CN108753777B

CN108753777B - 一种具有花药组织特异性的启动子及其应用

Info

Publication number: CN108753777B
Application number: CN201810551455.0A
Authority: CN
Inventors: 刘志勇; 王楠; 叶雪凌; 冯辉; 梅发博
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108753777A

Abstract

本发明公开了一种具有花药组织特异性的启动子。本发明提供的启动子为下述a)或b)或c)：a)序列表中序列1所示的DNA片段；b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。实验证明，本发明的启动子具有在花药组织中特异表达的特性，可以用来培育转基因植物。

Description

一种具有花药组织特异性的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种具有花药组织特异性的启动子及其应用。

背景技术

植物基因主要是在转录水平上进行调控，是在多种顺式作用元件和反式作用因子间相互协调作用。启动子是植物基因转录的重要调控元件，一般位于结构基因5'段上游区，是RNA聚合酶及一些反式作用因子识别与结合位点。启动子是基因转录的调控中心，深入研究启动子既有利于掌握控制基因转录模式及机制，又有助于外源基因的表达调控。启动子主要有两个区域，分别为核心启动子区及转录调控区。核心启动子区是转录起始的最短启动子片段，此区域包含一些重要的功能元件，能够准确定位转录起点及方向，是基因调控的关键基础。转录调控区位于核心启动子的上游或下游，可与特异的转录因子相结合从而对转录的时空，强弱起调控作用，如增强子和沉默子等。

启动子具有如下特征：1)序列特异性。启动子含有保守的序列框，序列框中碱基的变化会影响转录水平。2)方向特异性。启动子是一种有方向性的顺式调控因子，分单向和双向两类。3)位置特异性。启动子一般位于基因编码区或功能区上游。4)种属特异性。不同物种具有不同类型的启动子。5)功能特异性。不同组织和不同生化途径具有不同类型的启动子。

启动子按其表达方式可分为三类：组成型启动子、诱导性启动子和组织特异性启动子。组成型启动子能够在所有组织中启动基因表达，具有时空持续性和表达量恒定性，但无时空特异性。组成型启动子在植物基因工程中常作为表达载体。诱导型启动子能在某些物理或化学信号诱导下启动基因表达，或可大幅度地提高基因转录水平。组织特异性表达启动子只在某种细胞、组织或者器官中启动基因表达，其不仅能使目的基因在一定细胞、组织或器官中积累表达产物，增加局部表达量，同时还可以避免植物营养的不必要浪费。组织特异性启动子不仅具有一般启动子的结构，还存在几种控制组织特异性表达的元件，其结构上通常存在组织特异性增强子和沉默子，因而调控基因在特定组织器官中转录水平。

目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型启动子，比如CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化大白菜等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

通过基因工程手段调控花粉育性、创造植物不育系、保持系及恢复系的关键之一是植物花药启动子的特异性驱动活性。花药是大白菜雄性配子花粉产生的器官，与大白菜的制种、育种及种子产量等密切相关。因此在大白菜组织特异启动子的研究领域中，花药特异性启动子是人们最为关注的启动子之一。但是目前人们所发现的花药特异性启动子的遗传资源并不是十分丰富，限制了人们对花药性状改良能力的提升。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有启动子活性的DNA分子。

本发明提供的DNA分子，为下述a)或b)或c)：

a)序列表中序列1所示的DNA片段；

b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的DNA分子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。

本发明还提供了含有所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B19)中的任一种：

B1)含有所述DNA分子的表达盒；

B2)含有所述DNA分子的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有所述DNA分子的重组微生物；

B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；

B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有所述DNA分子的转基因植物细胞系；

B9)含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12)含有所述DNA分子的转基因植物组织；

B13)含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；

B14)含有B2)所述重组载体的转基因植物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B16)含有所述DNA分子的转基因植物器官；

B17)含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；

B18)含有B2)所述重组载体的转基因植物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，所述表达盒可由所述DNA分子、所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因。

所述重组载体中，由所述DNA分子启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pC1301载体(pCambia1301载体)的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。所述目的基因具体为GUS基因。

上述表达盒或重组载体可以通过原核显微注射法、胚胎干细胞介导法、逆转录病毒载体法、精子介导的基因转移、核移植转基因法、体细胞核移植法、线粒体介导法等常规生物学方法转化动物器官或组织或细胞，得到转基因植物物细胞或组织或器官。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、所述转基因植物组织和所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了所述DNA分子在作为启动子中的应用。

上述应用中，所述启动子可为组织特异性启动子。

所述组织可为花药组织。

本发明还提供了所述DNA分子或所述生物材料在以下(a)至(d)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)培育授粉受精能力增强植物品种或品系；

(c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

(d)培育雄性不育植物品种或品系。

本发明还提供了所述DNA分子或所述生物材料在植物中启动目的基因表达中的应用。

本发明还提供了目的基因在植物花药中特异性表达的方法，所述方法包括：将含有所述的DNA分子和目的基因的表达盒导入植物中，实现目的基因在植物花药中的特异表达。

所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为芸薹属植物，如拟南芥。

扩增所述DNA分子全长或部分片段的引物对，也属于本发明的保护范围。

所述引物对可由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA组成。

本发明的DNA分子具有启动子功能，并且具有在花药组织中特异表达的特性。可以利用通过该启动子对农作物品种进行基因改造改善植物花药的生长特性，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，例如，可以增强花药发育过程中对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等，从而培育出理想的转基因植物品种；还可以驱动在花药中特异性表达一些功能基因或结构基因，达到品种改良、创制雄性不育系的目的。本发明的花药特异性表达的启动子的克隆和鉴定为植物利用基因工程调控花粉育性和创造植物雄性不育系提供新的调控元件，为杂种优势资源在育种中应用奠定基础。

附图说明

图1为pC1301-ASP2和pC1301的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的大白菜DH系FT(Huang et al.，Screening of Chinese cabbagemutants produced by 60Co c-ray mutagenesis of isolated microspore cultures，Plant Breeding,133,480–488(2014)；Huang et al.，A new method for generation andscreening of Chinese cabbage mutants using isolated microspore culturing andEMS mutagenesis，Euphytica(2016)207:23–33)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、ASP2启动子具有花药组织表达特异性

本实施例提供了一个来源于大白菜DH系FT的具有启动子功能的DNA片段，将其命名为ASP2启动子，其序列为序列表中序列1。

一、重组载体与重组菌的构建

以大白菜DH系FT基因组DNA为模板，利用正向引物、反向引物进行PCR扩增，得到扩增产物；利用内切酶XbaI(Takara，1093A)酶切启动子分析载体pC1301(即pCambia1301，报告基因为GUS)，得到线性化载体；连接扩增产物与线性化载体，得到重组载体，对得到的重组载体进行测序，将得到的含有序列表中序列1的序列正确的重组载体命名为pC1301-ASP2。pC1301-ASP2中ASP2启动子能启动GUS基因的表达，pC1301-ASP2示意图见图1。所用引物序列如下：

正向引物：5'-CCGGGGATCCTCTAGGAGCAAGATGTGACACTCTCACG-3'(序列2)；

反向引物：5'-ATGAGCTTGCATGCCGACTATAGAGCTCAATTTTCCCTTA-3'(序列3)。

将pC1301-ASP2和pC1301分别导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将得到的重组菌分别命名为GV3101-pC1301-ASP2和GV3101-pC1301。

二、利用启动子ASP2驱动GUS报告基因在拟南芥中表达

步骤1：启动子融合报告基因的表达载体转化拟南芥

将GV3101-pC1301-ASP2接种于10mL液体LB(含卡那霉素)中，28℃，200rpm振摇48h，待菌液浑浊后取5μL检测，取1mL于100mL液体LB(含卡那霉素)扩大培养48h，得到培养产物。待拟南芥长到盛蕾期，进行侵染实验。第一天给拟南芥植株浇透水，当天用小剪刀将拟南芥植株上已开放的小花和已结的角果全部剪掉，保留即将开放的大花蕾。同时将培养产物均分到50mL离心管中12,000rpm，10min离心；弃上清，用50mL 1/2MS培养基(提前灭菌，含有表面活性剂)重悬菌体，再离心收菌，将得到的菌体用50mL 1/2MS培养基(提前灭菌，含有表面活性剂)重悬，得到菌体悬液(OD600为0.8-1.2)；将修剪过的拟南芥的花序完全浸于菌体悬液内，来回均匀的转动培养皿，50s后取出，将植株平放于黑暗环境下，依次侵染30株。24h后将侵染的拟南芥植株取出，竖直放置，在适宜的环境中培养，到后期单株收种，得到T1代转基因种子。

按照上述方法，将GV3101-pC1301-ASP2替换为GV3101-pC1301，制备空载体对照植株。

将T1代转基因种子利用潮霉素进行筛选，得到阳性转基因植株；待阳性转基因植株长出10-15片真叶后，各单株分别取2-3片嫩叶，提取基因组DNA，用步骤一的正向引物和反向引物进行PCR检测，结果显示，阳性转基因植株中均含有目的条带。

步骤2：转基因拟南芥不同组织器官的GUS染色

在含有浓度为50μg/mL卡那霉素的1/2MS培养基上筛选各阳性转基因植株的T₁代种子，选择每个启动子表达载体确定符合孟德尔遗传定律3:1分离的单拷贝株系3-5株，在T₃代进行不同组织器官GUS染色，利用空载体对照植株作为对照，步骤如下：

GUS染色试剂盒(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)中有X-gluc粉末，X-gluc溶解液，GUS染色缓冲液。吸取1mL X-gluc溶解液至粉末管中配50×的X-gluc母液，再稀释50倍配制GUS工作液。取同一转基因植株的根、茎、叶、花序分别放入2mL离心管，向其中加入1mL GUS工作液，黑色塑料缠绕离心管，暗环境染色12h。第二天将离心管内的染色液吸出，然后加入2mL 70％(v/v)乙醇水溶液，脱色1h；用70％(v/v)乙醇水溶液重复脱色三次，取脱色后的组织在体式显微镜下观察并记录GUS染色的结果。

结果显示，GUS基因只在转基因植株的花药中有强表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在转基因植株其它各器官(根、茎和叶片)以及对照植株的各器官中，基本没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的ASP2启动子能够在转基因植株的花药中驱动其下游GUS基因的表达，且这种表达具有花药组织表达特异性。

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种具有花药组织特异性的启动子及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2384

<212> DNA

<213> 大白菜

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gagcaagatg tgacactctc acggtgagtt ttttctatat atatatatat attcatataa 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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atgagcttgc atgccgacta tagagctcaa ttttccctta 40

Claims

1.目的基因在拟南芥花药中特异性表达的方法，包括：将含有序列表中序列1所示的DNA分子和目的基因的表达盒导入拟南芥中，序列1所示的DNA分子作为启动子驱动所述目的基因的表达，实现目的基因在拟南芥花药中的特异表达。