CN101113452B - 植物花特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物花特异性启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列是：(1)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明的启动子是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。利用本发明的启动子可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受体野生型的花卉作物新品种、培育雄性不育作物品种和培育消除或大幅度减少的“飞絮”的园林绿化植物等。

Description

植物花特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物花特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。这种分类方式基本上反映了不同类型启动子各自的功能特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。

组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异。其特点是：受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导，例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻的Actinl启动子[Wang等，Molecular and Cellular Biology，12(8)：3399-3406(1992)]，美国专利第5641876)和花椰菜菜叶病毒(CaMV35SRNA)[Odell等，Nature，313：810-812(1985)]等。组成型启动子的用途很广：可以通过其高水平的蛋白产物来筛选转基因细胞或植株；其高水平表达的报告蛋白也易于检测和定量分析；其表达的大量转录因子也是转录调控系统的重要组成部分。

器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)，是指其调控基因的表达往往只发生在植体的在某一或某些特定的器官和/或组织，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段。其特征是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子[Yamamoto YT等，1991，Plant Cell，3：371-382]、叶片特异性启动子[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)：325-333]、果实特异性启动子[Pear JR等，1989，Plant Mol Biol，13：639-651]、花特异性启动子[Van tunen等，1988，EMBO J.，7：1257]、胚乳特异性启动子[Colot V等，1987，EMBO J，6(12)：3559-3564]、棉花纤维特异性启动子[Ma DP等，1997，Biochem Biophys Acta，1344：111-114]和韧皮部特异性启动子[Bostwick DE等，1994，Plant Mol Biol，26：887-897]等等。

诱导型启动子(inducible promoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：激素诱导启动子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)：573-588；Taylor JE等，1995，Plant J，7(1)：129-134]、化学诱导启动子[Williams S等，1992，Biol/Technol，10：540-543；综述见：Padidam M，2003，Curr Opinionin Plant Biol，6169-177]、光诱导启动子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)：227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)：311-319]、热诱导启动子[Schoffl F等，1989，Mol Gen Genet，217(2-3)：246-53]、创伤诱导启动子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4：129-134；Carrera E等，1998，PlantJ，15(6)：765-771]、真菌诱导启动子[Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)：485-493]和共生细菌诱导启动子[Miao GH等，1993，Plant Cell，5：781-786]等。诱导型启动子往往也多少具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-1a主要驱动基因在叶片中表达[Uknes S等，1993，Plant Cell，5：159-169]。

生殖生长是高等植物生活史中的重要阶段，而作为执行生殖过程的重要器官一花器官的形成与发育一直受到生物学家和农学家的广泛关注。植物的花发育过程可分为4个阶段[Koornneefm et al；Ann.Rev.Plant Physiol Plant MolBiol；1998，49：345-370]：成花诱导、花分生组织形成、花器官原基产生和花器官成熟。因此，花器官的发育过程是一个高度复杂的、有序的生理生化和形态发生的过程。在这一过程中，有大量的特异性基因的表达。

目前世界上已经鉴定、分离和功能研究了一些花器官特异性的启动子。一些花器官特异性启动子驱动外源基因在花器官的多个相对独立的单位表达，例如，PAL家族的zb8启动子驱动报告基因GUS在转基因水稻的花药、花芽、花托和花丝中都表达[Zhu Q et al，1995，Plant Mol.Biol.，29：535-550]，而另一些花器官特异性启动子则具有花器官某一特定单位的特异性，例如，水稻花药特异性启动子[Tsuchiya T等，1994，Plant Mol Biol，20：1189-1193；吴孝槐等，2003，科学通报，48：2154-2161]、番茄花粉特异性启动子LAT52[Twell D等，1989，Mol GenGenet，217：240-245]、TomA108[Xu XS and Chen RD，2006，Physiol and Biochem，25：231-240]和烟草花药绒毡层特异性启动子TA29[Koltunow AM等，1990，P1antCell，2：1201-1224]等等。人们研究还发现，花色素代谢途径和花香的挥发性化学物质的代谢的基因中的很多基因都具有花器官特异性。例如，矮牵牛查尔酮(CHS)基因启动子具有很强的花瓣特异性表达特性[Van tunen等，1988，EMBO J.，7：1257]。

花特异性基因及其启动子的研究，不仅对了解花器官分化、形成、生长和发育的控制基因及其网络具有重要的理论意义，而且对利用基因工程技术改良植物具有重要的应用价值，特别是在作物人工雄性不育基因工程[Mariani等，1990，Nature，347：737-741；肖兴国等，2004，中国发明专利，ZL00109108.5]、花卉的花形、花色与花期调控等基因工程[李等，2003，中国生物工程杂志，23：42-46]和果树的缩短童期以及通过提前花期调整果品上市时间等基因工程方面。

小白菜(Brassica chinensis L.)是十字花科芸薹属重要的蔬菜作物，白菜十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的一个变种，以绿叶为产品的一二年生草本植物。别名普通白菜、青菜，不结球白菜等。小白菜异花传粉，杂种优势十分显著。

小白菜原产中国。是人们喜爱的大众化蔬菜，现占长江中下游大、中城市蔬菜复种面积的30％～40％，而且北方也大量引种栽培。近年来，东南亚、日、美及欧洲一些国家也广泛引种，已逐渐成为世界性蔬菜。因此，不结球白菜的研究已引起国内外众多学者的高度重视，并在茎尖诱导耐热突变体[王亦菲等，2002，上海农业学报，18(2)：6-9.]，抗虫转基因植株的获得[佘建明等，2000，江苏农业学报，16(2)：79-82.]及外源基因在转基因植株后代中的表达[余建明等，2002，江苏农业学报，18(1)：33～36.]等方面取得了突破。在利用基因工程创建雄性不育系方面目前已经克隆得到雄性不育基因：BcMF4[刘乐承等，2006，遗传，28(11)：1428-1431.]、BcMF11、BcMF13[Li Y，2007，Mol Biol Rep，1(7)]及CYP86MF[Ye WZ等，2003，Journal of Horticultural Science，2003，78(3)：319-323]等。

大白菜是我国栽培面积最大的重要的蔬菜之一。因此研究大白菜花发育有重要的理论和经济价值。然而在大白菜中，迄今只分离出极少在花器官中特异表达的基因。目前在大白菜中分离到与生殖器官相关的基因有LFY[夏光清等，吉林农业大学学报，2004，26(6)：615-619)]、NS1、NS2、NS3、NS4[Watanabe M et al，1992，Plant Cell Physiol，33：343-351]、SP5、SP6、SP8、SP11[Suzuki G et al，1999，Genetics，153，391-400；Takayama S et al，2000，PNAS，97(4)：1920-1925]，SLL2、SAE1(Watanabe M et al，1999，Sex Plant Reprod，12：127-134)、SCR1-BP[TakayamaS et al，2000，PNAS，97(7)：3765-3770]、NTR1[Plant Mol Biol，2000，42：647-655，]、BcSLG2[Kim S et al，2001，Mol Cells，10(6)：678-683]和CYP86MF(Cao JSet al，2006，Plant Cell Rep，2006，24：715-723)等。

大白菜花器官特异性启动子在实际应用中有巨大的价值，Lee等在大白菜种应用了大白菜绒毡层特异性启动子BcA9(Lee YH et al，Plant Cell Rep，2003，22：268-273)连接毒素基因DTx-A，转入大白菜中，成功地导致了大白菜雄性不育。余沛涛等(Acta Agri Shanghai，2000，16(1)：17-19)将TA29与Barnase基因融合导入大白菜，观察到转基因植株有雄蕊发育较差或者花粉发育不全甚至没有花粉的植株出现。随着对环境保护意识的提高和对食品品质要求的提高，人们对利用源自植物的基因来改良植物或作物的要求也越来越强烈。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物花特异性启动子及其应用。

本发明所提供的植物花特异性启动子，来源于十字花科芸薹属小白菜(Brassica campestris var.chinensis L；Brassica chinensis)或十字花科芸薹属大白菜(Brassica campestris var.pekinensis L；Brassicapekinensis)，它的核苷酸序列是：

(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或

(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

(3)、与(1)或(2)所述的核苷酸序列具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列；或

(4)、与(1)、(2)或(3)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。

上述严谨杂交条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或者在0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

序列表中序列1由1210个核苷酸组成，其中序列1的自5′端的第636位核苷酸为A或T。序列表中序列1的自5′端的第1138-1144位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)第1165位脱氧核苷酸C推测(www.softberry.com)为转录起始位点。

含有上述花器官特异性启动子的表达盒也属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，所述花器官特异性启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。

含有上述花器官特异性启动子的重组表达载体也属于本发明的保护范围，所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。

本发明还提供了一种上述花器官特异性启动子的获得方法，是以小白菜或大白菜的基因组DNA为模板，用核苷酸序列列表中序列2和序列3的作为一对引物进行PCR扩增。

实验证明，本发明提供的花器官特异性启动子Bcfs能够启动报告基因GUS在转基因烟草花器官的花瓣、花药、柱头和花粉中特异表达，而在营养器官都未检测到表达。

将本发明的启动子下游衔接内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因，构建表达盒并与不同的表达载体连接，转化到植物中，利用其花器官特异性表达活性，在花器官中特异性表达其控制或指导的所述的反义基因、外源基因或小RNA。在转基因植株中使其内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)或外源基因的表达局限于花器官中，排除了这些基因在植物体其它部位的表达。

本发明的植物花器官特异性启动子可在不同植物或作物中表达并稳定遗传，所述的植物或作物是指显花植物，根据不同的植物分类方法，所述的植物或作物可包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、一年生植物和多年生植物、水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物。

本发明所提供的花特异性启动子，不仅为小白菜花器官的分化、形成、生长和发育的分子机理等理论研究提供了重要的分子元件，还为白菜等作物的基因工程育种，特别是花卉植物花形、花色、香味和花期调控等基因工程育种提供了关键的分子元件。利用该启动子驱动内源基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA或外源基因转化植物的细胞或组织及其后代细胞后，可以培育花形、花色、花香和育性等不同于受体野生型的花卉作物新品种、培育雄性不育作物品种和培育消除或大幅度减少“飞絮”的园林绿化植物等。

附图说明

图1为来源于小白菜的花器官特异性启动子Bcfs的PCR克隆电泳图。

图2为来源于小白菜的花器官特异性启动子Bcfs克隆的电泳图。

图3为来源于小白菜的花器官特异性启动子Bcfs的DNA序列。

图4为来源于小白菜的花器官特异性启动子Bcfs驱动GUS基因。

图5为转pRDBcfs烟草T0代植株的PCR鉴定图。

图6为转pRDBcfs烟草T0代植株与未转基因对照植株花药、柱头、花瓣的GUS染色照片。

图7为转pRDBcfs烟草T0代植株与未转基因对照植株花粉的GUS染色照片。

图8为显微镜下T0代转基因植株花药GUS染色后石蜡切片图。

图9为来源于大白菜的花特异性启动子Bpfs的PCR克隆电泳图。

图10为来源于大白菜的花器官特异性启动子Bpfs的酶切鉴定图。

图11为来源于大白菜的花器官特异性启动子Bpfs的DNA序列。

图12为花器官特异性启动子Bpfs驱动GUS基因(Bpfs::GUS)植物表达载体pRDBpfs的构建流程图。

图13为转pRDBpfs烟草T0代植株的PCR鉴定电泳图。

图14为转pRDBpfs烟草T0代植株与野生型植株的花粉的GUS染色图。

图15为转pRDBpfs烟草T0代植株与野生型植株花瓣的GUS染色图。

图16为转pRDBpfs烟草T0代植株与野生型植株柱头的GUS染色图。

图17为转pRDBpfs烟草T0代植株与野生型植株花药的GUS染色图。

具体实施方式

本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”包括具有或不具有TATA盒(TATA box)的启动子。TATA盒或类似区域，它定位于转录起始位点(+1)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游，并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，该序列与花特异性启动子在正常情况不相结合。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个脱氧核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个脱氧核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种植物载体，例如pBin19、pBI121(美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA中心产品)等。

本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。

术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。

术语“花器官特异性启动子”是指在启动子控制下表达的基因在没有或有基础表达的植物的花器官表达而在植物体的其他器官不表达的启动字。

术语“具有60％或60％以上同源性的序列”是指与(1)或(2)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因在花器官中的特异性表达，它们与(1)或(2)中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。

术语“杂交的序列”是指可以在严谨杂交条件下与(1)、(2)、(3)或(4)的序列杂交的核酸序列。“严谨杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在分子生物学或基因工程实验指南，例如《Molecular Cloning》(3^rd Ed)(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，2001)(以下简称“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具体为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min.

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

T0代表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。

实施例1、从小白菜(Brassica chinensis L.)中克隆与分离植物花器官特异启动子(Bcfs)

1、小白菜(Brassica chinensis L.)总DNA的提取

取温室盆栽的小白菜(Brassica chinensis L.)品种“苏州青”嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。

2、PCR扩增与扩增片段的回收

设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增小白菜花器官特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII和Bam HI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5’-AAGCTTAGCAGCACGAATGAAGTTC-3’(HindIII)(序列表中序列2)

引物2：5’-GGATCCTTGTAGTGAGAAAACTCGGGGAA-3’(BamHI)(序列表中序列3)

以步骤1提取的小白菜基因组DNA为模板，进行PCR反应：

反应体系为：

模板DNA：                    800ng；

10X Exbuffer：               2ul；

dNTP混合物(2.5mM)：          2ul；

ExTaq DNA Polymerase(5U/ul)：0.5ul；

引物1(10uM)：                2ul；

引物2(10uM)：                2ul；

无菌重蒸馏水(sddH2O)：       补足至20ul。

PCR反应程序：先预变性94℃5min；再94℃30sec，50℃30sec，72℃1min 30sec，35个循环，最后72℃10min。

PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片切下位于1200bp左右的特异片段(图1)，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ul ddH₂O中，-20℃保存备用。图1中，泳道1为Bcfs的PCR克隆图；泳道2为DNA大小分子标准I---Marker I。

3、回收片段的亚克隆与测序

将步骤2回收的片段插入到质粒载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)。将所得到的重组载体通过“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和BamHI双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组载体应在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和约1200bp(目标带)的两条带，如图2(图2中，泳道1为插入Bcfs的克隆载体的HindIII+BamHI酶切图；泳道2为DNA大小分子标准I---MarkerI)所示。

将通过上述酶切鉴定含有1200bp插入片段的质粒(pUBcfs)或含有该质粒的DH5α送交商业测序公司测序(原上海博雅生物技术服务有限公司，现已并入Introgen公司)，将经测序表明正确的重组载体命名为pUBcfs；所测的插入子的核苷酸序列如图3所示，是来源于小白菜的花特异启动子，具有自5′端的第636位脱氧核苷酸为A的序列表中序列1的核苷酸序列。将具有序列表中序列1的核苷酸序列(自5′端的第636位脱氧核苷酸为A)的来源于小白菜的花特异启动子命名为Bcfs。图3中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和BamHI)。序列表中序列1的自5′端的第1138-1144位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)第1165位脱氧核苷酸C推测(www.softberry.com)为转录起始位点。

实施例2、花器官特异启动子驱动GUS基因(Bcfs::GUS)植物表达载体pRDBcfs的构建

花器官特异启动子驱动GUS融合基因(Bcfs::GUS)植物表达载体pRDBcfs的构建流程如图4所示，具体方法如下：

将pUBcfs经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切后，取出Bcfs片段(大约1200bp)，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NAGel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化，与经过HindIII和BamHI双酶切的双元表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到的重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5a。转化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hindll和BamHI双酶切后，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组质粒在紫外灯下可见分子大小分别约为13.6kb(pRD410载体带)和约1200bp(Bcfs)两条带。将酶切表明正确的重组质粒进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花器官特异启动子Bcfs片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDBcfs。pRDBcfs中GUS基因需要花器官特异启动子Bcfs驱动表达。

实施例3、转Bcfs融合基因(Bcfs::GUS)烟草的鉴定

1、农杆菌的转化与转化子的鉴定

用CaCl₂法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将含有Bcfs融合基因(Bcfs::GUS)的植物表达载体pRDBcfs转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD₆₀₀值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.6kb(载体带)和约1200bp(Bcfs)两条带。将酶切鉴定表明正确的工程菌进行测序鉴定，结果表明，植物表达载体pRDBcfs已经成功地转入农杆菌LBA4404。将含有植物表达载体pRDBcfs的农杆菌LBA4404克隆命名为pRDBcfs/LBA4404。

2、转Bcfs融合基因(转pRDBcfs)烟草的获得

1)农杆菌的准备

挑取携带植物表达载体pRDBcfs的农杆菌LBA4404(pRDBcfs/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养(大约12h)以活化。取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用。

2)烟草的转化与转化植株的再生

烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(LBA4404/pRDBcfs)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；然后将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基在光下(1500-2500Lx，光16h暗8h)进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.80)上诱导生根，获得完整的卡那霉素抗性的转pRDBcfs烟草T0代植株98株，用于分子鉴定。

3)转pRDBcfs烟草的分子鉴定

首先对步骤2)得到的Kan抗性转pRDBcfs烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转pRDBcfs烟草(Kan抗性株)和未转基因烟草对照株(阴性对照)的叶片基因组DNA，用花器官特异性启动子Bcfs两端的特异性引物对(引物1：5’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物2：5’-GGA TCC TTGTAG TGA GAA AAC TCG GGG AA-3’)进行PCR扩增，以pRDBcfs载体质粒为阳性对照，转pRDBcfs烟草均扩增得到大小约为1200bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段(见图5)。这一结果初步表明目标基因(Bcfs::GUS)已整合到烟草基因组中。图5中，泳道1为DNA大小分子标准(marker)；泳道2为载体质粒对照(阳性对照)；泳道3为空白(系统对照(无模板的反应体系，阴性对照)；泳道4为未转基因植株对照(阴性对照)；泳道5-16为部分不同的转pRDBcfs烟草T0代植株。

实施例4、转pRDBcfs烟草GUS基因表达的组织化学检测

将同时具有卡那霉素抗性和PCR呈阳性的转pRDBcfs烟草T0代植株(植株号分别为2、3、5、11、16、18、22、23)和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，套袋保湿一周后去袋，进行常规管理。

转pRDBcfs烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，PlantMol Biol Rep，5(4)：387-405]的方法进行。将转基因植物及其对照的不同的发育时期的花药(Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224；曹克浩，2003，中国农业大学硕士论文)、与该花药时期时的花萼、花瓣、花丝、子房、柱头、新鲜的根、茎和叶在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。

转pRDBcfs烟草GUS基因表达的组织化学检测结果表明，未转基因的对照植株(CK，烟草NC89)的各个器官都不能染色(部分结果如图6中A所示)，而在检测的转pRDBcfs烟草的8个PCR阳性T0代植株中，所有植株的花药都能不同程度地被染色(图6中B，图8(花药GUS染色后石蜡切片图))。5个株系(除2、3、5)在花瓣、柱头中不同程度地被染色(图6中B)。7个株系(除株系18)花粉不同程度的被染色(图7，图7中，左侧为未转基因的对照，右侧为转pRDBcfs烟草T0代植株)。在所株系中花丝、子房等均未染出蓝色。这些结果显示出GUS染色的花器官特异性，即表明启动子Bcfs具有花器官特异性驱动活性。图6中A为未转基因烟草的对照花药(左图)、柱头(中图)、花瓣(右图)的GUS染色；图6中B为转pRDBcfs烟草的花药(左图)、柱头(中图)、花瓣(右图)的GUS染色。营养器官如根、茎、叶未见GUS活性。其中，花器官GUS染色的结果如表1所示。

表1、转pRDBcfs烟草T0代的GUS染色

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性，

实施例5、转pRDBcfs烟草T1代GUS表达

将转pRDBcfs烟草T0代株系3、11和22所结的种子(T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有和不含Kan 100mg/L的种子萌发培养基(1/2MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养。在不含Kan 100mg/L的培养基上，转pRDBcfs烟草和未转基因的对照种子都能够发芽(发芽率95％以上)，并且小苗呈绿色。在含Kan 100mg/L的培养基上，未转基因的对照种子的有部分虽然也能够发芽，小苗都白化而死亡；但转pRDBcfs烟草的种子苗有近70％呈绿色，且生长正常。培养30天左右，将转基因T1代Kan抗性苗各随机选3株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后取其营养器官进行GUS染色。T1苗长到有2-3片真叶时取叶盘进行体外抗Kan试验，每个株系随机选留3株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照前文已述的方法进行GUS染色。以确定转pRDBcfs烟草中Bcfs::GUS在T1代表达的稳定性和特异性。结果如下如表2所示。

表2、转pRDBcfs烟草T1代Kan抗性苗的GUS染色

株系	根	茎	叶	花药	花粉	花丝	子房	柱头	花瓣	萼片
											3	-	-	-	+++	+	-	-	++	++	-
11	-	-	-	+++	+++	-	-	+++	++	-
											12	-	-	-	+++	++	-	-	++	++	-

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性。

由表2可以看出，由Bcfs驱动的GUS基因在转pRDBcfs烟草中能够稳定地传递给后代，并且GUS基因在所有检测的后代植株试管苗和温室苗的营养器官都不表达，只特异性地在花器官中表达(转pRDBcfs烟草T1代植株的花药(左图)、柱头(中图)、花瓣(右图)的GUS染色如图6中C所示)。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的小白菜Brassica chinensisL.启动子Bcfs不仅具有强驱动性，而且还具有良好的花器官特异性，并且这种强驱动性和特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自小白菜(Brassica chinensis L)的启动子Bcfs是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。

实施例6、从大白菜(Brassica campestris var pekinensis，Brassica pekinensis)中克隆与分离植物花特异启动子(Bpfs)

1、大白菜总DNA的提取

取温室盆栽的大白菜(品种“C50”，种子购自中国农科院蔬菜花卉研究所)嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5ul DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。

2、PCR扩增与扩增片段的回收

设计并合成如下两条引物(引物1和引物2)扩增来源于大白菜的花特异启动子，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶HindIII和BamHI的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5’-AAGCTTAGCAGCACGAATGAAGTTC-3’(HindIII)(序列表中序列2)

引物2：5’-GGATCCTTGTAGTGAGAAAACTCGGGGAA-3’(BamHI)(序列表中序列3)

以步骤1提取的大白菜基因组DNA为模板，按照实施例1所述方法进行进行PCR反应。

PCR反应完成后，取15ul扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片切下位于1200bp左右的特异片段(图9)，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于50ul ddH₂O中，-20℃保存备用。图9中，泳道1为100bp marker；泳道2为克隆Bpfs启动子的PCR产物；箭头所指为目标带。

3、回收片段的亚克隆与测序

将步骤2回收的片段插入到质粒载体pUCm-T(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)。将所得到的重组载体通过“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶HindIII和BamHI双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组载体应在紫外灯下可见分子大小大约分别为2800bp(载体带)和约1200bp(目标带)的两条带，如图10(图10中，泳道1为λDNA/EcoRI+HindIII marker；泳道2为pUBpfs的酶切结果；箭头所指为目标带)所示。

将通过上述酶切鉴定含有1200bp插入片段的质粒或含有该质粒的DH5α送交商业测序公司测序(原上海博雅生物技术服务有限公司，现已并入Introgen公司)，将经测序表明正确的重组载体命名为pUBpfs；所测的插入子的核苷酸序列如图11所示，是来源于大白菜的花特异启动子，具有自5′端的第636位脱氧核苷酸为T的序列表中序列1的核苷酸序列。将具有序列表中序列1的核苷酸序列(自5′端的第636位脱氧核苷酸为T)的来源于大白菜的花特异启动子命名为Bpfs。图11中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(HindIII和BamHI)。序列表中序列1的自5′端的第1138-1144位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)，序列表中序列1的自5′端的第1165位脱氧核苷酸C推测(www.softberry.com)为转录起始位点。

实施例7、花特异启动子驱动GUS基因(Bpfs::GUS)植物表达载体pRDBpfs的构建

花特异启动子驱动GUS融合基因(Bpfs::GUS)植物表达载体pRDBpfs的构建流程如图12所示，具体方法如下：

将pUBpfs经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切后，取出Bpfs片段(大约1200bp)，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NAGel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化，与经过HindIII和BamHI双酶切的双元表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到的重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α。转化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hindll和BamHI双酶切后，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组质粒在紫外灯下可见分子大小分别约为13.6kb(pRD410载体带)和约1200bp(Bpfs)两条带。将酶切表明正确的重组质粒进行了测序验证，将酶切和测序表明含有花特异启动子Bpfs片段和pRD410酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pRDBpfs。pRDBpfs中GUS基因需要花特异启动子Bpfs驱动表达。

实施例8、转Bpfs::GUS嵌合基因(pRDBpfs)烟草的鉴定

1、农杆菌的转化与转化子的鉴定

用CaCl₂法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国LifeTechnology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将含有Bpfs融合基因(Bpfs::GUS)的植物表达载体pRDBpfs转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD₆₀₀值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为13.6kb(载体带)和约1200bp(Bpfs)两条带。将酶切鉴定表明正确的工程菌进行测序鉴定，结果表明，植物表达载体pRDBpfs已经成功地转入农杆菌LBA4404。将含有植物表达载体pRDBpfs的农杆菌LBA4404克隆命名为pRDBpfs/LBA4404。

2、转Bpfs::GUS嵌合基因(pRDBpfsG)烟草的获得

1)农杆菌的准备

挑取携带植物表达载体pRDBpfs的农杆菌LBA4404(pRDBpfs/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜培养(大约12h)以活化。取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2MS液体培养基中，准备侵染用。

2)烟草的转化与转化植株的再生

烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(LBA4404/pRDBpfs)菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；然后将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基在光下(1500-2500Lx，光16h暗8h)进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.80)上诱导生根，获得完整的卡那霉素抗性的转pRDBpfs烟草T0代植株58株，用于分子鉴定。

3)转pRDBpfs烟草的分子鉴定

首先对步骤2)得到的Kan抗性转pRDBpfs烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转pRDBpfs烟草(Kan抗性株)和未转基因烟草NC89对照株(阴性对照)的叶片基因组DNA，用花特异性启动子Bpfs两端的特异性引物对(引物1：5’-AAG CTT AGC AGC ACG AAT GAA GTT C-3’；引物2：5’-GGA TCC TTGTAG TGA GAA AAC TCG GGG AA-3’)进行PCR扩增，以pRDBpfs载体质粒为阳性对照，转pRDBpfs烟草均扩增得到大小为约1200bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段(图13)。这一结果初步表明目标基因(Bpfs::GUS)已整合到烟草基因组中。图13中，泳道13为DNA大小分子标准(marker)；泳道2为载体质粒对照(阳性对照)；泳道3为未转基因NC89植株对照(阴性对照)；泳道1-10为部分不同的转pRDBcfs烟草T0代植株。

实施例9、转pRDBpfs烟草GUS基因表达的组织化学检测

将同时具有卡那霉素抗性和PCR呈阳性的转pRDBpfs烟草T0代植株(植株号分别为8、9、11、13、14、16、17、20、21)和未转基因的烟草NC89对照植株(CK)试管苗在三角瓶中开口炼苗一周，然后移入装有普通花卉营养土的花盆，在温室中培养，套袋保湿一周后去袋，进行常规管理。

转pRDBpfs烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，PlantMol Biol Rep，5(4)：387-405]的方法进行。将转pRDBpfs烟草及其对照的不同的发育时期的花药(Koltunow AM等，1990，Plant Cell，2：1201-1224；曹克浩，2003，中国农业大学硕士论文)、与该花药时期时的花萼、花瓣、花丝、子房、柱头、新鲜的根、茎和叶在X-GLuc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，在显微镜下观测样品并拍照。

花器官GUS染色的结果如表3所示，结果表明，未转基因的NC89对照植株(CK)的各个器官都不能染色，而在检测的转pRDBpfsG烟草的9个PCR阳性T0代植株中，植株9和11中花粉(图14)和花药(图17)不同程度的被染色；6个株系(除株系13、16和21之外)在花瓣中不同程度地被染色(图15)；2个株系(14和21)在柱头中不同程度地被然染色(图16)。在所有的株系中花丝和子房等均未染出蓝色。这些结果显示出GUS染色的花器官特异性，即表明启动子Bpfs具有花器官特异性驱动活性。图14为未转基因对照(A)与转pRDBpfsG烟草(B)的花粉GUS染色；图15为对照(A)与转pRDBpfsG烟草(B)的花瓣GUS染色。图16为未转基因的对照(A)与转pRDBpfsG烟草(B)的柱头GUS染色。图17为未转基因的对照(A)与转pRDBpfsG烟草(B)的花药GUS染色。营养器官如根、茎、叶未见GUS活性。

表3、转pRDBcfs烟草及其对照的花器官和营养器官GUS染色

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性

实施例10、转pRDBpfs烟草T1代GUS表达

将转pRDBpfs烟草T0代株系3、8和10所结的种子(T1代)及其未转基因的对照种子(NC89)表面消毒后接种到含有或不含Kan 100mg/L的种子萌发培养基(1/2MS)，暗培养7天，后置于光下于25±1℃培养。在不含Kan 100mg/L的培养基上，转pRDBpfs烟草和未转基因的对照种子都能够发芽(发芽率95％以上)，并且小苗呈绿色。在含Kan 100mg/L的培养基上，未转基因的对照种子的有部分虽然也能够发芽，小苗都白化而死亡；但转pRDBpfs烟草的种子苗有近70％呈绿色，且生长正常。培养30天左右，将转基因T1代Kan抗性苗随机选3株进行试管培养，得到旺盛生长的大苗后取其营养器官进行GUS染色。T1苗长到有2-3片真叶时取叶盘进行体外抗Kan试验，每个株系随机选留1株发育到成熟，发育过程中，取不同的器官和组织按照前文已述的方法进行GUS染色。以确定转pRDBpfs烟草中Bpfs::GUS在T1代表达的稳定性和特异性。结果如表4所示。

表4、转pRDBpfs烟草T1代Kan抗性苗的GUS染色

T1株系	根	茎	叶	花药	花粉	花丝	子房	柱头	花瓣	萼片
											3-1	-	-	-	+++	+	-	-	++	++	+
8-2	-	-	-	+++	+	-	-	+++	++	+
											10-3	-	-	-	+++	++	-	-	++	++	-

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性

由表4可以看出，由Bpfs驱动的GUS基因在转pRDBpfs烟草中能够稳定地传递给后代，并且GUS基因在所有检测的后代植株试管苗和温室苗的营养器官都不表达，只特异性地在花器官中表达。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的大白菜启动子Bpfs不仅具有强驱动性，而且还具有良好的花器官特异性，并且这种强驱动性和特异性能够稳定地传递给后代。因此，本发明所提供的分离自大白菜的启动子Bpfs是一个稳定、驱动力强和特异性高的花器官特异性启动子。

序列表

<160>3

<210>1

<211>1210

<212>DNA

<213>十字花科芸薹属小白菜(Brassica campestris var.chinensis

L；Brassica chinensis)或十字花科芸薹属大白菜(Brassica campestris var.

pekinensis L；Brassica pekinensis)

<220>

<221>misc-feature

<222>(636)

<223>n＝a或t

<400>1

agcagcacga atgaagttca tcaagttttt aattaggctt cgcttcttgt tattcctcga    60

aaatttatat catttcatac gttcgttctt gttttcatgt gactttactc ttctctaccg    120

tgagtctcat caatttcgta gaacgctatg ttaacgatcc acgtatcata tatacacctt    180

cttctctagc cgtacgtacc accacacatc acttcatccc acttcctaac ttatataatt    240

ttactactca gatcacaaga gtatatcatg aagtcatttc ttctccttgt cctattcctc    300

tctttctttg tcggctctat cttcgctagt aggcattttc cgacgcaccc ctatccaagt    360

atgtatgctc ttctctctca ctctccttaa ttttacccac ctctttcact atcttcaatg    420

tcttttaact tgttcaatta tgttcgtctg ggtgggcagg tcataataat catcatgtcg    480

gaatgaagcg tcagaggagg ccggacacgg tgcaggtggc agggtctagg ctgccggact    540

gctcacacgc gtgtggctca tgctccccat gccgtcttgt gatggttagc tttgtgtgtg    600

catctataga ggaggctgag acttgtccca tggctnataa gtgcatgtgc aagaacaaat    660

cctaccccgt cccatgatga atgagcctct ctcacactta actctatgca ttcaaacgtt    720

ttgtttcttt ccttttgctt cttcggataa atgaccatgt gtatgtataa aatgcatctt    780

ttcctttttt taattctttt gtctttttga tatcttaaac acagttttac gaaacaagat    840

tagttgagcc actcaaaagc gtggtcgact aaatcgaaag agaaagccac acaacacagt    900

gggctcgtct aatgaattat ggcccatgac actgcatttc agactgcaac aaccaaagtt    960

gtagaaagaa ttatatttaa agggcacgta gtacatacgt tgttggcttc caccaaactt    1020

tggaggctct ctaataatta gcaaactcca ttctacgcat ttgttacaca ccttctattt    1080

tcaaccattt catctcacct tcgttaaatg tttccacagt tagctcaata aattcactat    1140

atacacgcat acactttccc tccacaagat caaacaaaca cactaccttc cccgagtttt    1200

ctcactacaa                                                           1210

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aagcttagca gcacgaatga agttc                                          25

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggatccttgt agtgagaaaa ctcggggaa                                       29

Claims (12)

1.一种植物花特异性启动子，其特征在于：它的核苷酸序列是：

(1)、序列表中序列1所述的核苷酸序列；或

(2)、与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子的表达盒。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

4.含有权利要求1所述启动子的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的表达盒的重组表达载体或工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是由权利要求2或3所述的表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为双元载体或共合载体。

8.权利要求1所述的花特异性启动子在培育作物品种和/或品系、培育“飞絮”消除或大幅度减少的飞絮园林绿化植物或作物品种和/或品系、培育授粉受精能力增强或者减弱的植物或作物品种和/或品系或者是培育能够防止通过花粉漂移而污染其野生种和近缘种的转基因植物或作物品种和/或品系中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物是显花植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为陆生植物。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草、小白菜或大白菜。

12.一种权利要求1所述的花特异性启动子的获得方法，是以小白菜或大白菜的基因组DNA为模板，用一对引物进行PCR扩增得到花特异性启动子；所述一对引物的核苷酸序列如序列表中序列2和序列3所示。

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