CN113174402B - 一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用 - Google Patents

一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用。本发明中，将拟南芥NSP5基因在模式植物拟南芥中超表达，获得转基因拟南芥植株。该转基因拟南芥，比野生型拟南芥提早开花5～9天，开花周期短，但不影响后代的生长结实。

Description

一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用
技术领域
本发明属于转基因技术领域，涉及一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用。
背景技术
拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科植物，它虽然没有生产价值，但由于它具有植株小、种子量大、生育期短、基因组小、易于转化的特点，成为现代生物科学许多领域的模式植物。随着生物技术手段的进一步发展以及现代化工具的应用，对拟南芥等模式植物基因的研究日益深入。拟南芥基因组总长约125Mb，于1996年拟南芥测序协会对拟南芥细胞核基因组中11870万个碱基开始进行测序，截止2000年10月已完成115Mb的测序工作，仅剩着丝粒和rDNA重复区域约10Mb未完成。拟南芥基因组序列研究为认识植物与其他真核生物间不同的遗传基础及了解植物基因功能特征奠定了基础。染色体2、4、1、3、5全长序列分析及总基因组的序列分析先后在《Nature》上发表，它们详细说明了染色体的结构、转座子及其它重复的分布、物种间的序列比较、植物特有功能的生物学解释等。拟南芥基因组成为迄今为止获得的最精确的真核细胞基因组序列，植物学家将能立即从公布的拟南芥序列中获益。现在拟南芥整个基因组序列的研究已经完成，对拟南芥基因组的系统分析提供了研究植物基因结构和进化的依据，通过拟南芥基因序列分析，发现了许多与其它植物相同的基因，且它所包含的信息为阐明开花植物的进化和农作物的遗传学信息提供了充分的依据，对开花相关基因的研究也越来越明朗。
继1990年在拟南芥(Arabiadopsis taliana)和金鱼草(Antirrhium majus)中第一次分离到控制花发育的同源异型基因(homeoric gene)以来，现在己获得了不少控制花发育的突变体，利用拟南芥的突变体己定位了约80个位点影响开花时间，并克隆到了许多与开花诱导相关的基因，并初步构建了花器官发育过程的遗传模型。其中一些基因促进开花，另一些抑制开花；一些基因促进开花的作用并不受生长条件的影响，而另一些则明显受环境因素的作用。通常可将参与开花诱导的基因分成两类：与开花时间有关的基因(flowering time gene)和分生组织特征基因(meristem-identify gene)。前一类基因的突变会使突变体的开花时间提早或延迟，这类基因中促进开花的包括：CONSTANS(CO)、LUMINIDEPENDENS(LD)、FCA、ELF3等，抑制开花的如EMF1。后一类基因决定新形成的原基的发育方向，是继续营养生长的发育方式，还是转向花的发育，这类基因如TERMINAL FLOWER(TFL)1和TFL2、CLF、LEAFY(LFY)、APETALA1(AP1)和AP2、CAULIFLOWER(CAL)等。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，并提供一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明具体采用的技术方案如下：
一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，所述拟南芥基因为NSP5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因侵染拟南芥并在植株中超表达后能促进拟南芥植株提早开花。
作为优选，所述NSP5基因连接到超表达载体上后通过农杆菌介导转化方法侵染拟南芥。
作为优选，利用NSP5基因侵染拟南芥获得能提早开花植株的方法为：
S1：扩增AKR2A启动子序列和所述NSP5基因序列；
S2：将S1中扩增的两种片段连接到pBI121载体，得到载体pBI121-pAKR2A-NSP5；
S3：将所述载体pBI121-pAKR2A-NSP5转化入农杆菌GV3101，利用利福平和卡那霉素获得转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)；
S4：将所述转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)侵染拟南芥，然后收集拟南芥种子，并筛选阳性植株。
进一步的，所述AKR2A启动子序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步的，所述S3中，载体pBI121-pAKR2A-NSP5通过电转化法转化入农杆菌GV3101。
进一步的，所述S4中，剪掉拟南芥初生花蕾和已长成角果，利用花粉管转染方法实现所述转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)对拟南芥的侵染，侵染2-3次。
进一步的，所述S4中，在对收集的拟南芥种子进行阳性植株筛选时，利用含有利福平和卡那霉素的筛选培养基筛选T0、T1、T2代拟南芥种子，至获得转基因纯系拟南芥植株。需说明的是，该筛选过程中，上一代种子先在筛选培养基上培养，待长出生长正常的幼苗后，将其移植至土壤中培养，收获下一代种子，依次类推，直至获得转基因纯系拟南芥植株。
本发明中，将拟南芥NSP5基因在模式植物拟南芥中超表达，获得纯系转基因拟南芥植株。野生型拟南芥约在第5周开花，而该转基因拟南芥约在第4周左右开花，比野生型提早开花5～9天，开花周期短，但不影响后代的生长结实。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实现形式进行进一步说明。
以拟南芥的叶片作为试验材料详细说明制备方法。
1.选取拟南芥的叶片作为RNA提取材料，提取拟南芥叶片的RNA，总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA后核酸微量检测仪测定RNA的质量与含量，-80℃保存。
2.cDNA的合成：将提取的总RNA使用TIANGEN反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。
由此，采用生物信息学的方法，获得了用于开花诱导的NSP5基因序列及AKR2A启动子序列，对应的NSP5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，AKR2A启动子序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：1序列：
ATGTGTCCGGTGGAGAACAAATGGTTAAAGGTGGGTCAAAAAGGAGCTGGTCCTGGGGCTAGAAGCTCACATGCCATGACCGTCGTTGGGAACAAAGTTTACTGTTTTGGTGGTGAGCTTAAGCCAACGATCCATATTGATAACGATCTTTACGTTTTCGATCTTGAGACTCAAGAATGGTCGATAGCTCCTGCGACCGGAGAGGCTCCTTTCCCCTGTTTTGGTGTCTCGATGGTAACGATCGGTTCAACGATCTATGTCTACGGTGGCCGTGACGATAAACGGAGATACAACGGTCTTCATTCGTATGATACTGAGACCAATGAGTGGAAATTGTTGGCTCCTGTTGAGGAAGGGCTTCCTGGTCGTAGCTATCATTCAATGGCTGGTGATGATCGGAAAGTTTATGTGTTTGGTGGTGTTACTGCTAAAGGACGTGTGAATACGCTTCATGCGTACGATGTTGTTGATCAGAAATGGGTTGAGTATCCGGCGGCTGGGGAAGCTTGTAAAGGCAGAGGAGCACCAGGGCTTGTGGTTGTGGAAGGGAGAATTTGGGTTTTGTTTGGGTTTGATGGTAATGAATTGGGTGATATTCATTGTTTTGACTTGGCTAGTGAACAGTGGAAGGCTGTGGAGACTACCGGGGATGTACCGGCGGCGAGAAGCGTGTTTCCGGCGGTTTCTTACGGGAAGTACATTGTTATTTATGGTGGGGAGGAAGAGCCGCATGAGCTTATGCACATGGGAGCTGGGAAGATGTCTGGAGAGGTTTATCAGCTTGATACAGAGACGTTAGTGTGGGAGAGGATTGTGTGCGGGAATGAAGAGGAGAAGCCGAGCCAACGTGGGTGGTGCGCGTTTACGAAAGCGGTTAAGGATGGTGAGGAAGGTTTGTTGGTTCATGGTGGGAATTCTCCGACCAATGAGCGGCTTGATGATTTGGTGTTTTGGGGTTTCTCTCATCTTAATGTCAATTAA。
SEQ ID NO：2序列：
TCTTGACCGCTACCAGCTGAAGCAAAAGATCAGCTGAAAGACCCTTCACAAATGGACGTTTCTCCAACAAAATATCCACATTCTGAAAACCCCAGTATAATACTTCAGGGTATACCAAAGCTATGATACCAACACTTAATCCACCCATTACAGGAAATACAGCCTTTGGTATCCCAGCATCCTTGTTAAGACTGTCAACAGCAGATGTCATGGATGATGTACATCGAGATAATGCCAACGAGACCAAGCCACACAGAGCGCCCAATAAAAGATAGAGTGGAAGTTCTGAAAATCAGTGACCAGCTCTCATAAGTTTGGTTTCTGGTTCCCTTGCGTAAAAAGCATAAGAATGGCAATGCATATTACCTCCAGGAGAGCGGAAGTCATAGTCAGGAACCTTAAACGCAGGTTCAGAGCCGAGACCGATTTCGGAAACCACAGAAGCAGTAACAGCACTAAGAATAACCATAGAAGTTGTGTTTGGAAGTGAAGTTGATGAATCAGTTGATGAAGAAGGCCACAAAACGGATTCAACTGCAAAGAAGCATCCAGCCACAGCTGCATTGAACCCTGTAACAACATATAACAAAGTCCTCTTAACGAATCAATCAAGAGTTCCATACGCAAGAGAGAACAACATTAGCAAATATCAGATGAACAAACCAGAGGAAATGCCAGCAGCTGAGCCAGCGGCAAGAAGTGAGAAGCCAGTCTGAGGACTTTTATTGAACAGAGAATTCACACCTTTAGCGATTGACGCTCCAATTTCAACACTTGGACCTTCCGGCCCCAGCGAATTTCCAGTCCCAAGCGTCACACATGCGGCAACAGTCTTAAGGAAAGGACGCAACACTGCCTTTACGCGATCGAGACTAGAATGAGAATCTCCAGTAGATTTTCCAGCAGATTCTCGAAGCTGATTGAGGATGCTCACCACCAAACCGCCGATAGTCGGAACAAGGATAACACGCAACCAATTGGAACCGATCGGTGCCTCTCTAAGCCACGAAGCTCCACGATCAGGAATCCCATCCCAGGAAAAGTCTCGAAGCAAGTGAACACAGTTGTTGAATAGAACCACACTAACTCCAGTGAGAACACCAACCAAACAAGCCGACGCTATCGCAAGCTCCTGAGACGGCTGCTGATCAAATCCAACCTCATCCTGATCAGTCTCCTGCTTCGCCGCCGGTAAACGCGGGAAAATTCTACCGCCAATAGCGACGGAACCGAAAAACGGTGAAAGGACGACATTGAACTGAAAAGGAACGTCGGTTTTGTGAATTGGAGCGAATCTCCGGGAAGAGACGGGAGATCGGAGGGCAGCACAGAGTGGAAGCGTGGCTGCCATGAACGGCTGCTTCCGTGAAGTGACGCGTGTTTATCCATTAACGGATAATTTGATCTTAAATCACAAATCTTACGTGGCTGATCTTATTATTCAAACGCATGGGCTTGGGCCTTGAGGTAAACAGGTTTATATGGGCCAATAACAATAAATTTGATTAAAAATAAAAGGCCTCTTAGCTTTAGGTTCAAACTTCAATGGAGAAGCAGTGGCTGTTGTCCCTCGCAGTTGATCTTCTTCTCAATCCAAAATCCAGCTGATAAATAAATAATTTTTCTCTTGTCGTCATATTAAAAAAAAGAAAGATTATCTGTATTTCAAGTTTCATGAGCGTTTGCCACCACAACATTGTCTTTTCGGGTTAATTTCTTCTTCTTCTTCCTTTCTTACTAAATTCTCTTAGGTAGTTGTCGATTCGATTTCTTTGTCTTCCTCTTCGCTTATTTTCGTTGAATCTCTTGTTTACACCTTTTCCTGAAAACAAAATTGTGTTTTTTGTAGGGTTTTAGTCATACTTA
3.扩增NSP5基因序列及AKR2A启动子序列
本步骤中，利用PRIMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列，利用设计的特异引物对AKR2A启动子序列和NSP5基因序列进行扩增，其具体做法如下：
PCR扩增引物采用“Primer 5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用Vector NTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。用cDNA为模板，NSP5-F、NSP5-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：反应总体系50μl，包括反转录产物，5×phushion HF buffer，10mmol/L dNTPs，10mM基因特异引物，phushion DNA聚合酶，DMSO，剩余用水补齐。PCR扩增程序：98℃1min，30个循环的程序为98℃10s，58℃20s，72℃1min 10s，最后72℃10min。本试验PCR扩增选用的是Takara公司的DNA聚合酶。AKR2A启动子序列扩增同上。
4.载体pBI121-pAKR2A-NSP5的构建
将pBI121载体进行酶切后，与AKR2A启动子序列和NSP5序列先后连接。鉴定正确后，测序，得到重组质粒pBI121-pAKR2A-NSP5。
5.重组质粒pBI121-pAKR2A-NSP5电转化入农杆菌GV3101
①取50μl的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2μl已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时。
②将①中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷。
③用Bio--Rad细胞融合仪进行电击。
④电击后立即加入1ml不含抗生素的SOC培养基，混合均匀后移至2ml离心管中，28℃震荡培养2h。
⑤8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有100mg/L利福平和30mg/L卡那霉素的固体LB平板上，28℃下倒置，培养2天。
6.PCR验证和菌种保存
挑取平板上长出的单菌落，菌落PCR扩增鉴定。将鉴定正确的菌种(记为转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5))取菌液800μl加入400μl甘油，混匀，液氮速冻，-80℃保存备用。
7.GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)侵染拟南芥
(1)种植野生型拟南芥。
(2)植株发育花蕾后，剪去其主枝顶端拟南芥初生花蕾和已长成角果，促进侧枝发展，在剪顶后的3-4天内，准备农杆菌的转化；
(3)取鉴定正确且保存于-80℃的转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)菌种接种于含有100mg/L利福平和30mg/L卡那霉素的固体LB平板上，28℃，培养2d。于5ml含有100mg/L利福平和30mg/L卡那霉素的液体LB培养基中活化菌种，28℃，培养1d。将活化后的菌液取1ml于200ml接种于上述液体LB培养基中，28℃，250rpm振荡培养至OD600＝0.8～0.9。
(4)将上述菌液5000rpm离心8min，用5％(w/v)蔗糖溶液悬浮菌体，使OD600＝0.8～0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02％Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了Silwet L-77的蔗糖溶液液中浸泡1min，通过该花粉管转染方法实现了前述转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)对拟南芥的侵染。
(5)把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获T0代种子。
8.拟南芥T0代种子筛选
(1)将干燥2周后的T0代种子先用75％酒精消毒1分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(含有100mg/L利福平和30mg/L卡那霉素)上。
(2)4℃春化两天后置22℃、16h光照条件下，10d后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。于与转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。10d后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8～10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。
9.转基因拟南芥的PCR鉴定
用SIGMA公司的Extract-N-AmpTM Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下：
(1)DNA提取：取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入Extraction Solution，95℃保10min，加入Dilution Solution，2℃-8℃储存以备用。
(2)PCR扩增：PCR扩增反应体系包括ddH2O、Extract-N-Amp PCR Ready mix、10mMPrimer F、10mM Primer R、Leaf disk extract；PCR扩增反应程序为：94℃3min，30个循环包括94℃1min、60℃1min、72℃1min30sec，然后72℃10min。
重复步骤8、9获得T1、T2代转基因拟南芥种子，至获得转基因纯系拟南芥植株。
10.转基因植物的表型鉴定
直观观察结果可以明显看到，野生型拟南芥和转基因的拟南芥同时生长四周后，野生型拟南芥在第5-6周开花，转基因的拟南芥过表达NSP5后比野生型拟南芥提前5～9d开花，开花周期短，但不影响后代的生长结实。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用
<141> 2021-03-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
atgtgtccgg tggagaacaa atggttaaag gtgggtcaaa aaggagctgg tcctggggct 60
agaagctcac atgccatgac cgtcgttggg aacaaagttt actgttttgg tggtgagctt 120
aagccaacga tccatattga taacgatctt tacgttttcg atcttgagac tcaagaatgg 180
tcgatagctc ctgcgaccgg agaggctcct ttcccctgtt ttggtgtctc gatggtaacg 240
atcggttcaa cgatctatgt ctacggtggc cgtgacgata aacggagata caacggtctt 300
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cctggtcgta gctatcattc aatggctggt gatgatcgga aagtttatgt gtttggtggt 420
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gtggaaggga gaatttgggt tttgtttggg tttgatggta atgaattggg tgatattcat 600
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cttgatacag agacgttagt gtgggagagg attgtgtgcg ggaatgaaga ggagaagccg 840
agccaacgtg ggtggtgcgc gtttacgaaa gcggttaagg atggtgagga aggtttgttg 900
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<211> 1866
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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gggcagcaca gagtggaagc gtggctgcca tgaacggctg cttccgtgaa gtgacgcgtg 1380
tttatccatt aacggataat ttgatcttaa atcacaaatc ttacgtggct gatcttatta 1440
ttcaaacgca tgggcttggg ccttgaggta aacaggttta tatgggccaa taacaataaa 1500
tttgattaaa aataaaaggc ctcttagctt taggttcaaa cttcaatgga gaagcagtgg 1560
ctgttgtccc tcgcagttga tcttcttctc aatccaaaat ccagctgata aataaataat 1620
ttttctcttg tcgtcatatt aaaaaaaaga aagattatct gtatttcaag tttcatgagc 1680
gtttgccacc acaacattgt cttttcgggt taatttcttc ttcttcttcc tttcttacta 1740
aattctctta ggtagttgtc gattcgattt ctttgtcttc ctcttcgctt attttcgttg 1800
aatctcttgt ttacaccttt tcctgaaaac aaaattgtgt tttttgtagg gttttagtca 1860
tactta 1866

Claims (7)

1.一种拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，所述拟南芥基因为NSP5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因侵染拟南芥并在植株中超表达后能促进拟南芥植株提早开花。
2.如权利要求1所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，所述NSP5基因连接到超表达载体上后通过农杆菌介导转化方法侵染拟南芥。
3.如权利要求1所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，利用NSP5基因侵染拟南芥获得能提早开花植株的方法为：
S1：扩增AKR2A启动子序列和所述NSP5基因序列；
S2：将S1中扩增的两种片段连接到pBI121载体，得到载体pBI121-pAKR2A-NSP5；
S3：将所述载体pBI121-pAKR2A-NSP5转化入农杆菌GV3101，利用利福平和卡那霉素获得转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)；
S4：将所述转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)侵染拟南芥，然后收集拟南芥种子，并筛选阳性植株。
4.如权利要求3所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，所述AKR2A启动子序列如SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求3所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，所述S3中，载体pBI121-pAKR2A-NSP5通过电转化法转化入农杆菌GV3101。
6.如权利要求3所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，所述S4中，剪掉拟南芥初生花蕾和已长成角果，利用花粉管转染方法实现所述转化阳性农杆菌GV3101(pBI121-pAKR2A-NSP5)对拟南芥的侵染，侵染2-3次。
7.如权利要求3所述的拟南芥基因在促进植株提早开花中的应用，其特征在于，所述S4中，在对收集的拟南芥种子进行阳性植株筛选时，利用含有利福平和卡那霉素的筛选培养基筛选T0、T1、T2代拟南芥种子，至获得转基因纯系拟南芥植株。
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"拟南芥NSP家族基因序列分析及响应干旱胁迫表达分析";姚正培等;《分子植物育种》;20191231;第1169-1174页 *

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