酶0.2 μL，稀释模板溶液1.0 μL，无菌水补至50 μL，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得含P _AhSAD 全长序列的DNA。

所述的花生启动子P _AhSAD 的重组载体pBI-P _AhSAD 。

一种花生P _AhSAD 重组表达载体的构建方法，包括用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切连接有P _AhSAD 的pMD18-P _AhSAD 和pBI121质粒，凝胶回收酶切下来的启动子片段和pBI121片段，连接转化大肠杆菌，构建成植物表达载体pBI-P _AhSAD 。

所述的花生启动子P _AhSAD 在根部、茎部、叶片、果针和种子中的应用。

本发明的积极有益效果（优点）：

1、本发明提供一种花生P _AhSAD 启动子，该启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物基因工程研究和花生的安全转基因研究中。

2、本发明所提供的启动子克隆方法克隆到的启动子，能够通过对GUS基因的调控和组化分析，获得具有组织特异性表达功能的花生启动子。

3、本发明克隆到花生来源的P _AhSAD ，从花生食用油安全性和利用转基因提高作物抗病、抗倒伏、抗逆、提高光合作用、含油量，提高作物品质，人工创建种质资源等方面来考虑，这种启动子具有应用潜力。花生P _AhSAD 启动子的功能能够反映花生AhSAD基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、果针及种子中精细表达。这一启动子在植物抗病、抗倒伏、提高光合作用、含油量、抗逆等基因工程中具有应用价值。

4、通过转基因实验证明，本发明的启动子在根部、叶片、茎部、果针、种子中具有高强度驱动GUS基因的表达特性，可以用此启动子来代替CaMV35S强启动子来启动与抗病、抗逆、抗倒伏等基因的表达，以改良作物品质，改良食用油营养成份等。如利用该启动子驱动和根发育相关的基因，使该基因在根中过量表达，改良根的品质，使根部更加强壮，拥有更强的吸收能力，提高植物的抗旱、抗倒伏、耐盐碱性能力。利用该启动子驱动和茎发育相关的基因，使得该基因在茎中过量表达，改良茎的品质，提高茎的强度，使得植物具有更强的抗倒伏、抗病能力。利用该启动子驱动和叶片发育相关的基因，使得该基因在叶片中过量表达，改良叶片的品质，提高光合效率，提高叶片产量，从而提高作物产量、抗病虫害能力等。利用该启动子驱动和种子营养成份发育相关的基因，使得该基因在种子中过量表达，人工创造更适合人类、动物健康或更易于保存的食用油。

5、本发明的花生P _AhSAD 启动子的制备方法，采用特定的P _AhSAD 引物，对花生基因组进行基因组步移，获得了花生P _AhSAD 启动子序列，操作简单，结果稳定可靠。

6、本发明的含有植物高效表达启动子的重组载体，含有所述启动子核苷酸序列，载体大小适合，在植物中易于转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测；通过该载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

附图说明

图1为一种基因组步移扩增P _AhSAD 片段的电泳图。

泳道1、2、3、4、5分别代表经Dra I、EcoRⅤ、Pvu II、Stu I和Sma I酶切后形成的五个基因组DNA“库”中的PCR扩增结果；泳道M代表DL2000的核酸Marker。

图2 为一种AhSAD基因的5´RACE电泳图。

泳道1代表AhSAD 5´RACE；泳道M代表500 bp ladder的核酸Marker。

图3为一种构建的pBI-P _AhSAD 载体策略示意图。

图4为一种转化载体pBI-P _AhSAD 的部分转基因植株PCR鉴定图。

泳道M代表DL2000的核酸Marker；泳道P代表pBI-P _AhSAD 阳性质粒的PCR扩增结果；泳道CK代表野生型拟南芥PCR扩增结果：泳道1-9转基因拟南芥的PCR扩增结果。

图5 为一种P _AhSAD 驱动的GUS基因的花生组织化学染色结果。

A：叶片（兰色）； B：茎（兰色）；C：果针（兰色）；D：根（兰色）；E：种子（兰色）；F：子叶（兰色）。

图6 为一种P _AhSAD 驱动的GUS基因转基因拟南芥的组织化学染色结果。

A：1日苗（无色）； B：7日苗（兰色）；C：15日苗（兰色）；D：根（兰色）；E茎（兰色）；F：种子（兰色）；Bar =0.5 mm。

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但以下实施例并不表示对本发明的任何限制。

实施例1：一种花生P _AhSAD 启动子的制备方法

本发明所用花生（Arachis hypogeae L.），供试材料播种于大田，正常田间管理。

1.花生P _AhSAD 启动子的制备：

利用十二烷基硫酸钠（SDS）裂解法提取花生的DNA（J.萨姆布鲁克. D.W.拉塞尔著，黄培堂等译分子克隆试验指南（第三版）科学出版社），按照基因组步移试剂盒（GenomeWalker^TM Universal kit，Clontech公司生产，货号：638904）操作程序，进行基因组步移，步移进行两轮PCR扩增，克隆获得花生P _AhSAD 启动子（718bp）。步移所用引物如表1。

表1基因组步移克隆P _AhSAD 所用引物

花生P _AhSAD 启动子的制备具体步骤如下：

根据基因组步移试剂盒（Genome Walker^TM Universal kit，CLONTECH公司生产，货号：638904）说明，略有改动，分别用产生平末端的限制性内切酶Dra I、EcoRⅤ、Pvu II、Stu I和Sma I在100 μL体系内酶切大约2.5 μg的基因组DNA，建立四个经限制性内切酶处理的、连接有特异性接头（Genome Walker Adaptor）（试剂盒内提供）的DNA的“库”，以其为模板进行两轮PCR反应。取1 μL DNA（1 μg/μL）用DraⅠ酶切，检测其纯度。

体系如下：DNA 5 μL，DraⅠ（10单位/μL）1.6 μL，10×buffer 2 μL，无菌水补齐至20 μL。37℃，过夜，用1％的（质量体积比，以下相同）琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；之后分别用Dra I、EcoRⅤ、Pvu II、Stu I和Sma I五种内切酶分别酶切DNA，反应体系如下：DNA（0.1 μg /μL）25 μL，内切酶（10单位/μL）8 μL，10×buffer 10 μL，用无菌水补齐至100 μL，37℃过夜。

向酶切液中加入10 μL 的3M 醋酸钠和50 μL 95%（体积比，以下相同）的乙醇，-20℃沉淀3小时以上，然后12000 rpm离心5 分钟，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀两遍，12000rpm离心5 分钟，室温下（20-25℃）晾干，用20 μL无菌水溶解晾干的DNA。

特异性接头连接的反应体系如下：10×T4 连接酶 buffer 2.0 μL，酶切处理的DNA 8.0 μL，T4 连接酶（1单位/μL）1 μL，AD1（接头引物，试剂盒自带）（25 μM）4.0 μL，无菌水补至 20 μL，16℃过夜，完成经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库的构建。将连有特异性接头的DNA库用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃。

以基因组步移特异性引物GSP1（表1）进行第一轮PCR反应，体系如下：10×buffer（不含MgCl₂）5 μL，dNTPs mixture (10 mM) 1.0 μL，GSP1 (10 μM) 2.5 μL，AP1 (10 μM)2.5 μL，Taq 酶 (5单位/μL) 0.2 μL，稀释后的连接液0.1 μL，无菌水补至50 μL。反应程序如下：94℃ 变性1 min；98℃ 变性10 s，72℃延伸 2 min，7个循环；98℃ 变性10 s，68℃延伸 2 min，33个循环；72℃ 10 min。

用双蒸水50倍稀释第一轮的PCR反应产物作为第二轮PCR反应的模板，以基因组步移特异性引物GSP2（表1）进行第二轮PCR反应，反应体系如下：10×buffer（不含MgCl₂）5 μL，dNTPs mixture (10 mM) 1.0 μL，GSP2 (10 μM) 2.5 μL，特异性接头（Genome WalkerAdaptor，试剂盒内提供）(10 μM) 2.5 μL，Taq 聚合酶 (5单位/μL) 0.2 μL，模板溶液1.0μL，无菌水补至50 μL。反应程序同第一轮PCR反应，PCR扩增结果如图1。回收纯化第二轮PCR产物，并连接到测序T-vector载体（购自TaKaRa公司，以下相同）上，转化大肠杆菌感受态（购自大连宝生物工程有限公司，以下相同），并测序。

根据RACE试剂盒（SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit，购自Clontech公司，货号：634941）操作说明，以花生叶片RNA为模版合成第一链cDNA，步骤如下：1.0-2.75 μLRNA，1.0 μL 5ˊCDS Primer A，加dd H₂O 补齐至3.75 μL，72℃ 3 min，42℃ 2 min，加入1μL SMARTer ⅡA oligo，加入5.25 μL混合液（含5×first-strand buffer 2.0 μL、1.0 μLDTT、1.0 μL dNTPs mixture、0.25 μL RNase Inhibitor以及1.0 μL SMARTScribeReverse Transcriptase），42℃ 90 min，72℃ 10 min，加入100 μL EDTA稀释。以其为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSP1和UPM为引物，体系如下：10×buffer 5 μL，dNTPsmixture 1.0 μL，GSP1 2.5 μL，UPM 5.0 μL，Taq 酶 0.2 μL，稀释的第一链cDNA 2.5 μL，无菌水补至50 μL。反应程序如下：94℃预变性1 min；98℃变性10 s ，72℃延伸2 min，共7个循环；98℃变性10 s，68℃延伸2 min，共 33个循环；72℃ 10 min。

第二轮PCR以第一轮PCR反应产物50倍稀释液作为模板，以GSP2和NUP为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer 5μL，dNTPs mixture 1.0 μL，GSP2 2.5 μL，NUP 2.5 μL，Taq 酶 0.2 μL，稀释模板溶液 1.0 μL，无菌水补至50 μL，反应程序同第一轮PCR。PCR产物用1.0%（质量体积比）的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2。凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技北京有限公司，以下相同）纯化回收后，连接到pMD18-T载体（购自TaKaRa公司，以下相同），转化DH5ɑ菌株的感受态细胞（购自大连宝生物工程有限公司，以下相同），转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素LB固体培养基（50 mg/L）上，培养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素LB液体培养基（50 mg/L）中扩大繁殖，提取质粒并经酶切验证后测序，获得花生AhSAD基因起始密码子ATG上游转录区域。经测序后和基因组步移获得的序列比对，两者完全同源，证明步移获得的序列是P _AhSAD 序列。

获得P _AhSAD 全长序列，命名为P _AhSAD ，是一种分离的启动子，其系列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或与SEQ ID No．1实质上同源的核苷酸序列。

实施例2：花生P _AhSAD 植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株 GV3101（购于上海沪尚生物科技有限公司 以下相同）的转化：

构建的重组载体是将质粒pBI121(购自TaKaRa公司)上的35S启动子克隆得到P _AhSAD 片段替换而获得。为完成此目的，首先用KpnⅠ/BamHⅠ 双酶切克隆载体pMD18-P _AhSAD ，同时用KpnⅠ/BamHⅠ酶切pBI121质粒。

酶切反应在37℃培养箱中进行，约4-6小时之后，用1%（质量体积比）的琼脂糖胶电泳检测。将克隆载体pMD18-P _AhSAD 酶切下的小片段和pBI121（前面已述）酶切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。

按pMD18-P _AhSAD 酶切下的小片段和pBI121酶切下的大片段比例 (150 ng小片段：50ng大片段) = 3:1的比例（摩尔浓度比）混合样品，加入T4 DNA连接酶5单位，10×反应缓冲液2 μL，无菌水补充体积至20 μL，16℃过夜连接。冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素（50 μg/mL）的固体LB培养基平板上筛选，挑取正常生长的菌斑做菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒命名为pBI-P _AhSAD 。参见图3。

利用冻融法将pBI-P _AhSAD 转入根癌农杆菌GV3101（购自大连宝生物生物制品有限公司，以下相同），用卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（50 μg/mL）双抗性平板筛选，挑斑，菌落PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保存菌株，命名为pBI-P _AhSAD GV3101。

其中冻融法步骤如下：（1）取0.2 mL农杆菌GV3101感受态，于冰水中缓慢融化；（2）加入约2 μg 重组质粒DNA,轻轻混匀，冰浴30 min后,投入液氮速冻1min，然后37℃水浴5min，融化细胞；（3）加入800 μL不含抗生素的YEP液体培养基，28℃轻摇培养4-5 h；（4）12000 rpm，30s，去上清，细胞重悬于0.2 mL YEP培养基中；（5）将培养物均匀涂布在含利福平（50 mg/L）、庆大霉素（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌进行PCR检测。

实施例3：P _AhSAD 植物表达载体pBI-P _AhSAD 在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选

参照文献中的方法进行拟南芥转化（ZhangX.R, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.Nature, 2006, 1: 1-6）中转化方法转化拟南芥。操作步骤如下：待野生型拟南芥抽薹后，转化前一天用干净的剪刀剪去已经发育的角果，并扩增繁殖需要转化的农杆菌200 mL。第二天，室温5000转/分钟离心制备好的农杆菌，收集菌液，并用5%的蔗糖重新悬浮农杆菌，加入终浓度0.02%的Silwet L-77；然后将花序浸入农杆菌菌液15秒，取出后用黑色塑料袋包裹，保湿，第二天后取下塑料袋，将转化后的拟南芥植株重新放入培养箱，一周后进行第二次转化，种子成熟后收集，筛选阳性苗。

制备含有植物表达载体pBI-P _AhSAD 的根癌农杆菌GV3101菌液，在转化拟南芥前一天，将pBI-P _AhSAD GV3101转入含有卡那霉素50 μg/mL、利福平50 μg/mL的LB液体培养基200mL中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值达到1.6-2.0之间时取出。室温（20-25℃，以下相同）以4000 g离心10 min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖溶液中（质量体积比）。将浑浊的蔗糖溶液倒入培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心，以下相同），混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，15秒后取出植株花序，转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱中培养；第二天将塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的T0代种子用70%（体积比）酒精和0.01%（质量比）的升汞分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次（5～7次），均匀地吹打到含卡那霉素（50 mg/L）MS固体筛选培养基（MS大量元素母液100 mL；MS微量元素母液10 mL；MS有机母液10 mL；MS铁盐10 mL；肌醇10mL；蔗糖30 g；用1M 氢氧化钠调pH至5.8，8 g琼脂粉，定容至1 L，高压121℃灭菌后备用；各种母液配方见表2）表面。4℃放置3-5天，放入植物生长培养箱（光周期16（白天）/8（黑暗）小时，温度：白天22℃，暗周期20℃）培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。

用干燥的滤纸吸去表面的农杆菌培养液，将侵染过的组织小心插入MS固体培养基中（MS大量元素母液100 mL；MS微量元素母液10 mL；MS有机母液10 mL；MS铁盐10 mL；肌醇10 mL；蔗糖30 g；用1M NaOH调pH至5.8，12 g琼脂粉，定容至1 L，高压121℃灭菌后备用；加入8 g琼脂粉可配置成固体培养基。各种母液配方见表1），26℃避光培养1天。

叶片长到3-4叶时，取少许绿苗叶片，用SDS方法提取DNA，进行PCR阳性检测。PCR鉴定时所用引物：

上游引物：5'–AAATTTTGAGTATCATTTTAGTAATAG–3'；

下游引物：5'–TTTTCGTGTTGCGTCTTC–3'；

PCR反应体系如下：基因组DNA模板1 μL (约50ng)、10 × Taq酶反应缓冲液2 uL、25 mM MgCL₂ 1.2 uL、2 mM dNTP 1.5 uL、10 uM引物各 0.2 uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20 μL。

反应程序为：94℃ 预变性5 min，94℃ 变性45 s、55℃ 退火45 s、72℃ 延伸 2min，32个循环，72℃ 延伸5 min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明P _AhSAD 表达载体pBI-P _AhSAD 已经成功转入拟南芥（图4）；共获得10株阳性苗。

表2 MS培养基母液配方

实施例4：花生P _AhSAD 启动子的功能分析及其应用：

本发明首次克隆得到P _AhSAD 的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，拟南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子（即T2代）。拟南芥取T2代10个株系的不同时期组织进行GUS染色，花生用剪刀取不同组织进行染色。

染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液【X-gluc 0.5 mg/mL，磷酸缓冲液 50 mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Triton-x-100 0.001%，甲醇20%（体积比）】中，真空抽气5分钟，37℃过夜。

第二天用酒精-乙酸（体积比为1:1）进行脱色，直至叶片变白，之后用蒸馏水漂洗3-5次，体式显微镜（OLYMPUS SZX16）拍照。拟南芥取苗期不同时间段的整个植株；生殖生长期，叶片取嫩叶和成熟叶片；花取开过的花朵和未开的花蕾的花序；角果取不同时期的角果；种子取开花后10天左右的种子，用解剖针取出。花生果针、种子，取花生幼苗。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。

染色结果发现（表3、图5、图6）：在拟南芥中，根部、茎部、叶子、种子被染成蓝色；花生中根部、茎部、叶片、果针、种子被染成蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在根、茎、叶片、果针、种子中表达。

实验结果表明，花生P _AhSAD 具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、果针、种子中表达。在花生P _AhSAD 调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明花生P _AhSAD 具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS 基因能够主要在转基因植株的根部、茎部、叶片、果针、种子中精细表达。

这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全（食用）中具有应用价值。

花生P _AhSAD 启动子在根部、茎部、叶片、果针以及种子中的应用。

利用基因组步移法克隆得到花生P _AhSAD 驱动的内源基因的5′上游序列。构建由该启动子调控的报告基因GUS的植物表达载体pBI-P _AhSAD 。采用农杆菌介导的花期侵染法转化拟南芥，T1代在加有卡那霉素的MS培养基上初步筛选转基因植株，当拟南芥长出两片真叶后，移栽到蛭石上继续种植，当植株出现花序后，进行PCR检测，利用分子手段鉴定阳性株。T2代选择10个转基因株系进行GUS染色。采集新鲜的花生果针、种子，取花生幼苗，洗净培养基，进行农杆菌介导转化，侵染过的花生组织自三角瓶中小心取出，去除培养基，取根、茎、叶、果针和种子直接染色。

GUS组织化学法染色表明，该启动子驱动的GUS基因在植物的根部、茎部、叶片、果针以及种子中表达。由此可见，该启动子驱动的GUS基因具有一定的时空表达特异性，具有驱动下游基因在根部、茎部、叶片、果针以及种子中表达（图5、图6）的功能。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全（食用）中具有应用价值，如利用该启动子驱动和根发育相关的基因，使该基因在根中过量表达，改良根的品质，使根部更加强壮，拥有更强的吸收能力，提高植物的抗旱、抗倒伏、耐盐碱性能力。

利用该启动子驱动和茎发育相关的基因，使得该基因在茎中过量表达，改良茎的品质，提高茎的强度，使得植物具有更强的抗倒伏、抗病能力。利用该启动子驱动和叶片发育相关的基因，使得该基因在叶片中过量表达，改良叶片的品质，提高光合效率，提高叶片产量，从而提高作物产量、抗病虫害能力等。利用该启动子驱动和种子营养成份发育相关的基因，使得该基因在种子中过量表达，人工创造更适合人类、动物健康或更易于保存、使用目的的食用油。首先构建P _AhSAD 驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P _AhSAD 启动子的驱动下，在根部、茎部、叶片、果针以及种子表达，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，产生较好的效果。

表3 PAhSAD转基因拟南芥T2代株系的GUS染色统计表

株系号

根

茎

叶片

种子

花序

角果皮

表皮毛

野生型（CK）

N

N

N

N

N

N

N

P AhSAD -1

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -2

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -3

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -4

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -5

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -6

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -7

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -8

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -9

Y

Y

Y

Y

N

N

N

P AhSAD -10

Y

Y

Y

Y

N

N

N

注：Y表示蓝色，N表示无色。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院

<120> 花生Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶AhSAD启动子及其制备方法和应用

<130> 植物基因工程技术

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 718

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaattttgag tatcatttta gtaatagtat tttttgaagg aaattgtttg ctatttggag 60

aggatatctc ttagtttggg atgtgggtta atgagatgtt atttgtgaga cagattgtgc 120

ggaagtattt aatcttgtta ctaatcatta atatggtttt gggtttattg atctattggt 180

gctcaaaata agggatatca tacattagaa ttagcatgtt gactttcatt tgattatgag 240

agatgtaaac acggtagcag atggcaaaaa tagcaatgaa gttacaactt ttttatgtga 300

aatttttttc accttaaaaa aaatttaaga atagtcttaa atacattcac ccaaaaaatc 360

tgagagatat tttttttttt ttacccattt tggaaataag gaaatgaaag ttgttttccg 420

ttcgggggga ttatagaagg gtaaaaatgt aaatgaagca acgcagctgg agataaagac 480

aaaactaccc ccaggcagtg gtactcaagt agatggaaag agaaggcata tactccctct 540

cccctaaggc cttctaaacc cattaagtgg ttctaaatca ttgcctgctt cttctcttca 600

ctaaaacaaa acccaagcgg aacctctctc tctctctctc cattcagaat ccttcactgc 660

ttacttacac ggattcgagc ttctctctct cgtcaatttc gaagacgcaa cacgaaaa 718

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccatgcggaa ccttggagat ctgagg 26

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actatagggc acgcgtggt 19

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagggttag ggttcagcct cagagccat 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaattttgag tatcatttta gtaatag 27

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttttcgtgtt gcgtcttc 18

Claims (9)

1.一种分离的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD ，其特征是：所述启动子P _AhSAD 的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

2.权利要求1所述的启动子P _AhSAD 的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）花生启动子P _AhSAD 的引物序列：

AP1：5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；

GSP1：5'–CCATGCGGAACCTTGGAGATCTGAGG–3'；

AP2：5'–ACTATAGGGCACGCGTGGT–3'；

GSP2：5'–GAAGGGTTAGGGTTCAGCCTCAGAGCCAT–3'；

（2）启动子P _AhSAD 制备的步骤：

根据基因组步移试剂盒说明，取5 μL花生的 DNA，用DraⅠ酶切，反应体系如下：DNA 5 μL，DraⅠ1.6μL，10×buffer 2 μL，用无菌水补齐至20 μL，37℃过夜，用质量体积比为1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；

分别用产生平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV、PvuII、StuI和SmaI在100μL体系内酶切2.0-3.0 μg的基因组DNA，反应体系如下：DNA 2.5 μg，限制性内切酶8 μL，10×buffer10 μL，无菌水补齐至100 μL，37℃过夜；

酶切完成后进行纯化，纯化步骤如下：向酶切液中加入10 μL 的3M 醋酸钠和50 μL 体积比为95%的乙醇溶液，-20℃沉淀3h，然后12000 rpm离心15 min，用体积比70%的乙醇洗涤两遍，12000 rpm离心5 min，室温下晾干，用20 μL无菌水溶解；

纯化完成后加入试剂盒提供的特异性接头Genome Walker Adaptor，反应体系如下：10×T4 ligase buffer 2.0 μL，酶切处理的DNA 8.0 μL，T4 ligase 1 μL，特异性接头Genome Walker Adaptor 14.0 μL，无菌水补至 20 μL，16℃过夜，将连接液用双蒸水稀释10倍，保存于-20℃；由此建立五种经限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库；

以建立的经五种限制性内切酶处理并连有特异性接头的DNA库为模板，进行两轮PCR反应，第一轮PCR反应以GSP1和AP1为引物，体系如下：10×buffer 5 μL，10mM 的dNTPsmixture 1.0 μL，10 μM的 GSP1 2.5 μL，10 μM的AP1 2.5 μL，5单位/μL的Taq 酶 0.2 μL，稀释的DNA库0.1 μL，无菌水补至50 μL；反应程序如下：94℃预变性1 min；98℃变性10 s，72℃延伸2 min，共7个循环；98℃变性10 s，68℃延伸2 min，共 33个循环；72℃ 10 min；

第二轮PCR反应，以第一轮PCR反应产物的50倍稀释液作为模板，以GSP2和AP2为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer 5 μL，10mM 的dNTPs mixture 1.0 μL，10 μM 的GSP22.5 μL，10 μM的AP2 2.5 μL，5单位/μL 的Taq 酶0.2 μL，稀释模板溶液1.0 μL，无菌水补至50 μL，反应程序同第一轮PCR，完成后回收纯化第二轮PCR产物，并与T载体连接，经测序获得含P _AhSAD 全长序列的DNA。

3.一种含有权利要求1所述花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 的重组载体pBI-P _AhSAD 。

4.一种权利要求3所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子PAhSAD重组表达载体的构建方法，其特征在于，用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切连接有P _AhSAD 的pMD18-P _AhSAD 和pBI121质粒，凝胶回收酶切下来的启动子片段和pBI121片段，连接转化大肠杆菌，构建成植物表达载体pBI-P _AhSAD 。

5.权利要求1中所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 在根部中的应用。

6.权利要求1中所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 在茎部中的应用。

7.权利要求1中所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 在叶片中的应用。

8.权利要求1中所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 在果针中的应用。

9.权利要求1中所述的花生Δ⁹-硬脂酰-ACP脱氢酶基因启动子P _AhSAD 在种子中的应用。