KR101605844B1 - 뿌리 발달 관련 유전자 및 이를 이용한 형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CRF2 또는 CRF3 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열이 삽입된 식물 발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 뿌리 발달 촉진 방법을 제공한다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 뿌리 발달에 관여하고, 상기 뉴클레오타이드를 식물체에 형질전환하여 과발현을 유도하면 식물의 측근 개수가 증가하여 결과적으로 식물체의 뿌리 발달이 촉진되며, 이러한 특징을 통해 CRF2와 CRF3 유전자를 식물의 수율 및 바이오매스 생산량이 증가된 형질전환 식물체의 개발에 활용할 수 있다.

Description

뿌리 발달 관련 유전자 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Gene Implicated in Root Development and Plants Transformed with the Same}

본 발명은 뿌리 발달 관련 유전자 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다.

산업 혁명 이후 과도한 화석 연료의 사용으로 인한 에너지 고갈과 화석 연료 사용에 따른 지구 온난화 및 화석 연료가 연소되는 과정에서 발생하는 미세먼지와 같은 대기 환경오염 등의 문제를 겪으며 이러한 문제를 해결할 수 있는 대체에너지로서 바이오에너지의 중요성이 크게 부각되고 있다. 비식용 바이오매스 식물체로부터 바이오에너지를 대량 생산하기 위해서는 바이오매스 증진을 위한 과학적 방안이 도출되어야 하고 이러한 방안의 일환으로 식물의 뿌리 발달 및 조절 기작에 대한 연구가 필요하다.

과거 식물 육종가들이 지상부 형질의 개선을 통하여 큰 낱알을 얻는데 성공했지만 뿌리 형질은 그렇지 못하다. 최근 많은 과학자들은 작물의 수율을 높이기 위한 녹색혁명을 뛰어넘는 제 2차 녹색혁명의 전략으로 고비용 투입에 의존 하지 않는 뿌리연구에 관심이 집중되고 있다(Gewin, 2010, Nature 466, 552-553). 뿌리 발달과 관련된 신호전달과정을 연구하여 환경 적응력이 뛰어난 저비용 고 수율 디자이너 루츠(designer roots)를 가진 식물체를 창출 하는데 적용된다.

식물의 뿌리 조직은 식물 생장에 필수적인 물과 영양분 같은 물질의 이동통로이자 식물 고착에 필수적인 기관으로서 성숙대(maturation zone), 신장대(elongation zone), 분열대(meristematic zone)로 나누어진다. 측근 형성은 뿌리 체계 구조의 주요 결정요인이자 경제성 작물의 수율 및 바이오 에너지 작물의 바이오매스 수율을 증진시키는 주요 인자이다(Orman-Ligeza, 2013, Trends Plant Sci. 18,459-467). 애기장대에서 측근은 주근의 목질 조직을 덮고 있는 내초 세포(founder cell)로부터 뿌리 기저 분열 조직에서 옥신에 의해 자극 받아 개시된다(Malamy and Benfey, 1997, Development 124, 33-44; Peret et al., 2009, Trends Plant Sci. 14, 399-683). 내초세포의 일련의 수층분열을 통해 몇 개의 줄기세포가 생성되고 병층과 수층 분열을 받아 매우 잘 조직화된 돔 모양의 원기(primordium)가 형성된다. 이후 측근 원기가 계속 성정하여 주근의 내피, 피층, 표층 등을 통과하여 출현된 측근을 형성하고, 최종적으로 측근에 정단 분열조직이 생성되어 측근 생장을 조절한다.

애기장대 2개-인자 시그널링 시스템(two-component signaling system)은 식물호르몬 사이토키닌 신호전달 경로뿐만 아니라 비생물학적 스트레스 반응에서도 중요한 역할을 수행하며 세포분열, 뿌리 및 옆 분화, 엽록체 발달, 옆의 노화 지연 등 다양한 생리 발달학적 과정들을 조절한다고 알려져 있다(Mand Sheen, 2007, Science 318, 68-69; Kieber and Schaller, 2014, Arabidopsis Book). 사이토키닌에 의해 전사단계에서 발현이 증가되는 CRF2는 AP2 계열의 전사조절 유전자로서, CRF의 기능 상실 다중 돌연변이체 분석을 통해 CRF가 식물의 배, 떡잎, 잎의 발달 조절에 관여함을 확인되었다(Rashotte et al., 2007, PNAS 103, 11081-11085). 그러나 본 발명에서와 같이 애기장대의 CRF2와 CRF3가 식물의 측근 및 뿌리 발달에 관여한다고 밝혀진 바는 없다.

한편, 한국공개특허 2012-0110809에는 AtEXPA7(expansin A7) 유전자를 이용하여 식물의 뿌리 생장을 증가시키는 방법이 기재되어 있고, 한국공개특허 2001-0099064에는 잎맥 발달 조절 유전자 AWI31 유전자를 이용하여 형질전환된 잎맥 발달, 뿌리 발달, 수명 및 노화 조절된 식물체를 기술하였으나, 본 발명에서 와 같이 CRF2 와 CRF3 유전자를 이용하여 식물의 측근 형성을 촉진하는 방법 및 식물체에 대해서는 밝혀진바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물체의 뿌리 발달을 조절할 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열이 식물체의 뿌리 발달에 관여하고, 이를 식물체에 형질전환시킨 형질전환 식물체에서 측근 형성을 위한 최초 세포 분열이 촉진되고, 측근 개수가 증가하는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물로 형질전환된 식물세포 및 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 뿌리 발달을 촉진하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 식물체의 뿌리 발달을 조절할 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열이 식물체의 뿌리 발달에 관여하고, 이를 식물체에 형질전환시킨 형질전환 식물체에서 측근 형성을 위한 최초 세포 분열이 촉진되고, 측근 개수가 증가하는 것을 규명하였다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열은 각각 애기장대에 존재하는 CRF2(Cytokinin response factor2) 및 CRF3(Cytokinin response factor3) 단백질의 아미노산 서열이며, 하기의 실시예에서 구체적으로 보는 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 상기 단백질 또는 이들의 코딩 유전자를 과발현시킬 경우 측근 형성을 위한 최초 세포 분열이 촉진되었고, 결과적으로 측근 개수가 증가하는 것을 발견하였다. 한편, CRF2 및 CRF3 유전자의 기능 상실 돌연변이체에서는 주근 길이 및 측근 개수, 그리고 주근 길이 당 측근 개수 즉, 측근 밀도가 감소되는 것을 발견하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 식물체 뿌리 발달 촉진용 조성물은 식물체의 측근 개수를 증가시킨다.

본 발명에서 용어 “측근”은 식물체의 원뿌리에서 갈라져 나온 작은 뿌리를 말하며, 곁뿌리라고도 불린다.

측근 형성은 뿌리 체계 구조의 주요 결정요인이자 경제성 작물의 수율 및 바이오 에너지 작물의 바이오매스 수율을 증진시키는 주요 인자로 측근 형성을 증가시키는 본 발명의 조성물은 식물체의 바이오매스 수율을 증진시키는 효과를 나타낸다.

본 발명에서 이용되는 CRF2 또는 CRF3을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 업스트림에 HA(hemagglutinin) 항원, 바람직하게는 4개 연속의 HA 항원을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리 발달을 촉진하는 방법을 제공한다.

목적 뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 CRF2 또는 CRF3 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열이 삽입된 식물 발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 뿌리 발달 촉진 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 뿌리 발달에 관여하고, 상기 뉴클레오타이드를 식물체에 형질전환하여 과발현을 유도하면 식물의 측근 개수가 증가하여 결과적으로 식물체의 뿌리 발달이 촉진되며, 이러한 특징을 통해 CRF2와 CRF3 유전자를 식물의 수율 및 바이오매스 생산량이 증가된 형질전환 식물체의 개발에 활용할 수 있다.

도 1은 Pro _CRF2: EGFP:GUS(A)와 Pro _CRF3: EGFP:GUS(B) 벡터 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 Pro _CRF2 :EGFP:GUS(A-E) 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS(F-L) 형질전환 애기장대 식물체의 CRF2 및 CRF3 프로모터에 의한 GUS 보고자 유전자의 조직 특이적 발현 양상을 나타낸다.
도 3은 Pro _CRF2 :EGFP:GUS (A) 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS(B) 형질전환 애기장대 식물체의 측근 발달 동안의 발현 양상을 나타낸다.
도 4는 crf2 돌연변이체와 crf3 돌연변이체의 T-DNA 삽입 위치를 나타낸다.
도 5는 야생형, crf2-2, crf3-2, crf3-3, crf2-2 crf3-2, crf2-2 crf3-3 기능 상실 돌연변이체의 표현형(A), 주근 길이(B), 주근 길이 당 측근 개수, 측근밀도 (C) 및 야생형, Pro _35S :4xHA:CRF2, Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체의 표현형(D), 주근 길이(E), 주근 길이 당 측근 개수, 측근밀도(F)를 나타낸다.
도 6은 Pro _35S: 4xHA:CRF2(A)와 Pro _35S: 4xHA:CRF3(B) 벡터 모식도이다.
도 7은 측근 원기 (primordium) 발달 단계상 야생형, crf2-2, crf3-2, crf2-2 crf3-2 기능 상실 돌연변이체, Pro _35S :4xHA:CRF2, Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 식물체의 측근 원기의 밀도를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: Pro _CRF2 :EGFP:GUS 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS 형질전환 식물체의 조직 특이적 발현 양상 분석

CRF2와 CRF3의 조직 특이적 발현 양상을 조사하기 위하여 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)와 GUS 보고자 유전자가 융합된 CRF2 프로모터 벡터 Pro _CRF2 :EGFP:GUS와 CRF3 프로모터 벡터 Pro _CRF3 :EGFP:GUS를 각각 제작(도 1)하여 애기장대 Columbia-0(Col-0)에 각각 형질전환을 수행하였다. ATG 번역 개시점으로 부터 약 2 Kbp 상단부에 해당하는 CRF2 프로모터와 CRF3 프로모터 각각 부위를 Pfu DNA 중합효소와 프라이머 attB1 CRF2 pro F 5'-AAA AAA GCA GGC TCC TAC AAA GTG TTA CCC GAT CGT GTC-3'와 attB2 CRF2 pro R 5'-CAA GAA AGC TGG GTC TTT TCT TTC GTA TTC TCT GTT TTT G-3', attB1 CRF3 pro F 5'-AAA AAA GCA GGC TCC CGG CTT TCA ACA AAT TGA TCA AGA TG-3'와 attB2 CRF3 pro R 5'-CAA GAA AGC TGG GTC TAC TGT TTC TTT TAT GGA CTC TCT C-3'를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이후, attB1 5'-ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3'와 attB2 5'-ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG T-3' 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 후 GatewayBP Clonase^TMII enzyme mix(Invitrogen)를 사용하여 pDONR221 벡터에 재조합 반응시켰다. GatewayLR Clonase^TMII enzyme mix(Invitrogen)를 사용하여 pBGWFS7 목적 벡터에 재조합 반응을 시켜 Pro _CRF2 :EGFP:GUS 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS 보고자 유전자 발현 벡터를 제작하였다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움에 형질 전환 시킨 뒤 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질 전환시킨 식물체는 종자를 받은 뒤 0.5X Murashige Skoog(MS), 10 mg/ml bsata 배지에서 자라는 독립적인 개체를 선별한 뒤 흙에 옮겨 심은 뒤 키워서 각가 종자를 따로 받아 다시 같은 조성의 배지에 심었을 때 살아남는 것과 죽는 표현형이 3:1 비율로 나타나는 개체군을 확인하였고 궁극적으로 Pro _CRF2 :EGFP:GUS 형질전환 식물체는 9개, Pro _CRF3 :EGFP:GUS 형질전환 식물체는 6개의 동형접합 형질전환 식물체를 분리하였다. GUS 단백질의 발현을 살펴보기 위하여 0.5X MS, 1.5 % 수크로스, 2.5 mM Mes, pH 5.7 그리고 0.8% 아가가 포함된 배지에 14일 키운 다음, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide(X-Gluc) 시약을 이용하여 37℃에서 16시간 GUS 염색하였고 에탄올을 이용하여 엽록체를 제거한 후 90% 글라이세롤에 보관한 후 관찰하였다. 샘플은 Leica DM2500 현미경을 사용하여 DIC(Differential Interference Contrast)를 포함한 50-400X 배율로 관찰하였다.

GUS 단백질 발현 분석을 통해 CRF2는 엽과 뿌리의 분열 조직, 엽의 관다발 조직뿐만 아니라 측근과 측근 원기 세포에서 발현되며, CRF3는 엽과 뿌리의 분열 조직, 엽의 관다발 조직, 측근과 측근 원기 세포뿐만 아니라 화분과 암술머리에서도 발현이 나타남을 알 수 있다(도 2).

실시예 2: Pro _CRF2 :EGFP:GUS 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS 형질전환 식물체의 측근 발달 동안의 발현 양상 분석

측근 발달 동안 CRF2와 CRF3의 조직 특이적 발현 양상을 조사하기 위하여 Pro _CRF2 :EGFP:GUS 및 Pro _CRF3 :EGFP:GUS 형질전환 식물체를 사용하여 GUS 단백질 발현 분석을 수행하였다. 종자를 4℃에서 3일간 저온 처리 후 0.5×MS, 1.5% 수크로스, 2.5 mM Mes, pH 5.7 그리고 0.8% 아가가 포함된 배지에 수직으로 파종하여 23℃, 16시간 광 조건에서 10일 키운 후 X-Gluc 시약을 이용하여 37℃에서 16시간 GUS 염색하였고 에탄올을 이용하여 엽록체를 제거한 후 90% 글라이세롤에 보관한 후 관찰하였다. 샘플은 Leica DM2500 현미경을 사용하여 DIC를 포함한 400X 배율로 관찰하였다.

식물의 측근 발달은 총 8 단계로 나누어지며 이는 구체적으로 측근 원기세포단계인 I-VII 단계와 측근 발생단계인 VIII 단계로 나누어진다. Pro _CRF2 :EGFP:GUS 형질전환 식물체의 경우 측근 원기세포 단계와 측근 발생단계 모두에서 GUS 발현이 보여지며, 이러한 발현은 측근 발달단계가 진행될수록 더욱 증가한다. 발달초기 내초 세포에서만 보이던 발현은 발달이 진행될수록 내피 세포, 내층 세포, 그리고 외피 세포에서까지 보여진다(도 3A). Pro _CRF3 :EGFP:GUS 형질전환 식물체의 경우 Pro _CRF2 :EGFP:GUS 형질전환 식물체와 유사하게 측근발달 모든 단계에서 GUS 발현이 보여지며 이러한 발현은 측근 발달단계가 진행될수록 더욱 증가한다. 이와 같은 GUS 발현은 CRF2와 CRF3가 측근 원기세포 발달과 측근 발생단계에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 의미한다(도 3B).

실시예 3: 야생형, crf2-2 , crf3-2 , crf3-3 , crf2-2 crf3-2 , crf2-2 crf3-3 기능 상실 돌연변이체, Pro _35S :4xHA:CRF2 , Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체의 표현형, 주근 길이, 측근 개수 분석.

CRF2와 CRF3의 생물학적 기능을 분석하기 위하여 야생형(Columbia-0)과 SAIL371_D04(crf2-2로 명명), SALK138253(crf3-2로 명명), SAIL325_H03(crf3-3으로 명명) 돌연변이체를 Arabidopsis Biological Resource Center로부터 획득하였다(도 4). crf2-2, crf3-2, crf3-3 돌연변이체 모두 엑손 부위에 T-DNA가 삽입되었음을 유전자형 분석과 RT-PCR 분석을 통하여 확인할 수 있었다. 동형접합체를 분리하고자 SAIL371_D04 경우, CRF2 F 5'-ATG GAA GCG GAG AAG AAA ATG G-3'와 CRF2 R 5'-TTA AAC AGC TAA AAG AGG ATC C-3' 유전자 특이적 프라이머 조합과 SAIL LB1 5'-GCC TTT TCA GAA ATG GAT AAA TAG CCT TGC TTC C-3' T-DNA 특이적 프라이머, CRF2 R 프라이머 조합을 사용하였고, SALK138253과 SAIL325_H03 경우, CRF3 F 5'-ATG GAC GAA TAT ATT GAT TTC C-3'와 CRF3 R 5'-TTA AGC AAC TAA TAG ATC TGA TAT C-3' 유전자 특이적 프라이머 조합과 SAIL LB1 5'-GCC TTT TCA GAA ATG GAT AAA TAG CCT TGC TTC C-3' T-DNA 특이적 프라이머, CRF3 F 프라이머 조합을 사용하였다. 또한 SAIL371_D04 경우, CRF2 700 seq 5'-CTT TCG CCG TCG ACG AAT TCT CC-3'와 CRF2 R 5'-TTA AAC AGC TAA AAG AGG ATC C-3' 프라이머 조합으로, SALK138253과 SAIL325_H03 경우 CRF3 F 5'-ATG GAC GAA TAT ATT GAT TTC C-3'와 CRF3 R 5'-TTA AGC AAC TAA TAG ATC TGA TAT C-3' 프라이머 조합으로 돌연변이체의 해당 유전자 발현이 사라졌음을 확인하였다. 또한 crf2-2와 crf3-2, crf2-2와 crf3-3을 각각 교배하여 이중 돌연변이체를 만들었다.

crf 단일 및 이중 돌연변이체 종자를 4℃에서 3일간 저온 처리 후 0.5×MS, 1.5 % 수크로스, 2.5 mM Mes, pH 5.7 그리고 0.8% 아가가 포함된 배지에 수직으로 파종하여 23℃, 16시간 광 조건에서 10일 키운 후 표현형을 살펴보았다. crf2-2, crf3-2, crf3-3, crf2-2 crf3-2, crf2-2 crf3-3 기능 상실 돌연변이체는 주근의 길이가 각각 3.12±0.06 (평균±표준오차) cm, 3.49±0.04 cm, 2.98±0.06 cm, 2.98±0.05 cm, 및 3.09±0.07 cm로 야생형 4.33±0.05 cm에 비해 상대적으로 각각 28％, 20％, 31％, 32％, 및 29％ 감소되었다. crf2-2, crf3-2, crf3-3, crf2-2 crf3-2, crf2-2 crf3-3 기능 상실 돌연변이체의 측근 개수는 각각 6.33±0.39, 5.97±0.22, 4.83±0.32, 3.93±0.25, 및 3.6±0.25로 야생형 8.77±0.31에 비해 상대적으로 28％, 32％, 45％, 56％, 및 59％ 감소되었고, 측근밀도 또한 crf2-2, crf3-2, crf3-3, crf2-2 crf3-2, crf2-2 crf3-3 기능 상실 돌연변이체는 2.09±0.14, 1.72±0.07, 1.66±0.12, 1.33±0.09, 및 1.19±0.09로 야생형 2.03±0.07에 비해 상대적으로 103.1％, 85％, 81％, 65％, 및 58％ 변화하였다 (도 5A-5C).

CRF2와 CRF3의 과다발현 표현형을 분석하기 위하여 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터와 CRF2 혹은 CRF3의 N-말단에 4개 연속으로 HA(hemagglutinin) 항원 tag이 융합된 Pro _35S :4xHA:CRF2와 Pro _35S :4xHA:CRF3 벡터를 제작(도 6)하여 애기장대 Col-0에 각각 형질전환을 수행하였다.

CRF2와 CRF3는 각각 엑손이 한 개이므로 지노믹 DNA 로부터 1032 bp와 1065 bp에 해당하는 유전자 부위를 Pfu DNA 중합효소와 프라이머 HA CRF2 F 5'-ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT GAA GCG GAG AAG AAA ATG-3'와 attB2 CRF2 R 5'-CAA GAA AGC TGG GTC TTA AAC AGC TAA AAG AGG-3', HA CRF3 F 5'-ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT GAC GAA TAT ATT GAT TTC-3'와 attB2 CRF3 R 5'-CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGC AAC TAA TAG ATC TG-3'를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이후 attB1 HA F 5'-ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TCC ATG TAC CCA TAC GAC GTC C-3'와 attB2 5'-ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG T-3' 이용하여 중합효소 PCR을 수행한 후 GatewayBP Clonase^TMII enzyme mix (Invitrogen)를 사용하여 pDONR221 벡터에 재조합 반응시켰다. GatewayLR Clonase^TMII enzyme mix (Invitrogen)를 사용하여 pGWB515 목적 벡터에 재조합 반응을 시켜 Pro _35S :4xHA:CRF2와 Pro _35S :4xHA:CRF3 발현 벡터를 제작하였다. 이를 애기장대 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움에 형질 전환 시킨 뒤 애기장대에 플로랄 딥(floral dip) 방법을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질 전환시킨 식물체는 종자를 받은 뒤 0.5X Murashige Skoog (MS), 30 mg/ml 하이그로마이신 배지에서 자라는 독립적인 개체를 선별한 뒤 흙에 옮겨 심은 뒤 키워서 각가 종자를 따로 받아 다시 같은 조성의 배지에 심었을 때 살아남는 것과 죽는 표현형이 3:1 비율로 나타나는 개체군을 확인하였고 궁극적으로 Pro _35S :4xHA:CRF2 형질전환 식물체는 10개, Pro _35S :4xHA:CRF3 형질전환 식물체는 12개의 동형접합 형질전환 식물체를 분리하였다. RT-PCR을 통하여 Pro _35S :4xHA:CRF2의 #10-2, #16-1, #18-1 라인이 높은 수준의 전사량을 보였으며, Pro _35S :4xHA:CRF3의 #1-5, #6-3, #13-1 라인이 높은 수준의 전사량을 가짐을 볼 수 있었다.

도 5A 조건과 같은 조건에서 과다발현 형질전환 식물체를 키운 후 표현형을 조사하였다. Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체의 주근 길이는 3.86±0.05 cm(#10-2), 3.71±0.04 cm(#16-1), 3.76±0.04 cm(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체의 주근 길이는 3.92±0.05 cm(#1-5), 3.93±0.07 cm(#6-3), 4.02±0.05 cm(#13-1)로 야생형 4.33±0.05 cm에 비해 상대적으로 Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체는 11％(#10-2), 15％(#16-1), 및 14％(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체는 10％(#1-5), 10％(#6-3), 및 7％(#13-1) 정도 야생형보다 주근의 길이가 짧아졌지만, 측근 개수는 Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체 경우 10.1±0.22(#10-2), 10.63±0.27(#16-1), 및 11.13±0.31(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체 경우 11.7±0.28(#1-5), 12.3±0.36(#6-3), 및 14.3±0.31(#13-1)로 야생형 8.77±0.31보다 상대적으로 Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체는 115％(#10-2), 121％(#16-1), 및 127％(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체는 133％(#1-5), 140％(#6-3), 및 120％(#13-1) 증가하였다. 측근 밀도 또한 Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체 경우 2.62±0.06(#10-2), 2.87±0.07(#16-1), 및 2.96±0.09(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체 경우 2.98±0.08(#1-5), 3.16±0.1(#6-3), 및 3.57±0.1(#13-1)로 야생형 2.03±0.07 보다 상대적으로 Pro _35S :4xHA:CRF2 과다발현 형질전환 식물체는 129％(#10-2), 141％(#16-1), 및 145％(#18-1), Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 형질전환 식물체는 146％(#1-5), 155％(#6-3), 및 176％(#13-1) 증가하였다(도 5D-5F). 이와 같은 결과를 통하여 CRF2와 CRF3가 뿌리 발달과 측근 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 측근 원기 발달 단계별 야생형, crf2-2 , crf3-2 , crf2-2 crf3-2 기능 상실 돌연변이체, Pro _35S :4xHA:CRF2 , Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 식물체의 측근 원기 밀도 분석

측근 발달 단계에 CRF2와 CRF3가 미치는 영향을 알아보기 위해 야생형, crf2-2, crf3-2, crf2-2 crf3-2 기능 상실 돌연변이체, Pro _35S :4xHA:CRF2, Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 식물체 측근 원기의 밀도를 분석해 보았다. 종자를 4℃에서 3일간 저온 처리 후 0.5×MS, 1.5 % 수크로스, 2.5 mM Mes, pH 5.7 그리고 0.8% 아가가 포함된 배지에 수직으로 파종하여 23℃, 16시간 광 조건에서 10일 키운 후 Leica DM2500 현미경을 사용하여 200-400 배율로 표현형을 관찰하였다.

crf2-2 단일 돌연변이체의 전체적인 측근 원기의 밀도는 야생형과 유사하였다. 그러나 crf3-2 단일 돌연변이체 및 crf2-2 crf3-2 이중 돌연변이체의 전체적인 측근 원기의 밀도는 각각 2.29±0.16 와 1.95±0.15로 야생형 2.56±0.15에 비해 상대적으로 11％ 와 25％ 감소하였고, Pro _35S :4xHA:CRF2와 Pro _35S :4xHA:CRF3 과다발현 식물체 측근 원기의 밀도는 각각 3.07±0.08(#16-1), 3.3±0.16(#18-1), 2.93±0.12(#6-3), 및 3.2±0.23(#13-1)으로 야생형에 비해 상대적으로 119％(#16-1), 127％(#18-1), 114％(#6-3), 및 123％(#13-1)로 증가하였다. 이와 같은 결과를 통해 CRF2와 CRF3가 측근발달의 시작단계에서 작용함을 알 수 있었다(도 7).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, CHONNAM UNIVERSITY <120> Gene Implicated in Root Development and Plants Transformed with the Same <130> PN140475 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> CRF2 amino acid <400> 1 Met Glu Ala Glu Lys Lys Met Val Leu Pro Arg Ile Lys Phe Thr Glu 1 5 10 15 His Lys Thr Asn Thr Thr Thr Ile Val Ser Glu Leu Thr Asn Thr His 20 25 30 Gln Thr Arg Ile Leu Arg Ile Ser Val Thr Asp Pro Asp Ala Thr Asp 35 40 45 Ser Ser Ser Asp Asp Glu Glu Glu Glu His Gln Arg Phe Val Ser Lys 50 55 60 Arg Arg Arg Val Lys Lys Phe Val Asn Glu Val Tyr Leu Asp Ser Gly 65 70 75 80 Ala Val Val Thr Gly Ser Cys Gly Gln Met Glu Ser Lys Lys Arg Gln 85 90 95 Lys Arg Ala Val Lys Ser Glu Ser Thr Val Ser Pro Val Val Ser Ala 100 105 110 Thr Thr Thr Thr Thr Gly Glu Lys Lys Phe Arg Gly Val Arg Gln Arg 115 120 125 Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Leu Lys Arg Val 130 135 140 Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Met Val 145 150 155 160 Tyr Asp Asn Ala Ala Ile Gln Leu Arg Gly Pro Asp Ala Leu Thr Asn 165 170 175 Phe Ser Val Thr Pro Thr Thr Ala Thr Glu Lys Lys Ala Pro Pro Pro 180 185 190 Ser Pro Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn Lys Ser Lys Lys Ser 195 200 205 Val Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Ser Asn Asp Cys Leu 210 215 220 Cys Ser Pro Val Ser Val Leu Arg Ser Pro Phe Ala Val Asp Glu Phe 225 230 235 240 Ser Gly Ile Ser Ser Ser Pro Val Ala Ala Val Val Val Lys Glu Glu 245 250 255 Pro Ser Met Thr Thr Val Ser Glu Thr Phe Ser Asp Phe Ser Ala Pro 260 265 270 Leu Phe Ser Asp Asp Asp Val Phe Asp Phe Arg Ser Ser Val Val Pro 275 280 285 Asp Tyr Leu Gly Gly Asp Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Thr Ala Asp 290 295 300 Met Cys Thr Asp Met Asn Phe Gly Phe Asp Phe Gly Ser Gly Leu Ser 305 310 315 320 Ser Trp His Met Glu Asp His Phe Gln Asp Ile Gly Asp Leu Phe Gly 325 330 335 Ser Asp Pro Leu Leu Ala Val 340 <210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> CRF3 amino acid <400> 2 Met Asp Glu Tyr Ile Asp Phe Arg Pro Leu Lys Tyr Thr Glu His Lys 1 5 10 15 Thr Ser Met Thr Lys Tyr Thr Lys Lys Ser Ser Glu Lys Leu Ser Gly 20 25 30 Gly Lys Ser Leu Lys Lys Val Ser Ile Cys Tyr Thr Asp Pro Asp Ala 35 40 45 Thr Asp Ser Ser Ser Asp Glu Asp Glu Glu Asp Phe Leu Phe Pro Arg 50 55 60 Arg Arg Val Lys Arg Phe Val Asn Glu Ile Thr Val Glu Pro Ser Cys 65 70 75 80 Asn Asn Val Val Thr Gly Val Ser Met Lys Asp Arg Lys Arg Leu Ser 85 90 95 Ser Ser Ser Asp Glu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Ser Arg Gln Arg Pro 100 105 110 Asn Asn Lys Val Ser Val Ser Gly Gln Ile Lys Lys Phe Arg Gly Val 115 120 125 Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Glu 130 135 140 Gln Arg Arg Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Glu Ala 145 150 155 160 Ala Val Val Tyr Asp Asn Ala Ala Ile Arg Leu Arg Gly Pro Asp Ala 165 170 175 Leu Thr Asn Phe Ser Ile Pro Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Pro Glu Pro Val Ile Glu Glu Lys Pro Val Ile Met Thr Thr Pro Thr 195 200 205 Pro Thr Thr Ser Ser Ser Glu Ser Thr Glu Glu Asp Leu Gln His Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Thr Ser Val Leu Asn His Arg Ser Glu Glu Ile Gln Gln 225 230 235 240 Val Gln Gln Pro Phe Lys Ser Ala Lys Pro Glu Pro Gly Val Ser Asn 245 250 255 Ala Pro Trp Trp His Thr Gly Phe Asn Thr Gly Leu Gly Glu Ser Asp 260 265 270 Asp Ser Phe Pro Leu Asp Thr Pro Phe Leu Asp Asn Tyr Phe Asn Glu 275 280 285 Ser Pro Pro Glu Met Ser Ile Phe Asp Gln Pro Met Asp Gln Ile Phe 290 295 300 Cys Glu Asn Asp Asp Ile Phe Asn Asp Met Leu Phe Leu Gly Gly Glu 305 310 315 320 Thr Met Asn Ile Glu Asp Glu Leu Thr Ser Ser Ser Ile Lys Asp Met 325 330 335 Gly Ser Thr Phe Ser Asp Phe Asp Asp Ser Leu Ile Ser Asp Leu Leu 340 345 350 Val Ala <210> 3 <211> 1032 <212> DNA <213> CRF2 nucleotide <400> 3 atggaagcgg agaagaaaat ggttctaccg agaatcaaat tcacagagca caaaaccaac 60 acgacaacaa tcgtatcgga gttaaccaac actcaccaaa ccaggattct tcgtatctca 120 gtcactgacc cagacgctac tgattcctcc agtgacgacg aagaagaaga acatcaacgc 180 tttgtctcta aacgccgtcg tgttaagaag tttgtcaacg aagtctatct cgattccggt 240 gctgttgtta ctggtagttg tggtcaaatg gagtcgaaga 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gatcaaattt tctgtgaaaa tgatgatatc ttcaatgata tgttgttctt gggtggtgaa 960 actatgaaca ttgaagatga gttaacaagt tctagtatca aagatatggg ttcaacgttt 1020 agtgattttg atgattcatt gatatcagat ctattagttg cttaa 1065 <210> 5 <211> 2005 <212> DNA <213> CRF2 promoter <400> 5 tacaaagtgt tacccgatcg tgtcaaaatc aaaaacattt caatcatgat taggaaactt 60 aactcaacca tacgttacat aggaaagtag atgctgcata gttgaccatt ggtcaaagtg 120 tttaacactt ttaaagattt ttaacttaat agagaaagta aatttttatt ctctaattaa 180 ttagaaatgc caaatatgct tgtctttaaa aattgtcagt aaattaaagt cactctgtta 240 ttatacattt tatagtcaca taaaatctgc aagcaaataa cagaaaatta tcaagtactc 300 ctaatcataa ttaagaagta gtaatacaat gattccaaaa aaaattactg tacttttttt 360 taatgtgtgt gtgtggcgca acgtcctaga ttgttgtctg ccacgttagc cagcaccagc 420 tgtaataact aaaaagtggc aaggttatga ctggtaaagg ttaaaacagt aaagaactac 480 gagccgtaac ggtctcttgt ctttcttctt tttcacaacg caacttgctt aggtgaaagt 540 acgatactat ccctgtggtg aaaaagagaa cttcgcacgg aggttatgag attaatcacc 600 tgctgttaat tataaattat tggttctggt caaaagtaag actggaccgt gtctccggtg 660 tcacgtgacc tgaatctcca attacgagga aattttaaaa aatgattata gaagtaatta 720 gtattagtaa tacatatgtt tttctctttg tcagctgccc catggaaagg cacgtcccag 780 ccgttggatt ggacccaatt ctgtaattac acgtgtcgat atctcaatcg tttgacttat 840 gcggcatttt ggttttgcca agctcgtttt ttccggctat aattagtttt tgctaaaaat 900 cagtcaaaaa ttaagatttc attctaattt taaaaagaca aatttccttg gtcggcacta 960 atatctaatt atcgaccatt aatgtcatga ttcttatttg cgttacaata attactgtcg 1020 acacttgttg tagttcttag tttttgtttt ttatctagtt ttgtctctaa atttcaattt 1080 caattaagtg tacatttgga ctgtaacaag catagttttg acaattgtct ttcattcatt 1140 tcatcatttg acatcaccaa tgaaaagtta aaaatctctt aacactaatt atgaaatgtc 1200 tttcatattc ttgtacatat atataaaaca ctaaactcaa agtgtttagc aaataaaaaa 1260 gaatttagat acaaatgaat cttgtccacc tcccttaaac agaaagaaat atctttgtca 1320 aaagtttttt ttataagata ttcgaaaatt aaattaaata ccaaaaaaga aagaaaggag 1380 taaacactaa taatatgaga cgtttcaaag atcctataaa atagtcactc tctaccatta 1440 catgtgctct gccgctttta aatctctcat cttcttcctc gtgtcactct ttctctcaca 1500 ctctgcaaaa acattttctt gtctctcctc tgcccaaatt ttttttcttt ccaggaatat 1560 ttcctagaaa aacccaagca aagctttaac cccttcctcc tccaaaagta gcatcttcct 1620 ctttttctat ttctcctttc ctcttcttat ctctctctcg tttgtgaacg attccttaag 1680 aatataacca aaagcccttt tctcctttct tcaactttcc gggaaaaatc ttcacgcagc 1740 aaggtttctc tctcggctct cgcagtgttt ttcgtgcctt ttgttctttc tataaaaaaa 1800 aaattcgcgt cctttaagaa aactttttcc acctagagaa gaagaagagt atcactcttg 1860 ttgttcaagt ttctctcttt aataaaaaat ccatctttat tctttgtctt ctttcctttt 1920 tgctttccct aatctctatg ttataaacac acagagagaa acaaagtcac agtctcgagt 1980 caaaaacaga gaatacgaaa gaaaa 2005 <210> 6 <211> 2021 <212> DNA <213> CRF3 promoter <400> 6 cggctttcaa caaattgatc aagatgagtt caaagacagt ttatcaaaac agattagctg 60 caagagatag tcttttgcag aatgcttcat aaagtttgta acggattagc agcaagagat 120 agtcttttgc agattgcttc ataaagtttg taacaggttg gtatgaagat gttattatgt 180 tctaaatcat gcatctatgt taatttagac cagttttgtt tttggcttaa ctgtctttaa 240 ctctttaata tatgtacatg catagagttt gtgttttgtg tttaagttat atgtatgtaa 300 actagctttt aatttgacac attttctcta tcaaatgtac atggtttatg tttattgagc 360 aacaaaaagt cttttacatc ttcaagttat ttaaatgttc ctatttaata tatcagaaat 420 gtaacatcac atatttccga gaaaaaaacg attctaaatt acactattta tgaactagag 480 agagtaaaat ttaaaattaa aatggctact taattaaaat acaatcataa ttttttttat 540 ttaaaaagca agtatatcat atcttggttt acaataacat aatttcaaat ctcattgcca 600 tccaaacaga aaaataattt ttttactagt ccaaaaaatt aggaacagat gtagtaagct 660 ttgatatccc taaacccaag taaaaacccc aacaaaaaga tattagtaga agattgtttt 720 tacaacaaat caaaaatata gttttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaagatac ttgagaagcg 780 cgtggaaagt acgaatagca agcagtggtg gaagagcgag tgagggaaca aagagtacag 840 aaaaaagcct agagacgtac cacaccaccg aattataaat ggcggcaaat cctaggttgc 900 tcgccacgtt acttctagct gtaaaatggt aacatttcaa tttaactacc atatttatat 960 tgattcaaag atattttcgt cctaaaatca ttttaatatc taaaattaaa tacataactt 1020 cctcagtcac atattcatct tccctaaatt aacattattc gattatctaa catggaaaaa 1080 tgtatattgt ataatacaac gtattcaact ttgacaaaat cgcatttatt ttatttccct 1140 aacagttaaa aaatcgcatt tattttatta ccctcaacat tcgtacgtga caagttgaaa 1200 aattgcattc aaatagacga agttaccctc aacaatcatc attaattact taatgtcggt 1260 caaagctagt ggagtgataa aaaatttgtt gagaagtagt aagtaaattt gtttttatta 1320 ttagtatcaa ataaactaaa aaggtaaaaa aaaatttaaa aaaaccggga ccgggtatct 1380 tgggggtcac gtgacatgaa tcgcgaaatt cgagactaga agccacgcgc tgactcagca 1440 catacaggaa ggagccaaat atctaatatc gccacgtgtc accatgcgac ttgcgctcat 1500 gaatgcggcg tcccgtattt ttaaacaact ctcttatacc cgaaactacc cttggagttt 1560 tgtagttaat tacggaaaaa tgccactgat ggaggagcgg aaagaaacag cttcgacaag 1620 gaaagaaatc aaatgatatt aaatattata tattatatag ttttcgaatt tattgtttac 1680 ttttgtaaaa atgaataaaa taattatggc taaaaccccg aagagatcct ataaattagc 1740 atttcaagag tgagctagag aaggtctcca cttgcgaatc gctaaaaaaa atcactgttt 1800 cataacacgt ttttctctct cacccaccaa aaaaaaatct tttgttcttg ttaccaaaaa 1860 atctcgtgat aaatctcttc aaactttgtt ttattttctt cttgattctc tcgaaatctc 1920 tctcaacaaa cccagaaact ttccttgatt cgcaagcttt tcttcctttt atattcttca 1980 ttttgatgcg aatatagaga gagtccataa aagaaacagt a 2021 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> attB1 CRF2 proF <400> 7 aaaaaagcag gctcctacaa agtgttaccc gatcgtgtc 39 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> attB2 CRF2 proR <400> 8 caagaaagct gggtcttttc tttcgtattc tctgtttttg 40 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> attB1 CRF3 proF <400> 9 aaaaaagcag gctcccggct ttcaacaaat tgatcaagat g 41 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> attB2 CRF3 proR <400> 10 caagaaagct gggtctactg tttcttttat ggactctctc 40 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> attB1 <400> 11 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> attB2 <400> 12 accactttgt acaagaaagc tgggt 25 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> CRF2 F <400> 13 atggaagcgg agaagaaaat gg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> CRF2 R <400> 14 ttaaacagct aaaagaggat cc 22 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> SAIL LB1 <400> 15 gccttttcag aaatggataa atagccttgc ttcc 34 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> CRF3 F <400> 16 atggacgaat atattgattt cc 22 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> CRF3 R <400> 17 ttaagcaact aatagatctg atatc 25 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> CRF2 700 <400> 18 ctttcgccgt cgacgaattc tcc 23 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> CRF3 F <400> 19 atggacgaat atattgattt cc 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> CRF3 R <400> 20 ttaagcaact aatagatctg atatc 25 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> HA CRF2 F <400> 21 atgtacccat acgacgtccc agactacgct gaagcggaga agaaaatg 48 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> attB2 CRF2 R <400> 22 caagaaagct gggtcttaaa cagctaaaag agg 33 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> HA CRF3 F <400> 23 atgtacccat acgacgtccc agactacgct gacgaatata ttgatttc 48 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> attB2 CRF3 R <400> 24 caagaaagct gggtcttaag caactaatag atctg 35 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> attB1 HA F <400> 25 acaagtttgt acaaaaaagc aggctccatg tacccatacg acgtcc 46

Claims (8)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 측근 개수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 뿌리 발달 촉진용 조성물.
   
4. (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 뿌리 발달 촉진용 조성물.
   
5. 제 4 항의 조성물로 형질전환된 식물세포.
   
6. 제 4 항의 조성물로 형질전환된 식물체.
   
7. 제 4 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 뿌리 발달을 조절하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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