KR101190272B1 - 벼 유래의 ＯｓＺＩＰ1 유전자 및 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래의 OsZIP1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 OsZIP1 핵산 분자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써, 병 저항성을 가지며, 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소 또는 화분 미형성의 생육 억제 양상 및 진한 화색의 표현형을 유도할 수 있으며, 이를 통해 식물(특히, 화훼작물)의 생산성 및 상품성(미니 꽃 생산)의 증대를 도모할 수 있다.

병 저항성, 벼, 담배, OsZIP1, 생육 억제

Description

벼 유래의 ＯｓＺＩＰ1 유전자 및 단백질{ＯｓＺＩＰ1 Gene and Protein derived from Oryza sativa}

본 발명은 벼 유래의 OsZIP1 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

화훼는 전품목이 품종 보호대상 작물로 로열티 부담이 크므로 종래의 교잡육종 방법보다는 생명공학기법을 이용한 우량유전자 개발, 육종연한 단축 및 품종 다양화 기술 개발로 경쟁력 강화가 필요하다.

그리고 화훼 시장은 종자강국들의 투자 집중과 신품종 보호권 강화로 농민들의 로열티 부담이 증가 되고 있는 이때 생명공학기법을 이용한 화훼류의 신속 육종 및 품종다양화 기술개발은 고부가 종자시장 선점의 교두보 역할이 될 것으로 기대된다.

이러한 상황에서 고품질 신품종 화훼류 육종연한 단축 및 경쟁력 강화를 위해 새로운 유용 유전자를 탐색, 분리 및 분석하고 그 유전자를 이용하여 상품성이 뛰어난 형질전환 작물의 개발이 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물의 병 저항성, 생육 조절 또는 화색을 강화시키는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)에서 분리된 OsZIP1이 식물의 병 저항성을 강화시키고 생육을 조절할 수 있다는 것을 발견하고, 상기 OsZIP1 핵산 분자에 의해 형질전환된 식물체에서, 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기의 감소 또는 화분의 미형성 등 식물의 생육이 조절될 수 있고 꽃의 화색이 진해질 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 OsZIP1 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 OsZIP1을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물의 병 저항성, 생육 억제 또는 화색이 강화된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 OsZIP1 단백질을 제공한다.

본 발명자들은 식물의 병 저항성, 생육 조절 또는 화색을 강화시키는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 벼(Oryza sativa)에서 분리된 OsZIP1이 식물의 병 저항성을 강화시키고 생육을 조절할 수 있다는 것을 발견하고, 상기 OsZIP1 핵산 분자에 의해 형질전환된 식물체에서, 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기의 감소 또는 화분의 미형성 등의 식물의 생육이 조절될 수 있고 꽃의 화색이 진해질 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 OsZIP1 단백질은 식물의 병 저항성, 생육 억제 또는 화색 강화에 관여한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 생육 억제는 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소, 진한 화색 유도 또는 화분의 미형성의 형질로 나타난다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 OsZIP1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 핵산 분자는 식물이 병원균이나 병 방어 유도물질과 생육관련 생 장조절제로 처리될 때 발현이 증폭되는 유전자로서, 서열목록 제1서열에 기재된 염기서열 중 796번 내지 861번에 류신-지퍼(leucine-zipper) 영역을 가지고 있어 “OsZIP1”으로 명명하였다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명의 OsZIP1 단백질 또는 OsZIP1 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 OsZIP1은 식물이 병원균이나 병 방어 유도물질로 처리될 때 발현이 증폭되는 유전자로서 병 저항성을 가지며, 이를 과발현시키는 경우에는 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소 또는 화분의 미형성의 생육 억제 양상 및 진한 화색을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 OsZIP1은 식물(특히, 화훼작물)의 생산성 및 상품성을 증대시키는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 벡터는 (a) OsZIP1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 상기 뉴클레오타이드에 작동적으로 결합된(operably linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터에 포함되는 뉴클레오타이드 서열은 식물에서 분리되었고, 식물의 병 저항성, 생육 억제 및 화색 강화 작용을 할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) OsZIP1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있 으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 본 발명의 벡터는 리포터 분자(예: 녹색형광단백질(GFP), 노란형광단백질(YFP), 붉은형광단백질 (RFP), GFP-유래의 변이단백질류, 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제(GUS))를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt), 등) 또는 제 초제 내성 유전자(예: Bar 등)를 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 도 4의 유전자 지도를 갖는 pB7WG2D-OsZIP1이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.

재조합 벡터를 식물체에 도입시키는 방법은 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, Academic Press; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다)에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 및 아그로박테리움-중재 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)에 의해 재조합 벡터를 식물체에 도입시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 형질전환 식물체는 다양한 식물체를 포함하며, 바람직하게는 식물체는, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리 및 수수로 구성된 군으로부터 선택되는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 구성된 군으로부터 선택되는 채소 작물 류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 구성된 군으로부터 선택되는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 구성된 군으로부터 선택되는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 구성된 군으로부터 선택되는 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 구성된 군으로부터 선택되는 사료 작물류로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 식물체는 담배, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 식물의 병 저항성, 생육 억제 또는 화색이 강화된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다: (a) 식물 세포 또는 식물 조직을 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물 세포 또는 식물 조직을 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물 세포 또는 식물 조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환체를 수득하는 단계.

본 발명에서 이용되는 익스플랜트로는 식물 세포 또는 식물 조직이며, 식물 조직을 이용하는 경우에는 캘러스를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 87:9568- 9572(1990)) 및 아그로박테리움-중재 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-중재 형질전환이 가장 바람직하다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달은 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(미합중국 특허 제5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 게놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (ⅰ) OsZIP1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320, pGA1611, pGA1991, pNB96 및 pB7WG2D와 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); An et al., 1988; 및 Lee et al., 1999). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 익스플랜트를 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물체내로 감염된다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 최종적으로 형질전환 식물체를 형성한다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 게놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).)

본 발명의 방법에 따라 형질전환되어 생산된 형질전환 식물체는, 병 저항성을 가지며, 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소 또는 화분의 미형성 등의 생육 억제 양상 및 진한 화색을 나타내며, 결국 이렇게 변화된 형질은 식물(특히, 화훼작물)의 생산성 및 상품성(미니 꽃 생산)을 증대시키는 데 크게 기여할 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 벼 유래 OsZIP1 단백질, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체, 상기 재조합 벡터를 이용하여 식물의 병저항성, 생육 억제 또는 화색이 강화된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 OsZIP1 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킴으로써, 병 저항성을 가지며, 야생형에 비하여 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소 또는 화분의 미형성 등의 생육 억제 양상 및 진한 화색의 표현형을 유도할 수 있으며, 이 를 통해 식물(특히, 화훼작물)의 생산성 및 상품성(미니 꽃 생산)을 증대를 도모할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: EST 분석에 의한 유전자 선발

벼흰잎마름병균 Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo ) 처리 3시간 후의 동진벼의 잎으로부터 RNeasy 플랜트 미니 키트(Qiagen Co.)를 이용하여 총 mRNA를 분리하고 이로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고 EST(expression sequence tag)를 분리하여 염기서열 분석하였다. 염기서열 분석은 ABI의 sequencing kit를 이용하여 실시하였다. 결정된 염기서열에 대하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 블라스트(blast) 조사한 결과, 루이신 지퍼(leucine zipper) 영역을 갖고 있어 OsZIP1으로 명명하였다. OsZIP1의 염기서열 및 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다. 파란색의 아미노산은 루이신 지퍼 영역을 나타낸 것이다.

실시예 2: OsZIP1 유전자의 발현 분석 및 상동성 조사

벼 종자를 2-3일간 발아시켜 파종 후 6주된 동진벼에 도열병균, 흰잎마름병균, SA(salicylic acid), BTH(benzothiadiazol), JA(jasmonic acid) 및 ABA(abscisic acid) 등을 처리하여 6시간 후 샘플링하였다. 각각의 시료를 RNeasy 플랜트 미니 키트(Qiagen Co.)을 이용하여 총 RNA를 분리한 후 15μg의 총 RNA를 1.2% 포름알데히드의 아가로오스 젤에서 전기영동하였고, OsZIP1의 전장 프로브(full length probe)로 노던 혼성화(Northern Hybridization)(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press) 하여 발현을 분석하였다. 노던 혼성화 과정은 다음과 같다: 혼성화 버퍼(0.5M NaHPO₄, 1% 결정성 BSA, 1mM EDTA, 7% SDS/1ℓ)에 총 RNA가 전이된 멤브레인을 넣어 65℃에서 15분 이상 예비 혼성화한 후 프로브를 3분간 끓인 후 식혀서 넣고, 65℃에서 12시간 이상 진탕시켰다. 2× SSC/0.1% SDS 용액으로 65℃에서 10분간 세정한 후, 가이거 카운터로 모니터하여 신호가 강하면 좀 더 엄격한 조건의 용액 (1× SSC/0.1% SDS 또는 0.1× SSC/0.1% SDS)으로 65℃에서 세정한 후, BAS 카세트(후지필름사)에서 12시간 이상 노출시켰다.

도 2에서 볼 수 있듯이, OsZIP1 유전자는 병원균과 여러 화합물 처리에 의해 발현이 유도됨을 확인하였다. 또한, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, OsZIP1 단백질을 TaZIP1(AAX97504, Triticum aestivum), HvXantha1(AAW80518, Hordeum vulgare), AtACSF(CAB72164, Arabidopsis thaliana), GhZIP1(AAR20445, Gossypium hirsutum), EeZIP(AAl13304, Euphorbia esula), RcMPEC(EEF38712, Ricinus communis), CsZIP(AAO89566, Cucumis sativus) 및 TrDSLP(CAK54360, Trifolium repens) 등과 상동성을 조사해 본 결과, OsZIP1 단백질은 밀의 ZIP1 단백질(TaZIP1)(AAX97504, Triticum aestivum)과 보리의 Xantha1 단백질(HvXantha1)(AAW80518, Hordeum vulgare)과 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다.

실시예 3: 형질전환용 운반체 작성 및 형질전환

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, OsZIP1 유전자가 여러 가지 외부 자극에 의해 발현이 증진되는 효과를 보았기 때문에 이 유전자의 기능분석을 위해 식물형질전환용 벡터를 제조하였다. 우선, OsZIP1 cDNA를 주형으로 하고 5’프라이머 A(5’- AA AAA GCA GGC TAT ATG GCC TCC TCC-3’)와 3’프라이머 B (5’-A GAA AGC TGG GTG TCA GTA GAC AAG-3’)로 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하였다((94℃, 5분, 1사이클; 94℃, 30초, 55℃, 30초, 72℃, 2분, 30사이클; 및 72℃, 7분). 이어, 증폭산물을 주형으로 하고 attB1 프라이머(5'-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3')와 attB2 프라이머(5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3')로 다시 PCR로 증폭하였다(94℃, 5분, 1사이클; 94℃, 30초, 45℃, 30초, 72℃, 2분, 5사이클; 94℃, 30초, 55℃, 30초, 72℃, 2분, 20사이클; 72℃, 10분). 이어, 상기 증폭산물 및 Invitrogen의 게이트웨이 클로닝 시스템을 이용하여 pDONOR201 벡터에 BP 반응에 의해 엔트리(entry) 클론을 만들었다. 이 엔트리 클론으로부터 식물발현 벡터인 pB7WG2D(Invitrogen)에 LR 반응에 의해 식물발현용 pB7WG2D/OsZIP1 벡터를 제조하였다. 최종적으로 구축된 벡터의 유전자 지도는 도 4에 나타내었다.

제조된 pB7WG2D/OsZIP1 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404, Invitrogen)에 전기 천공법(electroporation)으로 도입한 다음, 배양실에서 무균상태로 자란 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)에 리프 디스크(leaf disc)법으로 형질전환시켰다. 상세하게는, 담배잎을 대략 5 x 5 mm 크기로 잘라서 200 ㎕의 아그로박테리움(Agrobacterium)이 포함된 MSO 액체배지(MS염 4.3g, 수크로스 30 g/l, pH 5.6-5.8)에 넣었다가 암조건에서 2-3일 동안 배양하고, 배양된 잎 절편을 500 ㎍/㎕의 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 증류수로 2-3회 세척한 후 캘러스-슈트(callus-shoot) 유도배지(MSO 배지에 100㎍ NAA, 1mg BA, 500㎍ 세포탁심, 1 mg 포스피노트리신(phospinothricin), 0.7% 피토 한천(phyto agar), pH 5.6)으로 옮기고, 2주마다 새로운 배지로 옮겨 주었다. 슈팅(Shooting)된 개체를 MSO 배지에 옮겨 27-29℃/광 조건에서 배양하여 뿌리를 내리고 1주일이 지나면 포트(pot)에 심어 온실에서 배양하고, 1주일 후 0.3% 바스타를 스프레이하여 생존한 개체를 선발하였다. 그 결과 13개의 과발현 형질전환체를 얻었다.

실시예 4: 형질전환체의 분자생물학적 특성 분석

OsZIP1 과발현 형질전환체의 잎으로부터 지놈 DNA를 분리하여 35S-S 프라이 머(5'-CAA GGC TTG CTT CAC AAA CC-3')와 OsZIP1-AS 프라이머(5'-TCA GTA GAC AAG CTG GGG CTC-3')를 이용하여 PCR로 확인하였으며(도 5의 패널 A), 총 RNA를 분리한 후 OsZIP1 유전자를 탐침으로하여 노던 혼성화를 실시하여 발현을 분석하였고(도 5의 패널 B) 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, OsZIP1 과발현 형질전환체에서 OsZIP1은 지놈 DNA 레벨에서 검출 되었고 또한 이 형질전환체로부터 발현된다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: OsZIP1 유전자 형질전환 담배의 형태 관찰

OsZIP1 유전자 과발현 형질전환 담배의 전체적인 형태를 야생형과 비교해 본 결과 전체적으로 개체의 크기는 작았고, 꽃을 관찰 해 본 결과 크기가 작았으며 화색은 진했고 수술은 짧으며 꽃가루가 없는 것으로 관찰되었다(참조: 도 6).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 벼에서 분리한 OsZIP1을 암호화하는 cDNA의 염기서열 및 아미노산서열을 보여준다.

도 2는 OsZIP1 유전자의 병원균 또는 병 방어 물질 처리별 노던(Northern) 발현 분석결과를 나타낸다.

도 3은 OsZIP1 단백질과 다른 관련 단백질과의 상동성 분석도를 보여준다.

도 4는 OsZIP1 과발현 형질전환용 벡터 지도를 나타낸다(LB(left border), RG(right border), proD(roD promotor), EgfpER(green-fluorescent protein linked to the endoplasmic), T35S(CaMV 35S terminator), p35S(CaMV 35S promoter), attB1(attachment site B1), OsZIP1(OsZIP1 gene), attB2(attachment site B2), Bar(Bar coding region), SmR(Small muts Related)).

도 5는 OsZIP1 유전자 과발현 형질전환체의 확인(패널 A) 및 노던 혼성화에 의한 발현 분석결과(패널 B)를 보여준다(M: 분자량 마커, V: pB7WG2D 벡터, X: 야생형담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi), 1 내지 13: OsZIP1 과발현 형질전환 식물체).

도 6은 OsZIP1 과발현 담배의 형태(패널 A), 절반으로 절단한 꽃의 형태(패널 B), 꽃봉오리의 형태(패널 C), 개화 후 꽃의 전체 형태(패널 D), 꽃의 크기와 화색의 차이(패널 E) 및 암술과 수술의 형태(패널 F)를 보여주는 사진이다.

<110> Rural Development Administration <120> OsZIP1 Gene and Protein Derived from Oryza sativa <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1227 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (1)..(1224) <400> 1 atg gcc tcc tcc gcc atg gag ctc tcc ctc ctc aac ccg gcg gca atg 48 Met Ala Ser Ser Ala Met Glu Leu Ser Leu Leu Asn Pro Ala Ala Met 1 5 10 15 cgc ggc ctc tcc gcc gcc aag ccc cgc gtc gtg tct tcc agg cgc atc 96 Arg Gly Leu Ser Ala Ala Lys Pro Arg Val Val Ser Ser Arg Arg Ile 20 25 30 gtg cgg ttc cgc gtg gcg tcg tca gcc gcg gcg ccg ccc gcg gcg aag 144 Val Arg Phe Arg Val Ala Ser Ser Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Lys 35 40 45 ccc ggg acg ccc aag aag cgc ggg aag acg gag atc cag gag acg ctg 192 Pro Gly Thr Pro Lys Lys Arg Gly Lys Thr Glu Ile Gln Glu Thr Leu 50 55 60 ctg acg ccg cgg ttc tac acc acg gac ttc gac gag atg gag cgg ctg 240 Leu Thr Pro Arg Phe Tyr Thr Thr Asp Phe Asp Glu Met Glu Arg Leu 65 70 75 80 ttc aac gcc gag atc aac aag cag ctc aac cag gag gag ttc gac gcg 288 Phe Asn Ala Glu Ile Asn Lys Gln Leu Asn Gln Glu Glu Phe Asp Ala 85 90 95 ctg ctg cag gag ttc aag acg gac tat aac cag acc cac ttc gtc cgc 336 Leu Leu Gln Glu Phe Lys Thr Asp Tyr Asn Gln Thr His Phe Val Arg 100 105 110 aac ccg gag ttc aag gcc gcc gcc gac aag atg gag ggg cct ctc agg 384 Asn Pro Glu Phe Lys Ala Ala Ala Asp Lys Met Glu Gly Pro Leu Arg 115 120 125 cag atc ttc gtc gag ttc ctc gag cgc tcc tgc acc gcg gag ttc tcc 432 Gln Ile Phe Val Glu Phe Leu Glu Arg Ser Cys Thr Ala Glu Phe Ser 130 135 140 ggg ttc ctc ctc tac aag gag ctc ggc cgc agg ctc aag aaa aca aac 480 Gly Phe Leu Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Arg Leu Lys Lys Thr Asn 145 150 155 160 cca gtg gtg gct gag atc ttc tcg ctc atg tcc agg gat gag gcc cgg 528 Pro Val Val Ala Glu Ile Phe Ser Leu Met Ser Arg Asp Glu Ala Arg 165 170 175 cac gct ggg ttc ttg aac aag ggg ctg tct gat ttc aac ttg gca ctg 576 His Ala Gly Phe Leu Asn Lys Gly Leu Ser Asp Phe Asn Leu Ala Leu 180 185 190 gac ctc ggg ttc ttg acc aag gct agg aag tac acc ttc ttc aag ccc 624 Asp Leu Gly Phe Leu Thr Lys Ala Arg Lys Tyr Thr Phe Phe Lys Pro 195 200 205 aag ttc atc ttc tac gcg acc tac ctg tcg gag aag att ggg tac tgg 672 Lys Phe Ile Phe Tyr Ala Thr Tyr Leu Ser Glu Lys Ile Gly Tyr Trp 210 215 220 agg tac atc acc atc ttc agg cac ctc aag gcg aac ccg gag tac cag 720 Arg Tyr Ile Thr Ile Phe Arg His Leu Lys Ala Asn Pro Glu Tyr Gln 225 230 235 240 gtg tac ccc atc ttc aag tac ttt gag aac tgg tgc cag gat gag aac 768 Val Tyr Pro Ile Phe Lys Tyr Phe Glu Asn Trp Cys Gln Asp Glu Asn 245 250 255 cgt cac ggt gat ttc ttc tcc gcg ctg ctc aag gcg cag ccg cag ttc 816 Arg His Gly Asp Phe Phe Ser Ala Leu Leu Lys Ala Gln Pro Gln Phe 260 265 270 ctc aac gac tgg aag gcc aag ctc tgg tca cgg ttc ttc tgc ctc tcg 864 Leu Asn Asp Trp Lys Ala Lys Leu Trp Ser Arg Phe Phe Cys Leu Ser 275 280 285 gtg tat gtg acc atg tac cta aat gat tgc caa cgt act aca ttc tat 912 Val Tyr Val Thr Met Tyr Leu Asn Asp Cys Gln Arg Thr Thr Phe Tyr 290 295 300 gaa ggg att ggt ctg gac acc aaa gaa ttc gac atg cat gtg ata att 960 Glu Gly Ile Gly Leu Asp Thr Lys Glu Phe Asp Met His Val Ile Ile 305 310 315 320 gag acc aac cgc aca aca gca agg att ttc ccc gct gtt ctt gac gtc 1008 Glu Thr Asn Arg Thr Thr Ala Arg Ile Phe Pro Ala Val Leu Asp Val 325 330 335 gag aac cct gaa ttc aag agg aag tta gac agg atg gtg gag atc aac 1056 Glu Asn Pro Glu Phe Lys Arg Lys Leu Asp Arg Met Val Glu Ile Asn 340 345 350 aaa aag atc att gcc ata ggc gag tct gac gat atc ccc ctg gtg aag 1104 Lys Lys Ile Ile Ala Ile Gly Glu Ser Asp Asp Ile Pro Leu Val Lys 355 360 365 aac ctg aag agg att cct cac gtt gcc gct ctg gtg tct gag atc att 1152 Asn Leu Lys Arg Ile Pro His Val Ala Ala Leu Val Ser Glu Ile Ile 370 375 380 gct gcg tac ctc atg ccc cca atc gag tct ggc tct gtt gat ttc gct 1200 Ala Ala Tyr Leu Met Pro Pro Ile Glu Ser Gly Ser Val Asp Phe Ala 385 390 395 400 gaa ttc gag ccc cag ctt gtc tac tga 1227 Glu Phe Glu Pro Gln Leu Val Tyr 405 <210> 2 <211> 408 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Ser Ser Ala Met Glu Leu Ser Leu Leu Asn Pro Ala Ala Met 1 5 10 15 Arg Gly Leu Ser Ala Ala Lys Pro Arg Val Val Ser Ser Arg Arg Ile 20 25 30 Val Arg Phe Arg Val Ala Ser Ser Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Lys 35 40 45 Pro Gly Thr Pro Lys Lys Arg Gly Lys Thr Glu Ile Gln Glu Thr Leu 50 55 60 Leu Thr Pro Arg Phe Tyr Thr Thr Asp Phe Asp Glu Met Glu Arg Leu 65 70 75 80 Phe Asn Ala Glu Ile Asn Lys Gln Leu Asn Gln Glu Glu Phe Asp Ala 85 90 95 Leu Leu Gln Glu Phe Lys Thr Asp Tyr Asn Gln Thr His Phe Val Arg 100 105 110 Asn Pro Glu Phe Lys Ala Ala Ala Asp Lys Met Glu Gly Pro Leu Arg 115 120 125 Gln Ile Phe Val Glu Phe Leu Glu Arg Ser Cys Thr Ala Glu Phe Ser 130 135 140 Gly Phe Leu Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Arg Leu Lys Lys Thr Asn 145 150 155 160 Pro Val Val Ala Glu Ile Phe Ser Leu Met Ser Arg Asp Glu Ala Arg 165 170 175 His Ala Gly Phe Leu Asn Lys Gly Leu Ser Asp Phe Asn Leu Ala Leu 180 185 190 Asp Leu Gly Phe Leu Thr Lys Ala Arg Lys Tyr Thr Phe Phe Lys Pro 195 200 205 Lys Phe Ile Phe Tyr Ala Thr Tyr Leu Ser Glu Lys Ile Gly Tyr Trp 210 215 220 Arg Tyr Ile Thr Ile Phe Arg His Leu Lys Ala Asn Pro Glu Tyr Gln 225 230 235 240 Val Tyr Pro Ile Phe Lys Tyr Phe Glu Asn Trp Cys Gln Asp Glu Asn 245 250 255 Arg His Gly Asp Phe Phe Ser Ala Leu Leu Lys Ala Gln Pro Gln Phe 260 265 270 Leu Asn Asp Trp Lys Ala Lys Leu Trp Ser Arg Phe Phe Cys Leu Ser 275 280 285 Val Tyr Val Thr Met Tyr Leu Asn Asp Cys Gln Arg Thr Thr Phe Tyr 290 295 300 Glu Gly Ile Gly Leu Asp Thr Lys Glu Phe Asp Met His Val Ile Ile 305 310 315 320 Glu Thr Asn Arg Thr Thr Ala Arg Ile Phe Pro Ala Val Leu Asp Val 325 330 335 Glu Asn Pro Glu Phe Lys Arg Lys Leu Asp Arg Met Val Glu Ile Asn 340 345 350 Lys Lys Ile Ile Ala Ile Gly Glu Ser Asp Asp Ile Pro Leu Val Lys 355 360 365 Asn Leu Lys Arg Ile Pro His Val Ala Ala Leu Val Ser Glu Ile Ile 370 375 380 Ala Ala Tyr Leu Met Pro Pro Ile Glu Ser Gly Ser Val Asp Phe Ala 385 390 395 400 Glu Phe Glu Pro Gln Leu Val Tyr 405

Claims (10)

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9. 다음 단계를 포함하는 식물의 병 저항성, 생육 억제 또는 화색이 강화된 형질전환 식물체의 제조방법:

   (a) 식물 세포 또는 식물 조직을 OsZIP1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 단계;

   (b) 형질전환된 식물 세포 또는 식물 조직을 선별하는 단계; 및

   (c) 상기 형질전환된 식물 세포 또는 식물 조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 생육 억제는 식물 개체의 크기 감소, 수술 길이의 단축, 꽃의 크기 축소 또는 화분의 미형성의 형질로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.

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