KR101053038B1 - 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 이를암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도를 개시한다. 구체적으로 본 발명은 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법, 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법, 그 방법에 의하여 얻어진 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물, 및 개화 식물의 개화를 억제하는 방법을 개시한다.

조기 개화, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드

Description

조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도{Polypeptide Having a Function Controling Early Flowering, Polynucleotide Coding the Polypeptide and Their Use}

도 1은 조기 개화 표현형을 지니는 애기장대 형질전환체 게놈 내로 삽입될 액티베이션 태깅 벡터 pSKI015의 모식도이다.

E : 인핸서(enhancer)

BAR : 바스타 제초제 저항성 유전자

pBS(AmpR) : E. coli 복제 기원(replication origin)과 앰피실린 저항성 유전자를 가지고 있는 부위

도 2는 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))과 조기 개화 애기장대 형질전환체(9ax2)의 장일 조건 하에서의 개화시기를 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))과 조기 개화 애기장대 형질전환체(9ax2)에서 본 발명의 조기 개화 조절 기능을 가지는 유전자의 발현을 노던 블럿 분석으로 검출한 결과이다.

도 4a는 pCV1300::9AX2 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대에서 본 발명의 조기 개화 조절 기능을 가지는 유전자의 과발현을 노던 블럿으로 확인한 결과이다.

도 4b는 본 발명의 조기 개화 조절 기능을 가지는 유전자가 포함된 재조합 벡터 pCsV1300::9AX2로 형질전환 애기장대와 본 발명의 조기 개화 조절 유전자가 포함되지 않는 벡터 pCsV1300로 형질전환된 대조군 애기장대의 개화 시기를 비교하여 보여주기 위한 사진이다.

pCsV1300: pCsV1300로 형질전환된 대조군 애기장대

pCsV1300::9AX2: pCsV1300::9AX2로 형질전환 애기장대

본 발명은 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도에 관한 것이다.

식물에 있어 개화시기는 온도 및/또는 일장에 따라 크게 좌우되는데, 이러한 개화 시기는 근원적으로 몇 개의 유전자의 조절 하에 놓여있다고 보고 되고 있다(Yaron Y. Levy and Caroline Dean(1998) The Plant Cell, 10: 1973-1989).

현재까지 식물의 개화시기에 영향을 미치는 다양한 종류의 돌연변이체, 유전자 또는 개화 조절 경로가 여러 연구를 통해 규명되었는데, 그 중 장일 조건에서 개화가 촉진되는 장일 식물인 애기장대에서 세 가지의 개화 조절 경로가 존재함이 밝혀졌다. 첫 번째 경로는 일장의 길이에 관계없이 개화를 조절하는 자동화 경로(autonomous pathway)로서, 이에 관여하는 유전자로 LD, PGM1, FY, FCA, FPA, FLD 등이 규명되었다(Chentao Lin, Plant Physiology, 123: 39-50, 2000). 두 번째 경로는 일장의 길이를 감지하여 개화를 조절하는 경로(photoperiodic pathway) 로서, ELF3, CAM1, GI, CO, FWA, FT, FE 등의 유전자가 이 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Yaron Y. Levy and Caroline Dean(1998), The Plant Cell, 10: 1973-1989). 마지막 경로는 온도에 의한 개화조절 경로(vernalization pathway)로서, 식물이 일정기간 저온에 노출되었을 때 개화가 촉진되는 경로이며, 이에 관련된 유전자로서 VRN1, VRN2, FRI, FLC 등의 유전자가 분리되었다.

한편, 경작 식물에 있어서 개화 시기는 중요한 의미를 갖는다. 그것은 개화 시기를 조절함으로써 수확 시기를 조절하는 것이 가능해지기 때문이다. 개화 시기를 조절할 수 있다면 원하는 시기에 수확하는 것이 가능해진다. 이러한 이유에서 식물 생물공학 분야의 종사자들은 유전자 조작의 방법으로 개화 시기를 조절하기 위해 노력하고 있다.

본 발명은 이러한 배경하에서 완성된 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생성 방법에 의하여 얻어진 조기 개화의 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 개화 식물의 개화를 억제하는 방법을 제공하는데 있다.

기타의 본 발명의 목적(들)은 하기 발명의 구성 등에서 구체화 될 것이다.

본 발명은 일 측면에 있어 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드에 대한 것이다.

본 발명자(들)는 하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 특정 유전자를 평소 발현 양보다 과발현시키는 활성 태깅 방법(Activation Tagging Method; Weigel et al., (2000) Plant Physiology, Vol 122 1003-1013; 그 내용은 하기 실시예를 포함한 본 명세서 포함되는 것으로 간주된다)을 이용하여 조기 개화 표현형을 보이는 애기장대 형질전환체를 제작·선발하고, TAIL PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR) 방법(Liu YG et al., Plant J. (1995) 8: 457-463; 그 내용은 하기 실시예를 포함한 본 명세서 포함되는 것으로 간주된다)으로 상기 애기장대 형질전환체에서 조기 개화에 관여하는 유전자를 클로닝하여 서열번호 1에 개시된 그 유전자의 염기 서열과 서열번호 2에 개시된 그 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 확인하였고, 상기 형질전환체에 보여지는 조기 개화 표현형이 상기 유전자의 과 발현의 효과인지를 노던 블럿으로 확인하였으며, 마지막으로 상기 유전자를 과발현시키는 재조합 벡터로 도입된 애기장대 형질전환체가 상기 활성 태깅 방법으로 형질전환된 애기장대 형질전환체의 표현형과 동일하게 조기 개화 표현형을 나타냄을 확인할 수 있었다.

그러므로 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서 상기 "조기 개화 조절 기능"이란 상기 폴리펩티드 또는 그것을 암호화하는 후술하는 폴리뉴클레오티드가 애기장대를 포함하는 식물에서 과발현되었을 때 그 식물이 조기 개화 표현형을 나타내도록 하는데 관여하는 기능을 의미하는 것으로서 정의된다. 더 바람직하게는 조기 개화 유도 기능으로 정의될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드는 구체적으로 하기의 폴리펩티드들 중의 하나이다.

(a) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;

(b) 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드;

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 비교하였을 때 여전히 조기 개화 조절 기능을 보유한다고 보기에 충분한 정도의 서열번호 2의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로서 정의된다. 여전히 조기 개화 조절 기능을 보유한다면 충분하므로, 상기 폴리펩티드의 길이 그리고 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성의 정도는 특별히 문제되지는 않는다. 즉 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 활성이 낮더라도, 여전히 조기 개화 조절 기능을 보유하는 폴리펩티드라면 그 길이야 어떻든 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"에 포함된다는 것이다. 통상의 당업자라면, 즉 본 출원시를 기준으로 공지된 관련 선행기술을 평균적으로 숙지하고 있는 자라면, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 일부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 여전히 조기 개화 조절 기능을 가질 것이라고 기대할 것이다. 그러한 폴리펩티드로서 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드를 들 수 있다. 그것은 일반적으로 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가진다고 당업계에 공지되어 있기 때문이다. 물론 경우에 따라서는, N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 조기 개화 조절 기능에 필수적인 모티프에 관여함으로써 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드가 상기 기능을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만, 그럼에도 그러한 비활성의 폴리펩티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다. 나아가 N-말단 부분 또는 C-말단 부분 뿐만 아니라 그 이외의 다른 부분이 결실되더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 가질 수 있다. 여기서도 당업자라면 그의 통상의 능력의 범위 내에서 이러한 결실된 폴리펩티드가 여전히 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가지는가를 충분히 확인할 수 있을 것 이다. 특히 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 나아가 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자가 과발현되었을 때 해당 식물이 조기 개화 표현형을 보이는지를 분명히 확인한 실시예를 개시하고 있다는 점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실된 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것인가를 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 충분히 확인할 수 있다는 것이 매우 자명해진다. 그러므로 본 발명에 있어서 상기 "서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 상기 정의와 같이 본 명세서의 개시 내용에 기초하여 당업자가 그의 통상의 능력 범위 내에서 제조 가능한 조기 개화 조절 기능을 가지는 결실된 형태의 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

또한 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"란 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하지만, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능, 즉 조기 개화 조절 기능을 여전히 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 여기서도 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 조기 개화 조절 기능을 여전히 보유하기만 한다면 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성의 정도나 아미노산이 치환된 비율은 문제되지 않는다. 바꿔 얘기해서, 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 그 활성이 아무리 낮더라도 또 많은 수의 치환된 아미노산을 포함하고 있다고 하더라도 그러 한 폴리펩티드가 조기 개화 조절 기능을 보유하기만 한다면 본 발명에 포함된다는 것이다. 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환되기 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가라면, 그러한 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 여전히 본래의 폴리펩티드의 기능을 보유할 것이다. 예컨대, 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성의 아미노산, 예를 들면 글리신, 또는 보다 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드는 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 마찬가지로, 음으로 하전된 아미노산 예컨대, 글루탐산이 다른 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 아스파르산으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드도 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이며, 또한 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌이 다른 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 리신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드 또한 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 또한 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 치환된 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 당업자라면, 그 전술한 바의 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 조기 개화 조절 기능을 여전히 보유하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한 당업자라면 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 여전히 위 기능을 가지는가를 확인할 수 있다. 더구나 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서 열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 또한 나아가 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자가 과발현되었을 때 해당 식물이 조기 개화 표현형을 보이는지를 분명히 확인한 실시예를 개시하고 있기 때문에, 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 당업자에게 용이하게 실시 가능한 것임이 분명하다. 그러므로 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 조기 개화 조절 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

이처럼 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 조기 개화 조절 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이지만, 그럼에도 활성의 정도라는 관점에서 봤을 때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 서열 상동성의 하한에 있어서 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직한 반면, 서열 상동성의 상한에 있어서는 당연히 100%의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직하다.

보다 더 구체적으로 위 서열 상동성은 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 98.9 %의 순서대로 높아질수록 바람직하다. 여기서 98.9%의 서열 상동성은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 하나의 아미노산이 치환된 경우이다.

그리고 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 '서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드' 뿐만 아니라 '서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'를 포함하므로 전술한 바의 모든 설명은 '서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'에 대해서 뿐만 아니라 '서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'에 대해서도 적용되는 것으로 간주 되어진다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 여기서 "전술한 바의 폴리펩티드"란 조기 개화 조절 기능을 지니면서 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, 및 위 폴리펩티드들과 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 전술한 바의 바람직한 양태의 모든 폴리펩티드들을 포함하는 의미이다. 그러므로 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 조기 개화 조절 기능을 지니면서, 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리펩티드들에 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 암호화화는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 나아가 바람직한 양태로서 조기 개화 조절 기능을 지니면서 전술한 바의 서열 상동성의 순서대로 그 서 열 상동성을 지니는 모든 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아미노산 서열이 밝혀졌을 때, 그러한 아미노산 서열에 기초하여 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 당업자라면 용이하게 제조할 수 있다.

그럼에도 여전히 활성의 측면에 봤을 때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 것이 바람직하고, 서열번호 1의 염기 서열 전체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기서 "서열번호 1의 염기 서열의 일부분"이란 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 기능, 즉, 조기 개화 조절 기능을 여전히 보유하기에 충분한 길이의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 여기서도 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 기능을 보유하기만 한다면 그 활성이 본래의 폴리펩티드, 즉, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 가지는 활성에 비하여 낮더라도 문제되지 않는다.

한편, 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 청구범위를 포함하는 이하에서, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드, 생물체 특히 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 분리된 폴리뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 함유한 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 중합체를 모두 포함하는 것으로서 정의된다. 그러므로 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"란 cDNA를 포함하여 뉴클레오티드들을 화학적으로 중합시킨 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 나아가 생물체 특히 애기장대에서 분리되는 gDNA를 포함한다. 여기서, 본 명세서가 개시하고 있는 서열번호 2의 아미노산 서열, 이를 코딩하는 서열번호 1의 염기서열, 및 당업계에 공지된 기술 등에 기초하는 한, cDNA를 포함하여 상기 화학적 합성되는 폴리뉴클레오티드의 제조 및 상기 gDNA의 분리 등은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속할 것이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 일부분에 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 여기서 상기 "서열번호 1의 염기 서열의 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드"란 애기장대를 포함하는 개화 식물에서 조기 개화 조절 기능을 가지는 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 길이의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말하며, 또 상기 "서열번호 1의 염기서열의 일부분에 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 염기서열의 일부분과 비교하여 하나 이상의 치환된 뉴클레오티드를 포함하면서도 애기장대를 포함하는 개화 식물에서 조기 개화 조절 기능을 가지는 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 정도의 서열 의존적 결합력을 지니는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

당업자는 애기장대나 다른 식물에서 본 명세서가 개시하고 있는 서열번호 1의 염기 서열에 기초하여 이를 이용하는 한, 그의 통상의 능력 범위내에서 애기장대나 다른 개화 식물로부터 조기 개화 조절 기능을 기닌 유전자를 동정 및/또는 단리할 수 있다.

그러므로 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 길이에 상관 없이 또는 그 폴리뉴클레오티드의 서열번호 1의 염기 서열과의 서열 상동성의 정도와 상관없이 애기장대나 다른 개화 식물로부터 조기 개화 조절 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 서열 길이 및/또는 서열 의존적 결합력을 지니는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일반적으로 기능이 공지된 유전자의 염기 서열을 미지의 유전자의 염기 서열과 비교하여 그 미지의 유전자가 대비된 공지의 유전자와 동일한 기능을 가지는 것으로 추정하기 위해서, 그리고 미지의 유전자를 단리하기 위한 프로브로서 사용되기 위해서는 30개 이상의 연속되는 뉴클레오티드 서열이 필요하다고 알려져 있다. 그러므로 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에 개시된 염기 서열에서 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 그럼에도 여전히 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리(또는 올리고)뉴클레오티드를 포함한다. 그것은 서열번호 1에 개시된 염기 서열과 100%의 서열 상동성을 지니거나 동정 및/또는 단리 조건(버퍼의 pH나 농도 등)이 엄격하다면 애기장대나 다른 개화 식물로부터 조기 개화 조절 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분할 수 있기 때문이다. 여기서 애기장대나 다른 개화 식물로부터 조기 개화 조절 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리하기에 충분한 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제작·검출해내는 것, 그러한 폴리뉴클레오티드를 이용하여 애기장대나 다른 개화 식물로부터 조기 개화 조절 기능을 지닌 유전자를 동정 및/또는 단리해내는 것은 통상의 당업자의 능력 범위 내에 속한다.

한편, 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "개화 식물"이 란 개화를 통하여 번식하는 식물로서 정의될 수 있으며, 그러한 식물로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류, 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류 등을 들 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 뉴클레오티드에 대한 것이다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 전술한 바의 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하여 전사(transcription)(폴리뉴클레오티드가 DNA인 경우) 또는 번역(translation)(폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우)을 저해할 수 있는 모든 폴리(또는 올리고)뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 안티센스 뉴클레오티드는 전술한 바의 조기 개화 조절 기능을 지니는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합하여 전사(transcription)(폴리뉴클레오티드가 DNA인 경우) 또는 번역(translation)(폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우)을 저해할 수 있다면, 그 길이라든지 그 상보적인 서열 상동성이 특별히 문제되는 것은 아니다. 짧은 길이, 예컨 대 30개 뉴클레오티드 정도의 폴리뉴클레오티드라고 하더라도 그것의 해당 유전자(DNA 및 RNA 포함)에 100%의 상보적인 서열 상동성을 지니고 기타의 조건 예컨대 농도나 pH 등이 적절하게 갖추어진다면 안티센스 뉴클레오티드로서 작용할 수 있다. 또 서열에 있어서도 그것의 해당 유전자와 100%의 상보적인 서열 상동성을 지니지 않더라도 적당한 크기의 길이를 갖는다면 마찬가지로 안티센스 뉴클레오티드로서 작용할 수 있다. 그러므로 안티센스 뉴클레오티드의 길이, 상보적인 서열 상동성의 정도에 상관없이 안티센스 뉴클레오티드로서 작용할 수 있다면, 즉 해당 유전자의 전사 또는 번역을 저해할 수 있는 능력을 보유하고 있다면, 모두 본 발명의 안티센스 뉴클레오티드에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 여기서 안티센스 뉴클레오티드로서 필요한 길이의 결정, 해당 유전자와 상보적인 서열 상동성의 정도, 그리고 그러한 안티센스 뉴클레오티드의 제조 방법 등은 본 명세서가 개시하고 있는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 2의 아미노산 서열 및 당업계에 공지된 기술에 기초하는 한 모두 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속할 것이다.

한편, 바람직하게는, 상기 안티센스 뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열의 일부분에 상보적인 부분을 포함하는 안티센스 뉴클레오티드가 바람직할 것이다. 여기서 "서열번호 1의 염기서열의 일부분에 상보적인 부분"이란 이미 전술한 바를 고려한다면, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DNA 또는 그것으로부터 전사된 RNA와 상보적으로 결합하여 그 전사 또는 번역을 방해하기 충분한 길이를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법에 대한 것이다.

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "개화 식물"의 정의 앞서 정의된 바와 같다.

한편, 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법은 두가지의 양태로서 파악될 수 있다.

첫번째 양태로서, 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법은, 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개화 식물 내로 도입시켜 형질전환 식물을 만드는 제 1단계, 및 상기 형질전환 식물에서 상기 폴리뉴클레오티드의 과발현을 유도하는 제 2단계를 포함한다.

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "과발현"이란 발현량이 인위적인 조작이 없는 개화 식물에서 일반적으로 발현되는 정도를 넘어서는 경우로서 정의된다. 바람직하게는, 발현량이 인위적인 조작이 없는 개화 식물에서 일반적으로 발현되는 정도를 넘어서는 경우로서, 그러한 인위적인 조작이 없는 개화 식물에서 나타나는 개화 시기보다 빨라지는 개화 시기를 보이는 모든 경우를 포함하는 의미로서 정의된다.

또한 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "폴리뉴클레오티드"는 전술한 바의 본 발명의 폴리뉴클레오티드로서 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의미이다. 그러하기 때문에 상기 폴리뉴클레오티드는 상기에서 바람직한 양태로서 언급된 폴리뉴클레오 티드를 모두 포함하는 것으로서 이해되어야 한다. 그럼에도 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드인 경우이고, 더 바람직하게는 서열번호 1에 개시된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 경우이다.

또한 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "식물"이란 성숙한 식물 뿐만 아니라 성숙한 식물로서 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직, 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.

또한 상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "형질전환"이란 왜래성 폴리뉴클레오티드(본 발명에서는 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미함; 이하 같음)가 도입됨에 의한 숙주 식물의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 식물, 더 정확하게는 숙주 식물의 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 식물내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물의 게놈내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

한편, 외래성 폴리뉴클레오티드로 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, Academic Press; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다)을 사용할 수 있다.

왜래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운 반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton 등, 1977, Cell 11:263:271; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 직접 왜래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz 등, 1985, Mol. Genet. 199:178-182; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다).

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 왜래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다. 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

한편, 상기에서 형질전환 식물을 만드는 제 1단계는, 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 및 이러한 재조합 벡터를 개화 식물에 도입하여 형질전환 식물을 만드는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.

더 바람직하게는 상기 제 1단계는, 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계, 이러한 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계, 및 이러한 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 개화 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직 하다. 특히, 상기 형질전환된 아그로박테리움 박테리아는 형질전환된 아그로박테리움 투메페이시언스인 것이 바람직하다.

상기 "조절 뉴클레오티드 서열"이란 그 존재가 그에 연결된 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 모든 서열을 포함하는 의미로서 이해된다. 이러한 조절 뉴클레오티드 서열은 리더 서열, 인핸서 서열, 프로모터 서열을 모두 포함하지만, 프로모터 서열인 것이 바람직하고, 프로모터 서열 중에서도 유도성 프로모터 서열(inducible promoter sequence)인 것이 더욱 바람직하다. 프로모터는 유도성 프로모터 이외에도 구조성 프로모터(constitutive promoter sequence)가 있는데, CaMV 프로모터가 이러한 구조성 프로모터의 예로서 언급될 수 있다. 유도성 프로모터는 유도 인자의 존재로 인하여 그에 연결된 유전자의 발현이 활발해지는 것을 가능하게 하는 프로모터로서, 예컨대, 구리 이온에 의해 활성화되는 효모 메탈로티오네인 프로모터(Mett 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:4567, 1993; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 치환 벤젠설폰아미드에 의해 활성화되는 In2-1 및 In2-2 프로모터(Hershey 등, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 글루코코르티코이드에 의해 조절되는 GRE 조절 서열(Schena 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:10421, 1991; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 에탄올 조절성 프로모터(Caddick 등, Nature Biotech., 16:177, 1998; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 리뷸로스 비스-포스페이트 카르복실라제(ssRUBISCO)의 소 서브유니트에서 유래한 광 조절성 프로모터(Coruzzi 등, EMBO J., 3:1671, 1984; Broglie 등, Science, 224:838, 1984; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 만노핀 신타제 프로모터(Velten 등, EMBO J., 3:2723, 1984; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다), 노팔린 신타제(NOS) 및 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터, 열 충격 프로모터(Gurley 등, Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin 등, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990; 그 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 간주된다) 등을 들 수 있다.

한편, 상기 재조합 벡터는 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다. 여기서 "마커 유전자"란 그러한 마커 유전자를 포함하는 식물 또는 식물 세포의 선별 또는 검색을 가능하게 하는 형질 또는 표현형을 암호화하는 유전자를 의미한다. 마커 유전자는 항생물질 내성 유전자일 수 있고 제초제 내성 유전자일 수도 있다. 적합한 선별 마커유전자의 예로는 아데노신 데아미나제의 유전자, 디히드로폴레이트 리덕타제의 유전자, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제의 유전자, 티미딘 키나제의 유전자, 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제의 유전자 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 pCV1300에 삽입시켜 재조합 벡터 pCV1300::9AX2를 제작한 다음 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메페이시언스에 형질 전환시키고 그 형질 전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 애기장대에 형질전환시켜 상기 유전자의 과발현을 조절시켰다.

이러한 본 발명의 실시 양태를 고려할 때, 상기 제 1단계는, 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자를 식물에 형질전환시키는 단계를 포함하는 것 이 바람직하고, 더 바람직하게는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCV1300::9AX2를 식물에 형질전환시키는 단계를 포함할 때이다. 가장 바람직하게는 상기 재조합 벡터 pCV1300::9AX2로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 식물에 형질전환시키는 단계를 포함할 때이다.

한편, 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법은, 두번째 양태로서, 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1에 개시된 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 애기장대를 형질전환시키고 과발현을 유도하였을 때, 그 애기장대는 조기 개화 표현형을 보임을 확인할 수 있었다. 이것은 애기장대를 포함하는 개화 식물에서 서열번호 1에 개시된 염기서열 또는 그와 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현 시켰을 때, 그 식물에서 조기 개화를 유도할 수 있음을 의미하는 것이다. 그러므로 본 발명의 식물의 조기 개화를 유도하는 방법은 서열번호 1에 개시된 염기서열 또는 그와 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 것이다.

여기서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서 "개화 식물", "과발현", "식물" 등에 대한 정의는 앞서 정의된 바와 같다.

또한 여기서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서 "서열번호 1에 개시된 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자"란 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유 전자의 동족체(homologue)로서 조기 개화 조절 기능을 지니면서, 식물의 종류에 따른 진화적 경로의 상이로 인하여 서열번호 1의 염기 서열과 달라지는 서열로 이루어진 모든 유전자를 포함하는 의미이다. 그러므로 상기 본 발명의 개화 식물은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자가 비록 애기장대에서 분리된 것이라 하더라도, 애기장대를 포함한 기타의 모든 개화 식물이 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 다만, 여기서 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하고, 가장 바람직하게는 당연히 100%의 서열상동성을 지닐 때이다. 한편, 서열 상동성의 하한에 있어서는 상기 유전자가 서열번호 2의 아미노산 서열과 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 경우가 바람직할 것이다. 보다 더 구체적으로는 위 서열 상동성이 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 99.6 %의 순서대로 높아질수록 바람직하다.

본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법에 있어서, 상기 서열번호 1에 개시된 염기서열 또는 그와 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 단계는, 화학물질을 사용하여, 또는 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법의 상기 제1양태에서 설명한 바와 같이 유전공학적으로 이루어질 수 있다. 그러므로 본 발명의 개화 식물의 개화를 유도하는 방법에 있어서, 화학물질을 사용하여 서열번호 1에 개시된 염기서열 또는 그와 유사한 서열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 방법과 유전공학적으로 서열번호 1에 개시된 염기서열 또는 그와 유사한 서 열로 이루어진 유전자를 과발현시키는 방법 모두를 포함한다. 그럼에도 바람직하게는 화학물질을 사용하는 방법이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 조기 개화의 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법에 대한 것이다. 구체적으로 본 발명의 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법은 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 식물내로 형질전환시키는 단계, 상기 형질전환된 식물에서 상기 폴리뉴클레오티드의 과발현을 유도하는 단계, 및 과발현된 식물을 선별하는 단계를 포함한다.

전술한 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법에 대한 모든 설명은 필요한 변형을 통하여 상기 본 발명의 조기 개화 표현형을 지니는 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법에 그대로 적용된다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 조기 개화의 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법에 의하여 얻어진 조기 개화의 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물에 대한 것이다.

본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 개화 식물의 개화를 억제하는 방법에 대한 것이다.

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "개화 식물"이나 "식 물" 등에 대한 정의는 앞서 정의된 바가 그대로 적용된다.

전술하였지만, 본 발명의 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자는 그것이 과발현되었을 때 개화 식물의 조기 개화 표현형을 나타내도록 한다. 이것은 역으로 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자의 발현이 억제되었을 때는 개화 식물의 개화가 억제될 수 있음을 의미하는 것이다.

그러므로 본 발명의 개화 식물의 개화를 억제하는 방법은 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1에 개시된 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 개화 식물의 개화를 억제하는 방법에 있어서, 상기 "서열번호 1에 개시된 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자"란, 상기 본 발명의 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법의 두번째 양태에서와 같이, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자의 동족체로서 조기 개화 조절 기능을 지니면서, 식물의 종류에 따른 진화적 경로의 상이로 인하여 서열번호 1의 염기 서열과 달라지는 서열로 이루어진 모든 유전자를 포함하는 의미이다.

상기 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 1에 개시된 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자의 발현 억제는 당업계에 공지된 방법으로 충분히 가능하다. 즉, 안티센스 뉴클레오티드 도입, 유전자 제거(gene deletion), 유전자 삽입(gene insertion), T-DNA 도입, 동종 재조합(homologous recombination) 또는 트랜스포전 태깅(transposon tagging), siRNA (small interfering RNA) 등의 방법이 이용될 수 있다.

바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 해당 식물내에 도입하는 방법을 사용하는 경우이고, 더 바람직하게는 상기 안티센스 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 식물체내로 도입하는 방법을 사용하는 경우이다. 특히 위 형질전환체는 위 재조합 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움 투메페이시언스인 것이 바람직할 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

<실시예 1> 조기 개화 애기장대 형질전환체의 제작 및 선발

조기 개화 애기장대의 형질전환체의 제작 및 선발은 웨이젤 등(Weigel et al., (2000) Plant Physiology, Vol 122 1003-1013)의 방법에 따라 수행되었다.

먼저 도 1에 도시된 바와 같이 4개의 CaMV 35S 인핸서가 T-DNA의 오른쪽 경계(right border) 부근에 존재하고 바스타 제초제에 대한 저항성을 부여하는 bar 유전자(phosphinothricin acetyltransferase gene)를 포함하고 있는 활성 태깅 벡터 pSK1015 (Activation tagging vator pSK1015; Weigel et al., Plant Physiology (2000), 122: 1003-1013)를 엘렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens strain AGL1; Lazo 등, (1991) Biotechnology 9:963-967)에 도입시키고, 가나마이신에 저항성을 보이는 형질전환 균주를 선발한 다음, 그 균주를 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-0(wt))에 플로럴 딥핑 방법 (floral dipping method; Clough et al., Plant J (1998) 16: 735-743)으로 형질전환시켰다. 형질전환된 애기장대에서 얻어진 종자를 토양을 담은 화분에서 재배한 후 바스타 제초제에 대해서 저항성을 보이는 애기장대 형질전환체를 1차로 선발하였다. 보다 확실한 애기장대 형질전환체를 얻기 위하여, 상기 1차로 선발된 애기장대 형질전환체를 마찬가지로 토양을 담은 화분에서 재배한 후 바스타 제초제에 대해서 저항성을 보이는 애기장대 형질전환체를 2차로 선발하였다. 이후 2차로 선발된 애기장대 형질전환체와 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))을 22℃의 온도에서 16/8시간 명암 주기로 조절되는 생장 조절기(growth chambers)내에서 재배하였다. 그 결과 도 2에서 확인되는 바와 같이 애기장대 형질전환체(9ax2)는 잎의 수가 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))에 비하여 감소하고 조기 개화의 표현형을 보였다.

<실시예 2> 조기 개화 표현형을 보이는 형질전환 식물체에서 과발현 유전자의 클로닝

상기 <실시예 1>에서 선발된 애기장대 형질전환체에서 조기 개화 표현형에 관여하는 유전자를 클로닝하기 위하여, TAIL-PCR (Liu YG et al., Plant J. (1995) 8: 457-463)을 실시하였다.

각각 서열번호 3 내지 5의 염기서열을 가지는 세개의 임의적 프라이머(Arbitray Primer)(각각 AD 1 프라이머, AD 2 프라이머 및 AD 3 프라이머라고 함)와, 서열번호 6 내지 8의 염기서열을 지니는 3개의 특이적 프라이머 (프라이머 1, 프라이머 2, 프라이머 3이라고 명명 함)가 사용 되었다.

TAIL-PCR은 3단계의 PCR 반응으로 진행되었는데, 각 단계의 PCR 반응은 아래와 같은 조건에서 수행되었다.

(제1단계의 PCR 반응)

제1단계의 PCR 반응에서 주형 DAN로서는 <실시예 1>에서 얻어진 애기장대 형질전환체에서 꽃기관 침수법 (Clough and Bent (1998) Plant J. 16 : 735~743) 으로 얻어진 게놈 DNA가 사용되었고, 전체 반응 용액의 양은 50㎕이다. 제1단계의 PCR 반응에 있어서의 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 20ng

프라이머 1: 0.2 μM

AD 1 프라이머: 2 μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 1 U

(첫번째 반응 사이클)

93℃에서 1분, 95℃에서 1분을 각각 1회, 94℃에서 30초, 62℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초를 각각 5회, 94℃에서 30초, 25℃에서 3분을 각각 1회, 이후에 3분 이상의 시간을 두고 72℃까지 온도를 천천히 증가시킨 후 72℃에서 3분, 그리고 94℃에서 10초, 68℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초를 각 15회씩 총 2회 반복하고 94℃에서 10초, 44℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초를 각 15회 반복한다. 이후에 71℃에서 1분을 1회 반응한다.

(제2단계의 PCR 반응)

제2단계의 PCR 반응에서 주형 DAN로서는 제1단계 PCR 반응 용액 50㎕중에서 1㎕을 취하여 멸균된 물 49㎕을 넣어 1/50으로 희석하여 사용하였다. 전체 반응 용액의 양은 20㎕이다. 제2단계의 PCR 반응에 있어서 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 1 ㎕

프라이머 2: 0.5 μM

AD 2 프라이머: 0.5 μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 1 U

(사이클의 회수 및 조건)

94℃에서 10초, 64℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초간 각 12회 반복하고, 72℃에서 1분간 반응한다.

(제3단계의 PCR 반응)

제3단계의 PCR 반응에서 주형 DAN로서는 제2단계 PCR 반응 용액 20㎕ 중에서 1㎕을 취하여 멸균된 물 99㎕을 넣어 1/100으로 희석하여 사용하였다. 전체 반응 용액의 양은 100㎕이다. 제3단계의 PCR 반응에 있어서 최종 농도 및 수행된 사이클의 횟수 및 조건은 다음과 같다.

(최종 농도)

주형 DNA: 1 ㎕

프라이머 3: 0.1 μM

AD 3 프라이머: 2μM

dNTP mix: 0.8 mM

Taq 효소: 2 U

(사이클의 회수 및 조건)

94℃에서 15초, 44℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초동안 각 20회 반복하고, 72℃ 1분간 반응한다.

위와 같이 PCR 반응을 3단계에 걸쳐 실시한 후, 그 결과물을 아가로스 젤 전기영동을 실시하고, 해당 칼럼을 분리하여 시퀀서 <ABI3730, Applied Biosystem Inc.>로 시퀀싱하였다.

시퀀싱 결과, 분리된 유전자는 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루지고, 279bp의 전사 해독 틀(ORF)을 포함하고 있음을 확인할 수 있었는데 이를 9AX2 유전자고 명명하였다. 그리고 상기 오픈 리딩 프레임의 염기서열로부터 연역되는 상기 9AX2 유전자가 암호화 하는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시되어 있다.

<실시예 3> 노던 블럿(Northern Blot)을 통한 9AX2 유전자의 과발현 여부의 확인

9AX2 유전자가 형질전환 애기장대에서 과발현되는지 여부를 확인하기 위하여, 9AX2 유전자에서 얻어진 cDNA 단편을 프로브로 하여 노던 블럿을 실시하였다. 먼저 애기장대 콜롬비아 야생형(Col-O(wt))과 <실시예 1>에서 얻어진 애기장대 형질전환체에서 TRIzol-Reagent(MRC Co., USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 전체 RNA를 각각 추출하였다. 각 레인(lane)별로 10 ㎍의 RNA를 1.2% 아가로스/ 포름알데하이드 겔에 로딩하여 분리하였고, 이후 나일론 막으로 옮겼다. 그리고 나서, 3X SSC로 5분간 세척하여 여분의 아가로즈를 제거한 후, RNA를 나일론 막에 고정시키기 위해 자외선(254nm, 0.18 J/Sq.cm2)을 조사하였다. 나일론 막으로 옮겨진 블럿은 박 등의 방법 (Park et al., Plant Mol. Biol. 26:1725-1735, 1994)에 따라 전혼성화 및 혼성화 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 야생형(Col-0)에서는 9AX2 유전자의 발현이 거의 없는 반면, 애기장대 형질전환체(9ax2)에서는 상기 유전자가 상당히 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 9AX2 유전자의 과발현의 효과 확인

<실시예 1>에서 얻어진 형질전환 애기장대의 표현형이 9AX2 유전자가 과발현으로 인한 것인지를 확인하기 위하여, 먼저 9AX2 유전자를 pCV1300 벡터(본 벡터는 강한 발현을 유도하는 -443 to +72의 CsVMV (Cassava vein mosaic virus) 프로모터 (promoter)를 포함하는 pILTA::CP 벡터 (Verdaguer 등, (1998) Plant Mol Biol. 37:1055-67)를 제한효소 HindIII 로 자른 후 pCAMBIA-1300 벡터 (Hajdukiewicz 등, (1994) Plant Mol. Biol. 25: 989-994)의 HindIII 자리에 결합시켜 제작된 것이다)의 제한효소 XbaI과 EcoRI 사이에 클로닝하여 9AX2 유전자를 포함하는 pCV1300::9AX2 재조합 벡터를 제작하였다. 결과적으로 구축된 pCV1300::9AX2 벡터는 대장균이나 아그로박테리움 투메페이시언스에 도입 시 선별할 수 있는 카나마이신 (Kanamycine) 저항성 유전자를 포함하고, 애기장대에 도입시 형질전환체를 선별할 수 있는 하이그로마이신 (hygromycine) 저항성 유전자를 포함한다.

상기 pCV1300::9AX2 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메페이시언스 Agl1 균주 (Lazo 등, (1991) Biotechnology 9:963-967)에 일랙트로포레이션(electroporation) 방법으로 도입시키고, 카나마이신 저항성을 갖는 아그로박테리움 투메페이시언스를 배양하여 플로럴 딥핑 방법 (Clough 등, (1998) Plant J. 16: 735-743)으로 애기장대에 형질전환시켰다. 형질전환 아기장대를 15 ㎍/ml의 하이그로마이신이 포함된 배지에서 선별하였다. CsVMV 프로모터에 의해 9AX2 유전자가 과발현되는 것을 확인하기 위하여 <실시예 3>과 동일한 방법으로 노던 블럿(Northern Blot)을 수행하여, 도 4a에서 도시하 듯 9AX2 유전자의 과발현 됨을 확인하였다. 9AX2 유전자의 과발현된 형질전환 애기장대로부터 종자(T1)를 수확하였다. 대조군으로는 pCV1300 벡터만으로 형질전환된 애기장대로부터 얻어진 종자(T1')를 사용하였다.

형질전환 애기장대로부터 얻어진 종자(T1), 대조군 애기장대로부터 얻어진 종자(T1')를 춘화 처리하여 모든 종자가 일정한 시기에 발아하도록 하였다. 춘화처리한 종자를 화분에 일정한 간격으로 파종하고 파종 후 약 7일간은 종자의 발아를 돕기 위해 화분에 랩을 씌워 다습한 상태를 유지하였다. 종자가 발아하면 화분을 16시간 낮/8시간 밤의 장일 조건으로 옮겨 재배하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이 형질전환 애기장대로부터 얻어진 종자(T1)으로부터 성장한 애기장대는 대조군 애기장대와는 달리 조기개화 표현형을 나타냄을 확인할 수 있었다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법, 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법, 그 방법에 의하여 얻어진 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물, 및 개화 식물의 개화를 억제하는 방법을 제공할 수 있다..

<110> GENOMINE INC. POSTECH FOUNDATION <120> Polypeptide Having a Function Controling Early Flowering, Polynucleotide Coding the Polypeptide and Their Use <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 279 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(276) <400> 1 atg tcg aac aga aga tca agg caa tct tca agt gct cca agg atc tcc 48 Met Ser Asn Arg Arg Ser Arg Gln Ser Ser Ser Ala Pro Arg Ile Ser 1 5 10 15 gat aat caa atg att gac ctc gta tct aag ctc cgt caa att ttg ccg 96 Asp Asn Gln Met Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Arg Gln Ile Leu Pro 20 25 30 gag att ggt caa cga cgt cgt tct gat aag gca tca gcc tcg aaa gta 144 Glu Ile Gly Gln Arg Arg Arg Ser Asp Lys Ala Ser Ala Ser Lys Val 35 40 45 ttg caa gag aca tgc aat tac ata cga aat ttg aac aga gaa gtt gac 192 Leu Gln Glu Thr Cys Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asn Arg Glu Val Asp 50 55 60 aat ctg agc gag cgt ttg tct cag ctt ctc gaa tct gtc gat gaa gat 240 Asn Leu Ser Glu Arg Leu Ser Gln Leu Leu Glu Ser Val Asp Glu Asp 65 70 75 80 agc cct gaa gcc gcc gtt att aga agc cta ctc atg taa 279 Ser Pro Glu Ala Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met 85 90 <210> 2 <211> 92 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Ser Asn Arg Arg Ser Arg Gln Ser Ser Ser Ala Pro Arg Ile Ser 1 5 10 15 Asp Asn Gln Met Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Arg Gln Ile Leu Pro 20 25 30 Glu Ile Gly Gln Arg Arg Arg Ser Asp Lys Ala Ser Ala Ser Lys Val 35 40 45 Leu Gln Glu Thr Cys Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asn Arg Glu Val Asp 50 55 60 Asn Leu Ser Glu Arg Leu Ser Gln Leu Leu Glu Ser Val Asp Glu Asp 65 70 75 80 Ser Pro Glu Ala Ala Val Ile Arg Ser Leu Leu Met 85 90 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ntcgastwts gwgtt 15 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ngtcgaswga nawgaa 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 wgtgnagwan canaga 16 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 aacgttatta gttcgccgct cg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttgaatggtg cccgtaactt tc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 caaggtttga cctgcacttc 20

Claims (25)

1. 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열 전체를 포함하는 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,

   상기 조기 개화 조절 기능은 조기 개화 유도 기능인 것을 특징으로 하는, 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 기재의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
9. 서열번호 1에 개시된 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
10. 제9항에 있어서,

    상기 폴리뉴클레오티드는 애기장대를 포함하는 개화 식물에서 조기 개화 조절 기능을 가진 유전자를 동정 또는 단리하는데 사용되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
11. 제8항의 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 뉴클레오티드.
12. 다음 단계들을 포함하여 이루어지는 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법

    (a) 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개화 식물 내로 도입시켜 형질전환 식물을 만드는 단계; 및

    (b) 상기 형질전환 식물에서 상기 폴리뉴클레오티드의 과발현을 유도하는 단계.
13. 제12항에 있어서,

    상기 (a) 단계는

    (i) 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; 및

    (ii) 상기 재조합 벡터를 개화 식물 내로 도입하여 형질전환 식물을 만드는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
14. 제12항에 있어서,

    상기 (a) 단계는

    (i) 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 조절 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터에 삽입시켜 재조합 발현벡터를 제작하는 단계;

    (ii) 상기 재조합 발현벡터를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계; 및

    (iii) 상기 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 개화 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서,

    상기 조절 뉴클레오티드 서열은 인핸서 서열 또는 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
16. 제15항에 있어서,

    상기 프로모터는 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
17. 제12항에 있어서,

    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
18. 제12항에 있어서,

    상기 (a) 단계는 서열번호 1에 개시된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 pCsV1300::9AX2로 식물 내로 도입시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 개화식물의 조개 개화를 유도하는 방법.
19. 제12항에 있어서,

    상기 (a) 단계는

    (i) 서열번호 1에 개시된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터 pCsV1300::9AX2를 제작하는 단계;

    (ii) 상기 재조합 발현벡터 pCsV1300::9AX2를 아그로박테리움 박테리아에 형질전환시키는 단계; 및

    (iii) 상기 형질전환된 아그로박테리움 박테리아로 개화 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
20. 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자의 과발현을 유도하는 단계를 포함하는, 개화 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
21. 삭제
22. 다음의 단계들을 포함하여 이루어지는 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물을 생성하는 방법

    (a) 조기 개화 조절 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개화 식물 내로 도입시켜 형질전환 식물을 만드는 단계;

    (b) 상기 형질전환 식물에서 상기 폴리뉴클레오티드의 과발현을 유도하는 단계; 및

    (c) 과발현된 식물을 선별하는 단계.
23. 제22항의 방법에 의하여 얻어진 조기 개화 표현형을 지닌 유전자 변형 개화 식물.
24. 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하여 이루어지는, 개화 식물의 개화를 억제하는 방법.
25. 제24항에 있어서,

    상기 단계는 상기 서열번호 1에 개시된 염기서열로 이루어진 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 개화 식물 내로 도입함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 개화 식물의 개화를 억제하는 방법.

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