CN103602683B - 补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用，本发明的补骨脂种子特异性启动子具有种子特异性，在种子中大量表达，而在烟草的其他组织器官基本不表达，因此利用该启动子驱动外源基因的表达，一方面可以改良作物的种子组分，提高产量，同时也可以通过驱动抗病害基因，提高作物的抗病害能力、此外，由于在转基因烟草的花药中没有检测到GUS活性，因此利用该启动子还保证了转基因的安全性。

Description

补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用

技术领域

本发明涉及一种通过以分子生物学、基因组学以及功能基因组学为手段克隆补骨脂种子特异性表达启动子的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

首先，种子中含有丰富的碳水化合物，特别是淀粉、蛋白质及脂肪，为作物的生长提供必不可少的营养成分，同时，我们主要的粮食作物和油料作物如小麦、玉米、油菜等的主要食用部位均为种子，因此，对种子的改造是植物基因工程改良的重要目标。种子特异性启动子能够调控外源基因在种子中专一性表达，可按照人们的意愿改进并提高种子中的物质含量，满足日常需要。其次，种子作为植物的繁殖器官，通常成为动物、昆虫和微生物最爱的食物，于是在植物萌发过程中，由于此时物理屏障无法发生作用，对病原微生物等的抑制作用则要依赖种子中抗菌化合物的抗性。因此，通过种子特异性启动子启动外源抗病基因在种子中的特异性表达，既可以抵御昆虫、病原微生物的入侵，提高植物的抗病虫害能力，同时也能保证基因安全。

目前研究的种子特异性启动子种类繁多，包括种皮特异性启动子、胚乳特异性启动子等，为获得外源基因在种子中特异表达的转基因植物奠定了基础。Baumlein等将USP基因上游637bp片段与GUS基因连接后导入拟南芥，发现在转基因拟南芥中GUS基因在胚特异性表达。Russell连接水稻GluB-1基因启动子和GUS基因后转入玉米中发现，GluB-1基因启动子能够驱动GUS基因在胚乳外层特异性表达。Qu等将水稻SBE1基因启动子与GUS报告基因融合导入水稻后发现SBE1启动子可以控制外源基因在水稻种子盾片中特异性表达。研究种子特异性启动子，发挥其在植物基因工程中的作用，并通过与传统育种技术的结合，对选育高产优质的作物新品种具有重要的意义。

基于以上背景如何确定补骨脂种子特异性启动子，为利用种子特异性启动子进行作物的改良育种奠定技术基础是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了一种补骨脂种子特异性启动子及其在转基因植物上的应用，通过基因工程的手段，利用种子特异性启动子来安全有效地提高作物产量以及作物抗病害能力。

本发明的补骨脂种子特异性启动子，其至少包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还涉及含有上述补骨脂种子特异性启动子的基因或者是载体。

在本发明的另一方面，本发明还涉及上述补骨脂种子特异性启动子在制备转基因种子中的应用，优选的，在制备烟草种子中的应用。

克隆补骨脂种子特异性启动子的方法一染色体步移技术，以及基因特异性表达的鉴定

具体而言，根据抗菌蛋白Psc-AFP的基因编码序列设计引物，应用染色体步移技术，克隆得到上游未知启动子序列，利用生物信息学的方法(数据库分析：PLACE／PlantCARE)初步分析其可能具有种子特异性启动活性，并构建种子特异性启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体，经农杆菌介导，转入美国烟草，对转基因烟草进行GUS组织化学染色，确证了该启动子的种子特异性。其特征在于：

1、根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP编码序列的分析，设计TAIL-PCR特异性引物以及简并引物；

2、设计确定hiTAIL-PCR的反应程序，获得补骨脂种子特异性启动子pPscAFP序列，如SEQIDNo.1所示；

3、生物信息学的方法(数据库分析：PLACE／PlantCARE)分析其可能具有种子特异性启动活性，如SEQIDNo.1所示；

4、构建植物表达载体pBI121-pPscAFP：：GUS；所述的pBI121-pPscAFP：：GUS是指以pPscAFP为启动子，GUS为报告基因，Nos为终止子，Kan筛选转基因阳性植株的植物表达载体；

5、通过农杆菌介导法，获得转基因烟草阳性植株，通过GUS组织化学染色，证实了补骨脂pPscAFP启动子的种子特异性启动活性。

为了能更清楚地研究Psc-AFP蛋白抗真菌的作用机理，本研究通过染色体步移技术hiTAIL-PCR克隆了序列未知的补骨脂Psc-AFP基因5’上游的启动子区，并将所克隆的启动子序列与GUS报告基因融合构建植物表达载体pBI121-pPscAFP：：GUS，利用农杆菌介导的遗传转化体系转化美国烟草。对转基因烟草的根、茎、叶、花、种子分别进行GUS染色，表明pPscAFP启动子在烟草的种子中大量表达，在花瓣中微量表达，而在根、茎、叶、花药等组织器官中没有检测到GUS活性。因此，该启动子是一个重要的种子特异性启动子，可以做为一种安全、高效的种子特异性启动子应用于基因工程育种领域。

根据上述方法，已经成功获得转pBI121-pPscAFP：：GUS载体的转基因烟草，通过对各组织器官的GUS活性检测对比发现，该启动子的启动活性在种子中达到最大，在花瓣中只有微量表达，而在根、茎、叶、花药等组织器官基本不表达，证实了pPscAFP启动子的种子特异性，为植物基因工程育种提供了一种安全、有效的方法。

本发明的补骨脂种子特异性启动子pPscAFP在转基因植物上的应用：所述转基因植物的制备方法主要包含以下步骤：

1、将应用hiTAIL-PCR技术获得的pPscAFP启动子序列插入pBI121表达载体中，构建携带有该种子特异性启动子的植物表达载体pBI121-pPscAFP：：GUS；

2、将构建的植物表达载体pBI121-pPscAFP：：GUS转入农杆菌EHA105，获得阳性转化体；

3、将所述阳性转化体转化美国烟草，获得转基因植株；

本发明克隆得到的特异性启动子序列是全新的，从未报道过，通过PLACE和PlantCARE分析，该启动子在翻译起始密码子上游存在着多个可能的TATA-box和CAAT-box，同时发现许多重要的顺式作用元件，如光反应元件BoxI、乙烯反应元件ERE、赤霉素反应元件GARE-motif以及种子特异性调控元件RY-element等，如图1及表3所示。

本发明获得的启动子pPscAFP是克隆得到的全新的、具有较强种子特异性的启动子，有着以下优点：CaMV35S启动子是分子育种中较为广泛使用的组成型启动子，但由于其启动活性不具组织特异性，在各组织器官发育的不同阶段均有表达，随着基因工程安全性受到越来越多的关注，这种组成型强表达启动子已经不能满足转基因发展的需要，并且CaMV35S容易发生基因沉默；本发明克隆得到的启动子pPscAFP具有种子特异性，在种子中大量表达，而在烟草的其他组织器官基本不表达，因此利用该启动子驱动外源基因的表达，一方面可以改良作物的种子组分，提高产量，同时也可以通过驱动抗病害基因，提高作物的抗病害能力、此外，由于在转基因烟草的花药中没有检测到GUS活性，因此利用该启动子还保证了转基因的安全性。

附图说明

图1第一次hiTAIL-PCR扩增电泳图

图2第二次hiTAIL-PCR扩增电泳图

图3为植物表达载体pBI121-promoter(pBI121-pPscAFP：：GUS)

图4为农杆菌阳性转化子的GUS染色，初步表明克隆得到的5’上游序列具有启动子活性：A：pBI121-pPscAFP：：GUS的GUS检测(蓝色)B：空载pBI121-GUS检测(淡蓝色)C：农杆菌EHA105-GUS检测(无色)；

图5转基因烟草(从叶盘到生根和成苗的过程)

图6为转pBI121-pPscAFP：：GUS基因烟草的PCR检测；

图7为转pBI121-pPscAFP：：GUS基因烟草各组织器官的GUS染色：其中A.根，B.茎，C.叶，D.花，E.雄蕊和雌蕊，F.种子；

具体实施方式

【实施例1】补骨脂叶片总DNA的提取

利用CTAB法提取补骨脂基因组DNA：

(1)将4mLCTAB抽提液(100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.5MNaCl，2％CTAB，4％PVP40)以及相应量的β-巯基乙醇加入10mL离心管于65℃下预热；

(2)取1g补骨脂幼叶放入陶瓷研钵中，进行液氮研磨，将研磨好的幼叶加入预热的溶液中，再于65℃中水浴45min，期间颠倒混匀3次；

(3)取出离心管，加入4mL氯仿：异戊醇(24：1)，轻柔颠倒混匀，乳化10min；

(4)10000rpm下离心10min，取上清液3mL加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，放置15min；

(5)用移液枪枪头吸取沉淀放入有1mL75％乙醇的EP管中漂洗沉淀；

(6)吸干乙醇再用1mL75％乙醇漂洗一次，最后用无水乙醇再漂洗一次；

(7)室温下干燥，用500μLTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA)溶解沉淀，电泳检测后置于-20℃保存。

【实施例2】根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP基因编码序列，设计hiTAIL-PCR特异性引物与简并引物，相继进行第一次、第二次hiTAIL-PCR扩增

根据补骨脂抗菌蛋白Psc-AFP基因编码序列SEQID4，按照hiTAIL-PCR法实验原理，设计特异性引物和简并引物(如表1)，分两次扩增Psc-AFP基因上游启动子序列，PCR反应程序如表2所示。

表1hiTAIL-PCR的引物对

表2hiTAIL-PCR的反应程序

PCR反应体系如下所示：

①预扩增PCR体系：

预扩增产物稀释40×，取1μL用作第一轮PCR扩增的模板。

②第一轮PCR扩增体系：

预扩增产物稀释20×，取1μL用作第二轮PCR扩增的模板。

③第二轮PCR扩增体系：

两次hiTAIL-PCR扩增的序列分别为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2。

【实施例3】拼接两次hiTAIL-PCR扩增序列获得全长5’上游启动子序列SEQIDNO.5，在PLACE和PlantCARE进行启动子顺式作用元件的初步分析，并设计引物扩增补骨脂Psc-AFP基因启动子全段序列(上、下游引物分别加上酶切位点(BamHI、HindIII)，两次hiTAIL-PCR扩增的序列拼接结果为SEQIDNO.3所示的序列。据此设计引物扩增补骨脂Psc-AFP基因启动子pPscAFP全段序列SEQIDNO.5。上、下游引物分别加上酶切位点(BamHI、HindIII)：

Primer-F：5’-CCCAAGCTTGTTCATCCCGCAAGGACTAC-3’

Primer-R：5’-CGGGATCCATCGTGGCTTGGCTATATC-3’

以提取的补骨脂基因组DNA为模板，利用引物Primer-F和Primer-R进行常规PCR扩增，获得pPscAFP启动子全段序列，并克隆入pMD19-T载体(常用的大肠杆菌克隆载体，购自宝生物大连有限公司)，获得pMD19-T：pPscAFP。

【实施例4】pBI121-pPscAFP：：GUS表达载体的构建

分别用BamHI、HindIII双酶切pBI121载体(含有GUS报告基因的植物转基因常用表达载体，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号：MCV032)和pMD19-T：pPscAFP，分别回收载体pBI121【含有Gus报告基因，即β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase，)基因】和pPscAFP启动子片段，将回收载体pBI121和pPscAFP启动子利用T4连接酶4℃连接过夜，次日转化涂板，37℃培养箱过夜，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆，提取质粒做双酶切检测以及PCR扩增检测，所得载体命名为pBI121-pPscAFP：：GUS(图3)，将载体转入EHA105农杆菌中。

【实施例5】烟草的遗传转化

含有pBI121-pPscAFP：：GUS载体根瘤农杆菌EHA105侵染液的准备：挑取经验证的农杆菌阳性单菌落入25mLYEP液体培养基中，于200rpm／min，28℃条件下振荡培养16-24h，即进行一活培养。吸取300μL一活菌液入50mLYEP液体培养基中，条件同上扩大培养，即进行二活培养，待菌液培养到OD600为0.5左右。将二活菌液于4℃下4000rpm／min，离心10min，弃上清，菌体用等体积MS悬浮液悬浮1-2h，稀释至OD600=0.1，即可用于烟草遗传转化。

根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化

(1)预培养

剪取烟草无菌苗或试管苗完全展开的叶片，切去叶缘，切成0.5×0.5cm大小，接种于MS分化培养基上，培养温度为25℃，暗培养2天，光照强度为2000×。

(2)转化再生

将预培养的个植体放入制备好的农杆菌工程菌液中浸泡约10min，每2-3min进行轻微晃动培养瓶，使叶片与菌液能够充分接触。将外植体转移到无菌滤纸上吸干残留的菌液，叶片背面向下放在共培养基上，25℃暗培养2天，使转化农杆菌的T-DNA转移到植物细胞的基因组上。取出共培养叶盘，转移至MS(Kan+)选择培养基上，背面向下，边缘压入培养基中，25℃培养光周期为16／8，进行抗性筛选。一周更换一次选择培养基，并及时清理农杆菌污染的叶盘材料。

(3)生根培养

待分化芽长至2-3cm左右时，切下，插入生根培养基中。约1～2周即可长出不定根。2-3周后对生长良好的转化苗进行炼苗，并移植于花盆中栽种。

【实施例6】转基因烟草植株的PCR扩增检测及GUS组织化学染色

转基因植株的PCR检测

(1)基因组提取

在烟草生根转移至大棚后，继续培养，正常供水，采取转基因烟草植株叶片，作为烟草基因组提取材料。

(2)PCR检测

阳性转基因烟草中含有pPscAFP基因启动子序列，而野生型烟草中不含此序列，因此用pPscAFP启动子的特异性引物primer-F、primer-R，以提取的待检测转基因烟草基因组DNA作为模板，进行PCR扩增鉴定阳性植株。并用野生型烟草基因组DNA作为对照。保留鉴定呈阳性的转基因植株，移除转基因未成功的植株。

转pBI121-promoter重组质粒的阳性转基因烟草中含有GUS基因序列，野生型烟草中不含有GUS基因序列，因此用GUS基因的引物作为引物，并以提取的待检测转基因烟草基因组DNA作为模板，进行PCR扩增GUS基因序列，鉴定阳性植株。并用野生型烟草基因组DNA作为对照。

转基因烟草植株各组织器官的GUS组织化学染色

(1)GUS染色液的配制如下：

取5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc)50mg，将其溶于0.5mL的二甲基亚砜。取40mL50mmol／L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，加入0.5mL50mmol／L铁氰化钾、0.5mL50mmol／L亚铁氰化钾和1mL0.5mol／L的EDTA(pH8.0)，再加入已溶解的X-Gluc，然后加入10mL的甲醇，混匀。将配好的GUS检测液分装于1.5mL的塑料管中，-20℃保存备用。

(2)GUS组织化学染色方法：

取转基因烟草植株的根、茎、叶、花蕾、花、种子，并分别放入1.5mL无菌离心管中，加入预先配制好的GUS染色液，并浸没材料，于37℃水浴过夜，进行GUS染色。然后取出材料，用75％的乙醇漂洗几次后用20％、30％、40％、50％的乙醇依次浸泡半个小时左右，进行脱色。然后，在显微镜下进行观察，拍照；结果见图7。其中，A-根、B-茎、C-叶、D-花蕾、E-花均未被染出蓝色、只有F-种子被染出蓝色。表明pPscAFP启动子具有种子特异性。

组织化学染色检测是以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检测材料用含有底物的缓冲液浸泡；若组织细胞发生了gus基因的转化，表达出β-葡萄糖苷酶(GUS)，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种补骨脂种子特异性启动子，其特征在于所述启动子序列如SEQIDNO.3所示。

2.权利要求1所述的补骨脂种子特异性启动子或者含有权利要求1所述的补骨脂种子特异性启动子的基因或者是载体在制备转基因种子中的应用。