CN101831425B - 一种植物光周期相关启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物光周期相关启动子及其应用。该启动子，为核苷酸序列如下述1)、2)、3)或4)所示的DNA分子：1)序列表中序列1中自5′末端第1-920位核苷酸所示的DNA分子；2)核苷酸序列为序列表中序列1中任意一段包含如下序列的DNA分子：序列表中序列1中自5′末端第776-920位核苷酸。本发明的启动子可以调节植物的光周期；可以控制基因不在大豆种皮和成熟种子中表达；可以控制基因在维管束组织中表达。将本发明启动子用于遗传育种，可以有效的改善植物的光周期，提高其适应性，使植物在更广泛的环境下生长；尤其对农作物而言，可以在更广范的环境和条件下种植农作物，改良作物品种，进而提高作物产量。因此，本发明启动子在遗传育种中将会有广阔的应用前景。

Description

一种植物光周期相关启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物光周期相关启动子及其应用。

背景技术

大豆是光周期反应敏感的短日照植物，其开花时间是重要的农业数量遗传性状，在光周期反应的早期研究中被作为重要的模式植物。大多数大豆植物的生长发育对光周期效应是敏感的，短日照促进开花，反之长日照则推迟抑制花芽生长。这一特性严重阻碍大豆品种的适应性，是制约大豆单产提高和稳产的关键因素。大豆品种的适应范围较窄，因此需要众多光周期反应各不相同的品种类型，分别适应各种不同的生态条件。为了降低大豆品种的光敏感性，扩大大豆品种的种植区域，缓解育种压力，需要从分子水平控制大豆开花与结实的光周期现象，因此，大豆光周期途径相关基因的研究显得尤为重要。

转录因子调节蛋白RAV首先在拟南芥中被克隆出来，含有AP2/ERF和B3两种DNA结合结构域。RAV基因参与了植物的光周期、赤霉素途径等多种植物开花时间的信号途径。在辣椒中的研究还表明，RAV蛋白作为转录激活物定位在细胞核中。辣椒RAV被病原、植物激素、非生物以及环境压力所诱导，RAV参与病原感染防卫反应，诱导防卫基因的表达。

植物的生长发育、遗传和对环境的反应都是由不同的基因在特定的时间和空间上协调表达的结果。而基因按一定时间空间表达调控与基因的启动子功能密切相关。植物基因启动子是基因调控的重要顺式作用元件，它位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能指导全酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，并决定转录起始的特异性、转录的方向和效率以及结合RNA聚合酶的类型。根据启动子的转录模式，植物基因的启动子可分为以下3类：组成型启动子(constitutive promoter)、组织特异型启动子(tissue-specific promoter)和诱导型启动子(induciblepromoter)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植物光周期相关的启动子。

本发明所提供的启动子，为核苷酸序列如下述1)、2)、3)或4)所示的DNA分子：

1)序列表中序列1自5″末端起第49-920位核苷酸；2)序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸；3)序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸；4)序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸；5)序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸；6)序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸；7)序列表中序列1中自5′末端起第1-920位核苷酸所示的DNA分子；8)核苷酸序列为序列表中序列1中任意一段包含如下序列的DNA分子：序列表中序列1中自5′末端起第776-920位核苷酸；9)在严格条件下与1)-8)限定的DNA序列杂交且与植物光周期相关的DNA分子；10)与1)-8)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且与植物光周期相关的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

该启动子名称为GmRAV启动子，来源于大豆。

扩增上述启动子全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对具体可为下述任一所述的引物对：

1)一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸。2)一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸。3)一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸。4)一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸。5)一条引物序列如序列表中序列6所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸。6)一条引物序列如序列表中序列7所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示；扩增序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸。7)一条引物序列如序列表中序列9所示，另一条引物序列如序列表中序列10所示。扩增序列表中序列1自5′末端起第1-920位核苷酸。

含有上述任一所述启动子的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述启动子在调节植物光周期中的应用也属于本发明的保护范围。在实际应用中，通过植物表达载体，将本发明启动子转入植物中，进而改善植物的光周期功能。

上述任一所述启动子在培育耐逆性植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述耐逆性为耐干旱和/或耐盐。

上述任一所述应用中，所述植物可为任何一种植物，具体可为烟草、拟南芥或大豆。

表明该启动子表达具组织特异性、受发育时期调控及受非生物胁迫诱导表达。

本发明实验证明，将本发明启动子与GUS基因一起导入拟南芥中后，甲基茉莉酸、水杨酸、赤霉素、6-BA、脱落酸、NaCl处理均能促进GmRAV启动子调控GUS基因的表达；该启动子受水杨酸诱导表达，表明该启动子在植物胁迫抗性中起作用；该启动子受茉莉酸甲酯诱导表达，表明其参与抗逆、病原防卫反应；该启动子受脱落酸诱导表达，表明其参与脱落酸依赖的抗旱、以及防卫反应；该启动子受NaCl诱导表达，表明其参与耐盐反应。

GmRAV启动子全长序列中从-1到-227区段的227bp的长度就可以实现全长启动子的诱导功能。带有的该227bp长片段的植株受诱导处理后，都能启动GUS基因的表达，并且GUS基因在组织中的表达部位和强度各不相同。

本发明的启动子可以调节植物的光周期。本发明的启动子属于诱导型启动子可以根据其对光周期和不同外界环境生物压力如盐等的可诱导性，用于提高基因的表达量。将本发明启动子用于遗传育种，可以有效的改善植物的光周期，提高其适应性，使植物在更广泛的环境下生长；尤其对农作物而言，可以在更广泛的环境和条件下种植农作物，改良作物品种，进而提高作物产量。并且该启动子具有维管束组织特异表达性(即不在大豆种皮和成熟种子中表达，控制基因在维管束组织中表达)，具有刺吸式口器的农业害虫(如蚜虫、稻飞虱等)都是从维管组织中吸食植物的汁液，严重危害作物的生长、发育和成熟，给农业生产造成巨大损失。通过GmRAV基因启动子使抗虫基因在作物的维管组织特异表达将能有针对性地、高效地防治此类害虫，还可降低对害虫的选择压，减轻植物表达抗虫基因的代谢负担。植物病毒在形成系统感染时，必须通过维管组织远程传播，用GmRAV基因启动子使抗病毒基因在作物的维管组织特异表达将能有效的控制病毒的发生和危害。同时，控制基因不在种子中表达，可以提高转基因作物的食用安全性.因此，本发明启动子在遗传育种中将会有广阔的应用前景。

附图说明

图1为GmRAV基因启动子Tail-PCR扩增结果。

图2为GmRAV基因启动子顺式作用元件分析。

图3为不同GmRAV基因启动子缺失片段与GUS基因融合示意图。

图4为不同GmRAV基因启动子序列和pBI121质粒载体构建示意图。

图5为GmRAV基因启动子不同片段的PCR扩增结果。

图6为GmRAV基因启动子不同片段转化农杆菌后的PCR扩增结果。

图7为不同GmRAV基因启动子缺失片段转基因苗的GUS基因表达示意图。

图8为GmRAV基因启动子全长GUS组织特异性表达示意图。

图9为GmRAV基因全长启动子的暗诱导下的GUS基因表达示意图。

图10为黑暗处理转基因植株后叶片中的GUS活性示意图(pmol 4-MU/min/mgprotein代表皮摩尔4-甲基伞形酮/分钟/毫克蛋白)。

图11为水杨酸(SA)喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图12为茉莉酸甲酯喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图13为赤霉素喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图14为细胞分裂素喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图15为脱落酸喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图16为NaCl喷施转基因植株后叶片中的GUS活性示意图。

图17为黑暗处理转基因植株后的RT-PCR结果。

图18为细胞分裂素喷施含GmRAV基因启动子转基因植株的RT-PCR结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、启动子GmRAV序列的获得

1、植物总DNA的提取

大豆(Glycine max(L.)Merri ll.)晚熟品种东农L13，具有无限结荚习性，培养于25℃光照培养箱，250μmol m^-2sec^-1白光，长日照(LD)(16h/8h光/暗)条件下生长，剪取第三个三出复叶，按照CTAB法提取大豆总DNA；

2、引物设计：设计5′侧翼序列下游引物。具体引物序列如表1所示。

表1、不同位置的引物序列及简并引物

引物位置(距ATG)和名称	引物序列(5’→3’)
		G1：448	GGCGGCTTCGTCTTCCTCGTT
G3：153	TGTGAAGTGAGTGCAGATAAGGGT
		G4：62	GGAAGAAACAGAGAGAAACTTGAGAA
简并引物	CAWCGICNGAIASGAA

3、Tail-PCR反应的流程

(1)制备PCR混合物，如表2所示

表2、PCR反应体系

试剂	每管加入量(μL)
		PCR级水	14.75
模板DNA	1
		简并引物	4
下游引物	0.5
		dNTPMix(10mM)	0.25
10×LA PCR缓冲液	2.5
		总体积	25

PCR扩增程序：如表3所示。

表3、Tail-PCR的反应条件

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。M为2000marker，1、2和3分别为三次Tail PCR的产物。将最后得到的产物进行测序，产物的序列如序列表中序列1所示，即为本发明启动子GmRAV的序列。

实施例2、启动子的功能

GUS基因即为转β-葡糖醛酸酶基因。

遗传资源名称：大豆(Glycine max(L.)Merrill.)品种东农L13的种子。遗传资源的获取途径：I、遗传资源取自：植物，II、获取方式：赠送(购买/赠送或交换/保藏机构/种子库(种质库)/基因文库/自行采集/委托采集/其他)。直接来源：获取时间2006年10月；非采集方式，提供者姓名或名称：东北农业大学大豆科学研究所，提供者所处国家或地区：中国黑龙江省，提供者联系方式0451-55190484，中国哈尔滨市木材街59号。原始来源不清楚。

大豆(Glycine max(L.)Merrill.)品种东农L13的种子(Lin Zhao，Qiulan Luo，Chunl iang Yang，Yingpeng Han，Wenbin Li(2008)A RAV-like transcription factorcontrols photosynthesis and senescence in soybean.Planta 227：1389-1399)(东北农业大学)。

一、构建转入启动子GmRAV的转基因植物

(一)启动子GmRAV序列的分析

对启动子序列进行分析，结果，该启动子有1个与茉莉酸诱导相关的基序；1个与水杨酸有关的基序；1个与芽有关的基序；1个与厌氧芽有关的基序ARE；1个与真菌有关的基序；1个与胁迫(如盐)有关的基序；1个与昼夜节律有关的基序；10个与光暗有关的基序(图2，较大的黑体字母C为预测的转录起始位点，预测的作用元件下面都标此名称；方框内为TATA-box，CAAT-box元件和翻译起始密码子ATG；箭头为载体构建时设计的引物位置和方向。)。将该启动子序列分解成六个不同的功能区段，即序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸(-872～-1bp)，序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸(-737～-1bp)，序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸(-688～-1bp)，序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸(-338～-1bp)，序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸(-227～-1bp)和序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸(-145～-1bp)。

(二)重组载体的构建：

1、需构建的重组载体如下(图3)：

重组载体p-GmRAV1中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸；重组载体p-GmRAV2中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸；重组载体p-GmRAV3中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸；重组载体p-GmRAV4中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸；重组载体p-GmRAV5中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸；重组载体p-GmRAV6中的GmRAV启动子序列为序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸；上述各载体中GmRAV启动子完整序列或部分序列调控其下游基因GUS的表达。

2、各重组载体的构建方法

(1)6个启动子片段的获得：将序列表中序列1所示的启动子基因连入pMD-18T载体，将重组载体转入大肠杆菌，提取质粒，酶切及测序验证，得到阳性重组菌。提取阳性重组菌的质粒，以该质粒为模板，用表4所示引物进行PCR扩增，得到6个不同的启动子片段，PCR反应条件为，预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s；退火：65℃(每循环降0.2℃)，30s；延伸：72℃，90s；循环：45次；后延伸：72℃，5min。上述6个5′端GmRAV启动子缺失片段的PCR产物电泳图谱见图5。图5中，1，2，3，4，5，6分别为p-GmRAV1(872bp)；p-GmRAV2(737bp)；p-GmRAV3(688bp)；p-GmRAV4(338bp)；p-GmRAV5(227bp)；p-GmRAV6(145bp)；7为阴性对照；M为2000marker。

表4、扩增启动子部分片段的引物序列

片段序列	片断长度和引物名称	序列(5′-3′)
			序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸	-872～-1片段的引物	TCTAAGCTTTCTTTCTCTTCACATCAC(序列2)
序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸	-737～-1片段的引物	ATTAAGCTTTACATCTATTTTTATCTC(序列3)
			序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸	-688～-1片段的引物	TTCAAGCTTACATCATATATCGCATTT(序列4)
序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸	-338～-1片段的引物	TCACAAGCTTTGAATCTTCCTCCGT(序列5)
			序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸	-227～-1片段的引物	TAAAAGCTTCATTACATTAGCTCAGGT(序列6)
序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸	-145～-1片段的引物	ACCAAGCTTATTCTCAAGTTTCTCTC(序列7)
				各长度片断的反向引物	GGTGGATCCTTGTGTTGGTAATTAATT(序列8)

(2)6个启动子片段的重组载体的获得

载体pBI-121(Lin Zhao，Qiulan Luo，Chunliang Yang，Yingpeng Han，Wenbin Li(2008)A RAV-like transcription factor controls photosynthesis and senescencein soybean.Planta 227：1389-1399)(东北农业大学)；

将获得的6个片段的PCR产物分别连接到pMD-18T载体上，再将重组的载体质粒转入大肠杆菌DH5α，PCR鉴定为阳性菌后再测序鉴定。分别提取质粒，得到阳性重组质粒，分别记作pMD-18T/GmRAV1、pMD-18T/GmRAV2、pMD-18T/GmRAV3、pMD-18T/GmRAV4、pMD-18T/GmRAV5、pMD-18T/GmRAV6。

分别用6个启动子片段替换载体pBI-121中的CaMV35S启动子，得到上述各重组载体；出发载体pBI-121中GUS基因受CaMV35S启动子的调控，重组载体中，GUS基因受启动子片段的调控。

6个重组载体p-GmRAV1-6的具体构建方法如下(图4)：将6个阳性重组载体pMD-18T/GmRAV1-6分别用限制性内切酶BamHI和HindIII进行酶切，再与同样经BamHI和HindIII酶切的载体pBI-121连接，即得到重组载体p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5、p-GmRAV6。

(3)将上述各重组载体转化大肠杆菌，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定，结果证明，得到的重组载体的结构正确及插入的基因序列正确。

(三)重组载体转化至农杆菌

农杆菌LBA4404(陈中健刘兵 王宏斌 王金发 刘良(2003)水稻重复序列RRD3缺失体介导gusA在水稻愈伤组织中的表达式。热带亚热带植物学报，1I(2)：127-131)(东北农业大学)；

pK2013(Daniela Billi，E.Imre Friedmann，Richard F.Helm，and MalcolmPotts(2001)Gene Transfer to the Desiccation-Tolerant CyanobacteriumChroococcidiopsis。Journal of Bacteriology，p.2298-2305，Vol.183，No.7)(东北农业大学)；

1、转化：将步骤(二)得到的重组载体p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5、p-GmRAV6分别转化至农杆菌LBA4404，再经筛选、鉴定，分别得到含有各重组载体的重组农杆菌。

具体方法如下：三亲杂交方法转化根癌农杆菌的方法：

1)将LBA4404农杆菌放入含相应抗生素的YEP液体培养基里培养1-2天。将pK2013放入含有KAN抗生素的LB液体培养基里过夜培养。将含重组质粒的大肠杆菌放入含相应抗生素的LB液体培养基里过夜培养。

2)当三种菌液达到OD值为0.6时，分别将其从摇床中取出。各取1000μL加入到离心管中，离心5min，弃上清液。分别加入1000μL相应的不含抗生素的液体培养基重悬，再离心5min，弃上清液。然后再加入1000μL相应的不含抗生素的液体培养基重悬。

3)分别取三种菌液100μL混合于一个EP管中。将混合液滴于不含抗生素的LB固体培养基上，过夜培养。

4)用接菌环在LB固体培养基上沾取少量的菌落，用划线的方式接种于含抗生素的LB培养基上，培养1-2天。

5)挑取白色单菌落在含有适当抗生素的YEP液体培养基(RifR，StrR，KanR)中培养，PCR鉴定阳性克隆。

2、重组农杆菌的鉴定：

启动子片段PCR鉴定：分别以各重组菌为模板，以表4中所述引物进行扩增。

GUS基因PCR鉴定：分别以各重组菌为模板，以表5中所述引物进行扩增。

鉴定结果如图6所示。结果表明：图A中PCR扩增GmRAV启动子结果与预期的片段大小相吻合，图B中GUS引物扩增的片段大小也吻合，说明已经获得阳性重组农杆菌菌株。图6中，A图为启动子缺失片段引物的PCR结果；B图为GUS基因引物的PCR结果。从左至右为：M代表分子量标记，a、b、c为表达载体p-Gm RAV1(872bp)菌落PCR结果；d、e、f为表达载体p-GmRAV2(737bp)菌落PCR结果；g、h、I为表达载体p-GmRAV3(688bp)菌落PCR结果；j、k、l为表达载体p-GmRAV4(338bp)菌落PCR结果；m、n、p为表达载体p-GmRAV5(227bp)菌落PCR结果；q、r、s为表达载体p-GmRAV6(145bp)菌落PCR结果。

(四)重组农杆菌转化拟南芥

将步骤(三)得到的重组农杆菌利用花浸泡法分别转化拟南芥(Col生态型)，获得T0代种子，将转基因拟南芥T0代种子4℃春化2天后，播种于含50μg/mL Kan的MS培养基上，25℃可见光下让其萌发，观察种子的萌发情况，记录萌发比例。经60天左右的生活周期，得到转基因拟南芥T1代种子。

二、转入启动子GmRAV的转基因植物的功能验证

(一)GmRAV在植株中组织特异性表达情况

将转基因拟南芥T1代种子进行培养，然后通过组织化学法检测培养不同时间的转基因植株的不同组织中GmRAV启动子调控的GUS表达情况，进而知道GmRAV启动子的表达情况。

GUS表达情况的组织化学检测方法：通过无菌操作，将要检测的植株小心取出，转移至GUS染液中，使材料和染液的体积比小于1∶5，放入37℃温育过夜。待GUS渗入材料后，将材料转入透明液中透明，以脱掉叶绿素，放置于室温下3-5小时，直到绿色完全去除。最后，将经透明处理后的植物材料在解剖镜下观察，有GUS表达的部位呈现出稳定且不溶于透明液的蓝色，照相保存图像。

以下天数计算时，均将播种当天记作第1天。

培养16天(播种当天记作第1天)后得到的转基因拟南芥苗中的GUS基因表达情况如图7所示。图7中，1、2、3、4、5、6分别为转入重组载体p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的转基因苗。表明这6种不同缺失程度的启动子都能驱动GUS基因表达，只要GmRAV启动子中含有序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸(全长序列中从-1到-145区段的145bp的长度)，均能启动GUS基因的表达；但转入六种载体的转基因植物中，GUS基因表达水平不同，随缺失长度增加，表达水平下降。转入六种载体的转基因植物中，GUS基因在组织中的表达部位基本一致，即GUS染色部位都主要分布在叶片维管束，茎尖和下胚轴中。

转入重组载体p-GmRAV1的转基因植株中GUS表达情况如图8所示。在种子萌发0天、1天、5天、8天、15天时，检测幼苗中GUS的表达情况，结果表明在16-h萌发胚和1天幼苗中，GUS基因在正在发育的子叶中表达(图8、A-B)。GUS在5、8和15天幼苗的莲座叶片和下胚轴的维管束中表达，尤其在茎尖中表达量极高(图8、C-E)。伴随转基因拟南芥幼苗的进一步发育，30天大小的转基因植株，子叶及莲座叶的维管束中的GUS基因则呈优势表达(图8、F-K)；在茎生叶中没有GUS基因的表达(图8、L)。在种子萌发30天时，在根中有表达(图8、R)；在不同的花器官中，GUS在花托、萼片、花丝的维管束，雌蕊和花药部位均有表达(图8、M-N)。果实中的GUS基因表达主要集中长角果的维管束部位均有表达(图8，O-Q)。在花粉和种子形成的过程中均未检测到GUS活性(图8，P)。

综合图7和8表明GmRAV启动子中只要含有序列表中序列1自5′末端第776-920位核苷酸(全长序列中从-1到-145区段的145bp的长度)就能启动GUS基因的表达，并且在组织中的表达部位与全长启动子一致，GmRAV启动子全长在正常生长条件下，能启动GUS基因在根和莲座状叶片中维管束细胞中特异表达，尤其莲座状叶片时期GUS染色在茎尖最强，可能与细胞分裂有关，但在茎生叶中无表达。在花瓣、萼片、雄蕊和雌蕊柱头以及长角果果皮中都有表达，但种皮无GUS染色，说明该GmRAV启动子具有时空表达特异性。

(二)启动子与光周期的关系

1、转入重组载体p-GmRAV1的拟南芥T1代种子的暗诱导培养，实验组：将T1代转重组载体p-GmRAV1的拟南芥植株在暗下发苗，22℃，4天后，将其与对照进行GUS染色(图9，右侧为转基因植株在暗下发苗的GUS染色图片，左侧为转基因植株在正常培养下的GUS染色图片)，对照组则生长在22℃，连续光照120μmols^-1m^-2的条件下。结果表明：黑暗能诱导GmRAV启动子在下胚轴和子叶中高效表达。

2、转入重组载体p-GmRAV1的拟南芥T1代种子的暗处理培养：

(1)检测叶片中GUS活性

实验组：将转入重组载体p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，22℃，光照120μmols^-1m^-2，长日照16h光/8h暗，然后进行暗处理，取材进行检测。暗处理时间分别为：1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h。

对照组：将转入重组载体p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天22℃，光照120μmols^-1m^-2，长日照16h光/8h暗，然后在连续光照的条件下培养，取材进行检测。

实验组和对照组的取材时间相同。

取叶片100mg，进行GUS荧光定量分析。检测叶片中的GUS活性。

GUS活性的检测方法如下：

1)GUS蛋白的提取：称取100mg叶片，放置液氮中研磨成粉。加入5倍体积的提取缓冲液，制成匀浆。10000rpm/min 4℃离心10min，收集上清液(即为GUS蛋白溶液)，于冰箱中保存备用。

2)蛋白含量测定：取步骤1)得到的GUS蛋白溶液20μL，加H₂O至4mL，再加入1mL考马斯亮蓝溶液，混匀，室温下放置2min。测定595nm光吸收值，根据标准曲线计算样品蛋白含量。

3)GUS酶反应

GUS酶反应：取GUS蛋白溶液，加0.2mlMUG(甲基伞形酮葡糖酸)抽提缓冲液，37℃反应，适时加入1ml0.2M Na₂CO₃终止反应，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下检测不同反应时间各样品的荧光强度。

4)GUS酶活力计算

以酶反应时间对荧光强度作图，直线部分的斜率就是各样品的总酶活力；将样品总酶活力除以上述步骤2)得到的样品蛋白含量，就是各样品的酶比活力。

GUS活性检测结果如图10所示。结果表明黑暗处理后GmRAV基因启动子驱动的GUS基因表达呈先增加后减少的状态，在黑暗诱导12h时处，上调诱导强度最大。

(2)PCR检测连续黑暗条件下GmRAV基因的昼夜节律性

将转入重组载体p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，22℃，光照120μmols^-1m^-2，长日照16h光/8h暗，取材进行检测。暗处理时间分别为：3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h、30h、33h、36h、39h、42h、45h、48h。检测叶片中的GmRAV启动子启动GUS基因的节律性表达情况。提取叶片RNA，进行RT-PCR，引物如表4所示。结果如图17所示，结果表明GmRAV基因受生物钟的调控，在连续暗下呈现节律性的表达，并且受黑暗诱导。

表5、RT-PCR引物序列

引物	引物序列(5’→3’)
		GUS上游引物	TGGCAGTGAAGGACCAACAGT(序列9)
GUS下游引物	TGAGCGTCGCAGAACATTACA(序列10)

(三)水杨酸(SA)诱导对转基因植株中启动子的影响

图11A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用5mmol/L的水杨酸(SA)溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。

图11A的对照组：喷施不含水杨酸的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，水杨酸可以诱导启动子表达，且启动子调控的GUS活性随处理时间的延长而提高，在8h达到最大值，GUS活性是处理前的6.8倍。然后开始下降。据此可以初步确定，水杨酸是GmRAV基因启动子的诱导物。

图11B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用5mmol/L的水杨酸(SA)溶液喷施处理植株叶片，处理8h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。

图11B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，水杨酸可以诱导p-GmRAV1中的启动子表达，对其它片段没有作用，据此可以初步确定，水杨酸的响应原件在-827-737之间，这与启动子分析的响应原件一致。

(四)茉莉酸甲酯诱导对转基因植株中启动子的影响

图12A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用1mmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。

图12A的对照组：喷施不含茉莉酸甲酯的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，水杨酸可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在4h达到最大值，GUS活性是处理前的5.8倍，然后活性逐渐降低。据此可以初步确定，茉莉酸甲酯是GmRAV基因启动子的诱导物。

图12B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用1mmol/L的茉莉酸甲酯溶液喷施处理植株叶片，处理4h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。

图12B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，茉莉酸甲酯可以诱导p-GmRAV1和p-GmRAV2中启动子表达，对其它片段没有作用，据此可以初步确定，茉莉酸甲酯的响应原件在-737-688之间，这与启动子分析的响应原件一致。

(五)赤霉素诱导对转基因植株中启动子的影响

图13A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用2mmol/L的赤霉素溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。

图13A的对照组：喷施不含赤霉素的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，赤霉素可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在4h达到最大值，GUS活性是处理前的5.1倍，然后逐渐降低。据此可以初步确定，赤霉素是GmRAV基因启动子的诱导物。

图13B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用2mmol/L的赤霉素溶液喷施处理植株叶片，处理4h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。

图13B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，赤霉素可以诱导各个GmRAV的片段的GUS表达，据此并不能推出赤霉素的响应原件位置，有待于作进一步验证。

(六)细胞分裂素诱导对转基因植株中启动子的影响

图14A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用5mmol/L的细胞分裂素(6-BA)溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。

图14A的对照组：喷施不含细胞分裂素的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，细胞分裂素可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在8h达到最大值，GUS活性是处理前的5.0倍，然后逐渐降低。据此可以初步确定，细胞分裂素是GmRAV基因启动子的诱导物。

图14B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用5mmol/L的细胞分裂素溶液喷施处理植株叶片，处理4h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。

图14B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，细胞分裂素可以诱导各个GmRAV片段的GUS表达，据此并不能推出细胞分裂素的响应原件位置，有待于作进一步验证。

图18的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用5mmol/L的细胞分裂素溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片提取RNA。，做半定量RT-PCR，对照组为0h未喷洒时的样品。

结果表明，细胞分裂素可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在8h达到最大值，诱导趋势与图14，A荧光定量检测结果一致，进一步说明细胞分裂素是GmRAV基因启动子的诱导物，更加证明了GmRAV基因参与细胞分裂素途径。

(七)脱落酸诱导对转基因植株中启动子的影响

图15A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用1mmol/L的脱落酸溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。

图15A的对照组：喷施不含激素的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，脱落酸可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，GUS活性是处理前的4.4倍。据此可以初步确定，脱落酸是GmRAV基因启动子的诱导物。

图15B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用1mmol/L的脱落酸溶液喷施处理植株叶片，处理8h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。

图15B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，脱落酸可以诱导p-GmRAV1、p-GmRAV2和p-GmRAV3GUS表达，对其它片段没有作用，据此可以初步确定，脱落酸的响应原件在-688--338之间，这与启动子分析的响应原件一致。

(八)NaCl诱导对转基因植株中启动子的影响

图16A的实验组：转入p-GmRAV1的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用0.3mol/L的NaCl溶液喷施处理植株叶片，分别在处理1、2、4、8、12、24、48h取叶片检测GUS活性。图16A的对照组：喷施不含氯化钠的溶剂(其他溶液组分与处理组相同)

结果表明，NaCl可以诱导GUS表达，且活性随处理时间的延长而提高，在2h达到最大值，GUS活性是处理前的4倍，然后降低。据此可以初步确定，NaCl是GmRAV基因启动子的诱导物。

图16B的实验组：转入启动子的拟南芥T1代种子在正常条件下培养16天，用0.3mol/L的NaCl溶液喷施处理植株叶片，处理2h，取叶片检测GUS活性。转入启动子的拟南芥分别为转入p-GmRAV1、p-GmRAV2、p-GmRAV3、p-GmRAV4、p-GmRAV5和p-GmRAV6的拟南芥。图16B的CK组为未转入任何基因的拟南芥植株。

结果表明，NaCl可以诱导p-GmRAV1、p-GmRAV2和p-GmRAV3GUS表达，对其它片段没有作用，据此可以初步确定，NaCl的响应原件在-688--338之间，这与启动子分析的响应原件一致。

上述实验(二)-(八)表明：通过荧光分光光度计检测表明：启动子受黑暗诱导表达，诱导倍数为对照转基因植株的5.6倍；GUS染色发现在黑暗下生长3d的苗比光下生长的苗在下胚轴、根和茎尖均要染色更强。受水杨酸诱导表达，在8h达到最大值，诱导倍数为对照转基因植株的6.8倍；受茉莉酸甲酯诱导表达，在4h达到最大值，诱导倍数为对照转基因植株的5.8倍；受赤霉素诱导表达，在4h达到最大值，诱导倍数为对照转基因植株的5.1倍；受6-BA诱导表达，在8h达到最大值，诱导倍数为对照转基因植株的5.0倍；受脱落酸诱导表达，在48h中不断提高，诱导倍数为对照转基因植株的4.4倍；受NaCl诱导表达，在2h达到最大值，诱导倍数为对照转基因植株的4.0倍。表明该启动子表达具组织特异性、受发育时期调控及受非生物胁迫诱导表达的特性，该启动子受水杨酸诱导表达，可能在植物胁迫抗性中起作用；受茉莉酸甲酯诱导表达，可能参与抗逆、病原防卫反应；受脱落酸诱导表达，可能参与脱落酸依赖的抗旱、以及防卫反应；受NaCl诱导表达，可能参与耐盐反应。

RT-PCR结果表明：黑暗处理可以促进GmRAV基因的表达，并呈现昼夜节律的变化。而且认为GmRAV基因参与细胞分裂素途径。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种植物光周期相关启动子及其应用

<160>12

<210>1

<211>923

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max(L.)Merrill.)

<223>

<400>1

taaaaaaagt taacgaatat ttataataaa tattattata agtctttttt atctttctct    60

tcacatcaca tcattatcaa atttatcatt ttttttcttt gttgttcact atttttctct    120

tctatttatc cacacatccc aaatatgtaa aaataataat attcaattca ttcatatatt    180

ttattttaca tctattttta tctctttttt tttctctttt tcaccttcaa cgtcacatca    240

tatatcgcat ttattattat ttctgatttt ttttttaata agaaataagt tatagtatga    300

tattttatat tgtaacttat ttcttataat ttgattatta taaataaaaa ggaagataat    360

attatttttt tttctctatc tattcatttc cttcatccca ttccgcctaa aaataaggtg    420

aacgttcaca atttccgaat ttataatgta tgaatatatg actgccctgc ccttatattt    480

gtattgttag ctcattttat gaaattcaaa ttgtcaagtg acccacatct agtgatctta    540

tcctttttcc taatttccca ttgaaacctc tctctcacac acaatgaatc ttcctccgtc    600

tccaatagtt gacccaccca tcctccatcc acgctcacat ttaatgaaat aatattatat    660

aagtaatctt ccatgatgcc taaatcataa aaacctcatt acattagctc aggttcctcc    720

tatatatata tatatataca tacataatat ccttctccct caaaccaaac catacctatt    780

ctcaagtttc tctctgtttc ttcctacttc atgctatagc acttacaata ctcaacaata    840

acctaaccaa accaaaccaa accaaaaccc ttatctgcac tcacttcaca caaaccaaag    900

ttaattaatt accaacacaa atg                                            923

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tctaagcttt ctttctcttc acatcac                                         27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

attaagcttt acatctattt ttatctc      27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ttcaagctta catcatatat cgcattt      27

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tcacaagctt tgaatcttcc tccgt        25

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

taaaagcttc attacattag ctcaggt      27

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

accaagctta ttctcaagtt tctctc       26

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<4008

ggtggatcct tgtgttggta attaatt                      27

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tggcagtgaa ggaccaacag t                            21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

tgagcgtcgc agaacattac a                            21

Claims (8)

1.一种启动子，为核苷酸序列如下述1)至6)中任一所示的DNA分子：

1)序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸；

2)序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸；

3)序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸；

4)序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸；

5)序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸；

6)序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸。

2.扩增序列表中序列1自5′末端起第49-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列2所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

3.扩增序列表中序列1自5′末端起第184-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

4.扩增序列表中序列1自5′末端起第233-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

5.扩增序列表中序列1自5′末端起第583-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

6.扩增序列表中序列1自5′末端起第694-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列6所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

7.扩增序列表中序列1自5′末端起第776-920位核苷酸所示的DNA分子的引物对，其特征在于：一条引物序列如序列表中序列7所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

8.含有权利要求1所述启动子的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

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