CN108823221B - 兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中的应用。本发明提供的启动子为下述a)或b)或c)或d)：a)序列表中序列1的第1‑1376位所示的DNA片段；b)序列表中序列1的第1‑1394位所示的DNA片段；c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。实验证明，本发明的启动子具有启动子活性，并且其启动子活性具有组织特异性，该启动子也为诱导型启动子，其启动子活性可被低温、茉莉酸甲酯及赤霉素诱导，本发明的启动子可用于植物的遗传改良。

Description

兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中的应用。
背景技术
启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，它通常位于基因5′端上游，能正确有效起始转录，在DNA转录成RNA的过程中发挥关键作用。启动子序列通常包含核心启动子元件和上游启动子元件。核心启动子元件是RNA聚合酶起始转录所必要的最小DNA序列，包含转录起始位点和TATA盒。上游启动子元件包括CAAT盒(CAAT-box)和GC盒(GC-box)等。
植物基因工程中根据基因表达方式不同将启动子分为三种类型：组成型、诱导型和组织特异性启动子。组成型启动子可以促使基因在所有细胞、组织和器官中表达，不受时空及激素等的诱导。植物基因工程中所利用的组成型启动子通常来自于微生物，例如来源于花椰菜花叶病毒基因的组成型启动子CaMV35S，被广泛应用于双子叶植物的遗传转化。诱导型启动子是指在光、温度、激素等条件诱导下，使得目的基因的表达量有所提高，例如从小麦、烟草等多种植物中分离出的植物捕光色素蛋白复合物基因(CAB)的启动子受到光的调节，属于光诱导型启动子。组织特异性启动子可以调控基因在特定的组织(例如叶片、子房、花粉、种皮或种子等)中表达，对植物的生长发育具有调节功能。利用组织特异型启动子或诱导型启动子可以使外源基因在植物的特定组织中或特定的诱导条件下表达，这样既能提高外源基因在转基因植物组织中的表达水平，还可以避免由于不必要的代谢造成的资源浪费。在作物遗传改良中利用组织特异性启动子进行多基因共转化，可以调节多个基因在不同部位特异表达，进而得到优良的作物品种。茉莉酸甲酯作为植物损伤相关的信号分子，能够激发植物防御基因的表达。利用被茉莉酸甲酯高效诱导的启动子驱动防御相关基因进行作物的遗传改良，可使转基因植物在感受到损伤信号后驱动的下游基因高效表达，从而赋予转基因植物良好的防御能力。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有启动子活性的DNA分子。
本发明提供的DNA分子来源于兴安落叶松(Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen)，为下述a)或b)或c)或d)：
a)序列表中序列1的第1-1376位所示的DNA片段；
b)序列表中序列1的第1-1394位所示的DNA片段；
c)与a)或b)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA片段；
d)在严格条件下与a)或b)或c)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次5min 0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次。每次15min。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的DNA分子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的DNA分子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的DNA分子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％、95％以上的同一性。
本发明的另一个目的是提供含有所述DNA分子的生物材料。
本发明提供的生物材料为下述B1)至B19)中的任一种：
B1)含有所述DNA分子的表达盒；
B2)含有所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有所述DNA分子的转基因植物细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有所述DNA分子的转基因植物组织；
B13)含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有所述DNA分子的转基因植物器官；
B17)含有B1)所述表达盒的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述重组载体的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，所述表达盒可由所述DNA分子、所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因。
所述重组载体中，由所述DNA分子启动目的基因的表达。在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pORE R1载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为限制性内切酶XbaI识别位点。所述目的基因具体为GUS基因。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、所述转基因植物组织和所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还有一个目的是提供所述DNA分子的新用途。
本发明提供了所述DNA分子在作为启动子中的应用。
上述应用中，所述启动子可为组织特异性启动子。所述组织为根和/或茎和/或叶片和/或花器官和/或果实。所述花器官具体可为花萼和/或花丝和/或雄蕊；所述果实具体为角果果荚。
上述应用中，所述启动子还可为诱导型启动子。所述诱导型启动子为低温诱导型启动子或茉莉酸甲酯诱导型启动子或赤霉素诱导型启动子。所述低温具体可为4℃。
本发明还提供了所述DNA分子在启动目的基因在植物中表达中的应用。
本发明还提供了所述DNA分子在培育转基因植物中的应用。
本发明还提供了所述DNA分子在植物遗传改良中的应用。
上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥。
实验证明，本发明的DNA分子具有启动子活性，并且其启动子活性具有组织特异性，含有该DNA分子的转基因植物的叶脉、花萼、花丝、雄蕊和果荚均检测到了GUS的表达；而在种子中没有GUS表达；该DNA分子也为诱导型启动子，其启动子活性可被低温、茉莉酸甲酯和赤霉素诱导。本发明的DNA分子可作为启动子用于植物的遗传改良。
附图说明
图1为第一次Tail-PCR结果。其中，M:200bp DNA Marker，1:第一轮反应，2:第二轮反应，3:第三轮反应。
图2为第二次Tail-PCR结果。其中，M:200bp DNA Marker，1:第一轮反应，2:第二轮反应，3:第三轮反应。
图3为LgUGPase基因启动子克隆产物。其中，M:200bp DNA Marker。
图4为LgUGPase基因启动子序列。其中，起始密码子用标记为蓝色，转录起始位点用+1表示，顺式作用元件用方框表示。
图5为pORE R1pLgUGPase::GUS重组载体图谱。
图6为拟南芥转基因株系基因组PCR鉴定结果。其中，M:200bp DNA Marker，WT为野生型拟南芥，1、2、3和4分别为转基因株系。
图7为拟南芥转基因株系RT-PCR鉴定结果。其中，M:200bp DNA Marker，WT为野生型拟南芥，1、2和3分别为转基因株系。
图8为转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥的GUS染色分析。A未进行任何诱导处理的7天龄幼苗，B-D分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的7天龄幼苗；E未进行任何诱导处理的14天龄幼苗，F-H分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的14天龄幼苗；I未进行任何诱导处理的21天龄植株，J-L分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的21天龄植株；M未进行任何诱导处理的21天龄植株的成熟叶片，N-P分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的21天龄植株的成熟叶片；Q未进行任何诱导处理的29天龄植株的花器官，R-T分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的29天龄植株的花器官；U未进行任何诱导处理的36天龄植株的角果及种子，V-X分别为茉莉酸甲酯、赤霉素和低温诱导的36天龄植株的角果及种子。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pORE R1载体(王欣等，拟南芥AtHAK5基因启动子顺式作用元件功能域的鉴定，华北农学报，2013,28(6)：93-97)，经内蒙古大学生命科学学院祁智教授同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列的获得
1、植物材料的处理及总DNA的提取
将兴安落叶松种子(由大兴安岭甘河林业局种子园提供)浸泡在水中放入4℃冰箱里，浸泡3-4天后播种到营养土中，一星期左右发芽，3-4个星期后提取总DNA。
2、LgUGPase基因启动子序列的克隆
(1)在LgUGPase基因的ORF序列上游设计如下3条特异性反向巢式引物：LgUGPase-P-1SP1、LgUGPase-P-1SP2和LgUGPase-P-1SP3，引物序列如表1所示。以步骤1中的总DNA为模板，利用TAIL-PCR(全式金
Figure BDA0001648956550000051
PCR SuperMix)技术扩增得到大小为586bp的LgUGPase的上游启动子序列(图1)。利用所扩增的序列设计引物LgUGPase-P-2SP1、LgUGPase-P-2SP2和LgUGPase-P-2SP3，引物序列如表1所示。通过Tail-PCR进行延伸，得到大小为789bp的DNA序列(图2)。
表1、Tail-PCR引物序列
Figure BDA0001648956550000052
(2)利用LAD1与LgUGPase-SP1引物进行Pre-amplification反应；将第一轮反应产物稀释40倍作为第二轮反应的模板，利用LAD2与LgUGPase-SP2引物进行PrimaryTAIL-PCR反应；再将第二轮PCR反应产物稀释10倍为模板，利用LAD3与LgUGPase-SP3引物进行Secondary TAIL-PCR反应，反应体系如表2所示；反应条件如表3所示。
表2、TAIL PCR反应体系
Figure BDA0001648956550000053
表3、TAIL-PCR三轮PCR反应条件
Figure BDA0001648956550000054
(3)在所克隆DNA片段的上游和下游分别设计正反向引物，经过PCR扩增得到大小为1394bp的目的产物。
(4)将步骤(3)扩增获得的目的产物克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌，利用M13M4和M13RV引物进行菌落PCR检测，选取阳性菌落进行测序验证。验证结果如图3所示，测序结果如图4所示。
测序结果表明：大小为1394bp的目的产物的核苷酸序列如序列1第1-1394位所示，其中，序列1第1-1376位所示的DNA分子为LgUGPase基因启动子序列，序列1第1377-1394位所示的DNA分子为LgUGPase基因5'-UTR序列。将序列1第1-1376位所示的DNA分子命名为pLgUGPase。
3、启动子序列分析
使用BDGP软件分析对所获得的pLgUGPase启动子序列进行分析发现，其转录起始位点为A，位于起始密码子上游18bp处；利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对所克隆的pLgUGPase启动子功能进行预测发现：pLgUGPase启动子含有启动子的核心元件TATA-BOX、CAAT-BOX和TATA-BOX以保证精准的转录启始；CAAT-BOX保证转录的频率与效率；还包含3-AF1bindingsite光响应的诱导元件；AuxRR-core参与生长素的顺式应答元件；CGTCA-motif为MeJA反应顺式作用的调节元素、P-box为赤霉素反应元件；Skn-1_motif为胚乳表达所需的顺式作用元件；LTR为参与低温反应的顺式作用元件；MBS为与干旱诱导相关的MYB结合点；TC-richrepeats为逆境胁迫作用相关元件；Circadian为昼夜节律调控相关元件(表4和图4)。
表4、pLgUGPase启动子区域的顺式作用元件
Figure BDA0001648956550000061
实施例2、pLgUGPase启动子序列的功能分析
利用同源重组的方法将pLgUGPase启动子序列克隆到pORE R1载体中GUS基因的上游，构建由该启动子驱动GUS基因的双元表达载体，通过转化拟南芥和GUS染色的方法调查pLgUGPase启动子的功能和特性。具体步骤如下：
一、转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥的获得
1、植物表达载体的构建
(1)根据pLgUGPase启动子序列设计两条重组引物。引物序列如下：pLgUGPase-XBaI-F:5'-GCCCAACGTTCTCGAGTTTTTGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGC-3’；pLgUGPase-XbaI-R:5’-CCCGGGTGGATCCAAGGCCTTATTCTAGAGTCCCCCGTTTCTCTC-3’。
(2)利用TransStart FastPfu DNA Polymerase试剂盒，以兴安落叶松的基因组DNA为模板，采用步骤(1)中的引物进行PCR扩增，得到PCR产物，即为含有pLgUGPase启动子的片段。PCR扩增反应条件如下：94℃3min；94℃30s，67℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5min。
(3)用限制性内切酶XbaI分别将回收纯化后的PCR产物和pORE R1载体进行酶切，并利用全式金pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit重组酶将XbaI酶切的pORER1载体和PCR产物进行同源重组，得到重组质粒。
(4)将重组质粒转化到大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，37℃过夜培养，利用卡那霉素对重组菌进行筛选，并进行PCR鉴定(PCR鉴定所用引物对如下：pLgUGPase-F：5’-GATGGCAAACGCTAATAAGGGGGC-3’和pORE R1-R：5’-TTCACGGGTTGGGGTTTCTACAG-3’)，扩增得到大小为400bp的目的条带的重组质粒即为阳性重组质粒，并将其命名为pORE R1-LgUGPase::GUS重组质粒。
pORE R1-LgUGPase::GUS重组质粒的图谱如图5所示，其为将序列1第1-1394位所示的含有pLgUGPase启动子的片段插入pORE R1载体的XbaI酶切位点间，且保持pORE R1载体的其他序列不变后得到的质粒。
2、拟南芥的遗传转化1
采用冻融法将pORE R1-LgUGPase::GUS重组质粒转化到农杆菌GV3101中，利用花絮浸染法转化拟南芥(哥伦比亚拟南芥)，收集T0代种子，将T0代种子播种在含有卡那霉素(40mg·L-1)的1/2MS培养基进行筛选，得到抗性植株；将抗性植株移栽到营养土中，利用
Figure BDA0001648956550000071
Plant Tissue PCR Kit快速提取抗性植株的DNA进行PCR鉴定(所用引物对为pLgUGPase-F和pORE R1-R)，扩增得到大小为400bp的目的条带的抗性植株为阳性转基因植株，将其命名为转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥，最终获得4个T1代转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥株系。基因组PCR鉴定结果如图6所示。
二、pLgUGPase启动子序列的功能分析
1、转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥中GUS基因在RNA水平上的鉴定
选取三个阳性转基因株系(与图7中编号一致)进行如下实验：提取三个阳性转基因株系的RNA，反转录得到cDNA。以得到的cDNA为模板，利用GUS基因的特异性引物对(GusF：5’-TCAACGGGGAAACTCAGCAAGC-3’和GusR：5’-CCTCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3’)进行PCR扩增，检测GUS外源基因的表达情况。利用拟南芥Actin2基因(Actin2-F:5’-GCACCACCTGAAAGGAAGTACA-3’，Actin2-R:5’-CGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3’)作为内参。利用哥伦比亚拟南芥(野生型拟南芥，WT)作为对照。结果显示，野生型拟南芥仅扩增出Actin2的片段，没有检测到目的产物；而三个阳性转基因株系中均能扩增到目的产物，表明pLgUGPase启动子在转基因拟南芥中可以启动目的外源基因(GUS)的表达。RT-PCR鉴定结果如图7所示。
2、转pORE R1-LgUGPase::GUS拟南芥的GUS染色
(1)培养：将野生型拟南芥(哥伦比亚拟南芥，WT)和3个T1代阳性转pORER1-LgUGPase::GUS拟南芥株系的种子播种在1/2MS培养基中进行培养，2周后转移到营养土中。
(2)胁迫及诱导处理：根据pLgUGPase启动子序列中顺式作用元件预测的结果，采用茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)，以及4℃低温进行处理，每处理组至少30株拟南芥。实验重复三次。具体处理方法如下：
未处理对照组：分别于培养7、14、21、29和36天后进行GUS染色。
冷胁迫：分别于培养5、12、19、27和34天后置于4℃培养箱中培养，培养2天后进行GUS染色。
GA处理：分别于培养5、12、19、27和34天后转移到目的培养基(所用培养基为向1/2MS培养基添加GA得到的GA浓度为50mg/L GA的培养基)中培养，在光照培养箱(16h光照/8h黑暗)、24℃环境下培养2天后进行GUS染色。2周龄的拟南芥转移到营养土中后，每隔12小时用含有50mg/L GA的Hoagland营养液喷洒一次。
MeJA处理：分别于培养5、12、19、27和34天后转移到目的培养基(所用培养基为向1/2MS培养基添加MeJA得到的MeJA浓度为100μmol/L的培养基)中培养，在光照培养箱(16h光照/8h黑暗)、24℃环境下培养2天后进行GUS染色。2周龄的拟南芥转移到营养土中后，每隔12小时用含有100μmol/L MeJA的Hoagland营养液喷洒一次。
(3)GUS染色：使用GUS染色试剂盒(华越洋)，将X-gluc(50×浓缩液)和GUS缓冲液按1:50(v/v)混合成GUS染色工作液。将不同处理组的拟南芥植株、叶片、花器官、角果和种子等器官置于EP管中，加入GUS染色工作液于37℃培养箱中过夜遮光温育。染色后植物材料用70％酒精脱色2-3次，在显微镜下观察并记录转基因拟南芥的表达模式。
结果如图7所示。GUS染色结果显示：在拟南芥幼苗生长时期(1周龄和2周龄)，无论是处理组还是未处理组，GUS在幼苗的各个组织器官中均高效表达(图8A-H)。在3周龄的成熟叶片中，GUS表达量大幅下降，仅在叶尖的排水器中仍然保持较高的GUS活性(图8I-P)。在4周龄拟南芥的花器官，包括花瓣、花萼以及雄蕊中均检测到了GUS的表达(图8Q-T)。在5周龄拟南芥的角果荚中检测到了GUS的表达，而在种子中始终未检测到GUS活性(图8U-X)。
通过比较处理组和未处理组的染色结果发现：GUS的表达受到MeJA、GA以及低温(4℃)的诱导，特别是在成熟植株中，GUS活性被MeJA、GA以及低温强烈诱导(图8)。相较于未处理组，MeJA、GA以及低温处理组的叶脉、花萼、花丝、雄蕊和角果荚的GUS染色明显加深。
以上结果表明，pLgUGPase启动子驱动下游基因在苗期高效表达，在成熟期表达量大幅下降；其表达受到MeJA、GA以及低温的诱导。pLgUGPase启动子驱动下游基因在苗期的营养器官中高效表达，在生殖器官的花萼、花丝、雄蕊和角果荚中亦有表达，但在种子中不表达。该结果显示pLgUGPase启动子对于经济作物的遗传改良，特别是以种子作为收获目标的粮食作物的遗传改良具有重要的应用价值。
序列表
<110>内蒙古农业大学 内蒙古大学
<120>兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中的应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1415bp
<212>DNA
<213>兴安落叶松(Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen)
<400>1
gatggcaaac gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc 60
tgacgctaaa ggcaaacttg attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt 120
cattggtgac gtttccggcc ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc 180
taattcccaa atggctcaag tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg 240
tcaatattta ccttccctcc ctcaatcggt tgaatgtcgc ccttttgtct ttggcccaat 300
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 360
tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta 420
ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg 480
ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg catgcctgca 540
ggtccccaga ttagcctttt caatttcaga aagaatgcta acccacagat ggttagagag 600
gcttacgcag caggtctcat caagacgatc tacccgagca ataatctcca ggaaatcaaa 660
taccttccca agaaggttaa agatgcagtc aaaagattca ggactaactg catcaagaac 720
acagagaaag atatatttct caagatcaga agtactattc cagtatggac gattcaaggc 780
ttgcttcaca aaccaaggca agtaatagag attggagtct ctaaaaaggt agttcccact 840
gaatcaaagg ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact cgccgtaaag 900
actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc 960
aacatggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaatgatac agtctcagaa 1020
gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc 1080
cattgcccag ctatctgtcg ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac 1140
aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt 1200
cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg 1260
tcttcaaagc aagcggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc 1320
cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagagaaca 1380
cgggggactc tagaatggct gcagcaccag cagtt 1415

Claims (9)

1.DNA分子，为序列表中序列1的第1-1376位所示的DNA片段。
2.含有权利要求1所述DNA分子的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)含有权利要求1所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述启动子为组织特异性启动子。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述组织为根和/或茎和/或叶片和/或花器官和/或果实。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述花器官为花萼和/或花丝和/或雄蕊；
和/或，所述果实为角果果荚。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述启动子为诱导型启动子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述诱导型启动子为低温诱导型启动子或茉莉酸甲酯诱导型启动子或赤霉素诱导型启动子。
9.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在植物中表达中的应用；
或，权利要求1所述DNA分子在培育转基因植物中的应用；
或，权利要求1所述DNA分子在植物遗传改良中的应用。
所述植物为拟南芥或兴安落叶松。
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