KR101262451B1

KR101262451B1 - 형질전환 난쟁이 식물체

Info

Publication number: KR101262451B1
Application number: KR1020100044182A
Authority: KR
Inventors: 정인식; 정호용; 김경일; 박종화; 정하영; 이현호
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2013-05-08
Also published as: KR20110124669A

Abstract

본 발명은 애기장대의 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭 재조합벡터로 형질전환된 난쟁이 식물체를 제공한다. 본 발명의 형질전환 난쟁이 식물체는 화단용 또는 절화용 뿐만 아니라 조경용, 분화용으로도 적합하기 때문에 관상식물의 이용폭을 넓힐 수 있어 수입대체 효과 뿐 아니라 수출을 통한 농가 소득 증대에 도움이 된다.

Description

형질전환 난쟁이 식물체{Transformed Dwarf Plants}

본 발명은 애기장대의 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭 재조합벡터 및 이에 의해 형질전환된 난쟁이 식물체에 관한 것이다.

전세계 화훼산업 분야의 시장 규모는 2005년 조사에 의하면 23조 5천억원이며 국내 화훼 시장 규모는 1조 105억원이며 이 중 절화, 분화, 및 초화류 시장이 약 9천억원 정도로 점차 그 비중이 증가하는 추세에 있다.

화단용 또는 절화용으로 이용되는 관상식물의 경우, 현재 국내 소비의 대부분을 수입에 의존하고 있어 국내 자체 품종 육성이 요구된다. 이러한 관상식물은 그 초장이 1 ~ 1.5m 내외로 키가 비교적 큰 초화류로서, 화단용, 절화용으로 이용된다. 따라서, 관상식물의 난쟁이 형질전환체가 개발된다면 조경용, 분화용으로 이용폭을 넓힐 수 있고 이들 식물의 수입대체 효과 뿐 아니라 수출에 의한 농가 소득 증대에 큰 역할을 할 것으로 기대된다.

또한, 난쟁이 식물은 정상 크기의 식물에 비해서 물을 덜 쓰고 바람과 강우 피해에도 더 강하며 줄기나 잎을 만드는 대신 종자나 과일을 만드는 데 더 많은 비율의 에너지를 투자한다고 알려져 있다. 따라서, 과도한 초세에 따른 상품성 하락 방지, 취급과 채취의 용이성 향상, 도복저항성 증가 및 병해충의 피해 감소, 실내외 유휴공간의 장식 및 화단의 입체화를 위한 식물의 다양성 증가등 다양한 이점을 가질 수 있다.

현재까지 주로 사용되는 식물의 왜화 방법으로 적심을 통한 줄기생장의 억제 및 왜화제를 이용하는 방법 등이 있으며, 왜화제를 이용한 생장억제 방법이 가장 손쉬운 수단으로 여러 작물에 적용되고 있다. 그러나, 생장억제를 위한 왜화제로 트리아졸계 농약이 주로 사용되고 있는데 이는 환경 부담은 물론 각종 생리장해를 야기한다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 보다 안정적이면서도, 환경 부담이 없는 난쟁이 표현형 식물체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, RNA 간섭 벡터를 이용하여 dwf3 유전자 발현이 저해된 난쟁이 식물체가 원하는 난쟁이 표현형을 나타내면서 종자 획득도 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 조경용 내지 분화용으로 적합한 형질전환된 난쟁이 식물체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 또한 상기 형질전환된 난쟁이 식물체를 제조하기 위한 RNA 간섭 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제을 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭 재조합벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합벡터 내지 상기 형질전환 미생물로 형질전환된 난쟁이 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합벡터 내지 상기 형질전환 미생물을 이용한, 난쟁이 표현형을 갖도록 형질전환된 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 난쟁이 식물체는 물을 덜 쓰고 바람과 강우 피해에도 강하며 종자나 과일의 생산이 가능하며, 취급과 채취가 보다 용이하고, 도복저항성이 보다 우수하다. 또한, 화단용 또는 절화용 뿐만 아니라 조경용, 분화용으로도 적합하기 때문에 관상식물의 이용폭을 넓힐 수 있어 수입대체 효과 뿐 아니라 수출을 통한 농가 소득 증대에 도움이 된다.

도 1은 본 발명에 따른 RNA 간섭 재조합벡터의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 난쟁이 유전자인 dwf3를 포함하는 형질전환된 애기장대의 표현형을 정상 애기장대의 표현형과 비교하여 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명에 따른 형질전환된 애기장대에서 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭 재조합 벡터의 도입여부를 Southern blot 분석으로 나타낸 것이다 (레인 1: 정상 애기장대 잎 genomic DNA; 레인 2, 3: pFGC5941-DWF3 벡터로 형질전환된 애기장대 잎 genomic DNA).
도 4은 본 발명에 따른 형질전환된 애기장대에서 난쟁이 유전자인 dwf3의 발현저해를 RT-PCR 분석으로 나타낸 것이다 (레인 1: 정상 애기장대 잎 total RNA; 레인 2, 3: pFGC5941-DWF3 벡터로 형질전환된 애기장대 잎 total RNA).

본 발명은 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물, 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 난쟁이 식물체에 관한 것이다.

본 발명은, 또한 상기 RNA 간섭 재조합벡터를 이용하여 식물체를 난쟁이 표현형을 나타내도록 형질전환하는 방법에 관한 것이다.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 난쟁이 유전자인 dwf3(dwarf 3)에 대한 RNA 간섭 재조합벡터에 관한 것이다.

본 발명의 RNA 간섭 재조합벡터 내 포함되는 난쟁이 유전자 dwf3의 RNA 간섭을 위한 서열은 서열번호 1에 기재된 DWF3 코딩 서열 [애기장대 정보자원센터 (TAIR; http://www.arabidopsis.org) name:AT5G05690.3, Tair accession no. :4010715831]의 일부분(센스 염기서열), 즉, 서열번호 1에 기재된 염기서열 중 약 100 내지 약 500 bp 의 DNA를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 DNA를 사용할 수 있다. 한편, 안티센스 염기서열은 상기 센스 염기서열에 대한 상보적인 서열을 의미한다.

또한 형질전환되는 식물체 내에서 발현되어 dwf3 mRNA와 결합하여 dwf3의 발현을 저해할 수 있는 서열번호 3의 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 변이체는 서열번호 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함하며, 서열번호 3의 염기서열의 대립유전자형 또는 종간 변이체, 또는 이의 단편들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 벡터는 식물 발현용 벡터이다.

"벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)가 현재 식물세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 이원(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 식물 발현 벡터는 RNA 간섭 재조합 벡터로서, 이는 형질전환되는 식물체 내에서 난쟁이 유전자인 dwf3에 대한 RNA 간섭을 유도하는 스템 루프형 dsRNA를 생성하도록 설계된 재조합 벡터이다. “스템 루프”란, 단일 사슬 RNA 상에 존재하는 역방향 반복 서열간 수소결합에 의해 생기는 이중 사슬의 부분과 그 사이의 루프 부분으로 구성되는 구조를 말하며, 헤어핀 루프라고도 불린다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 식물 발현 벡터는 난쟁이 유전자인 dwf3 mRNA의 어느 영역의 센스(혹은 안티센스) RNA를 암호화하는 센스(혹은 안티센스) 코드 DNA와 본 DNA에 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 2개의 서열이 서로 역방향이 되도록 배치시키고 이것을 프로모터와 작동적으로 연결한 구조를 가지는 DNA를 포함한다. 여기서, 스페이서 영역을 구성하는 DNA는 이에 인접하는 반복 서열이 수소결합을 할 수 있는 한, 그 길이는 특히 제한되지 않지만, 통상 1~10,000 염기이다. 스페이서 영역을 구성하는 DNA의 염기 서열은, 특별히 규정하지 않고 임의의 서열로 할 수 있으며, 바람직하게는 CHSA 유전자 (penunia chalcone synthase A)로부터 얻은 1,352 bp 인트론 (이하 ‘CHSA 인트론’)을 사용할 수 있다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 또한 선택마커, 프로모터 및 터미네이터를 포함한다.

본 발명에서 사용가능한 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 바스타 저항성 (BAR) 유전자가 사용된다.

본 발명에서 사용가능한 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터로서, CaMV35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터 등이 있으며, 바람직하게는 CaMV35S 프로모터가 사용된다.

본 발명에서 사용가능한 터미네이터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 터미네이터일 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으며, 바람직하게는 옥토파인 신타제(OCS) 터미네이터가 사용된다.

특히, 본 발명에서 바람직한 RNA 간섭 재조합벡터는 2개의 T-DNA 보더 사이에 제초제 저항성을 가지는 BAR 유전자, CaMV35S 프로모터, 옥토파인 신타제 터미네이터 및 CHSA 인트론을 포함하고, 난쟁이 유전자인 dwf3의 RNA 간섭을 위한 센스 염기서열 및 이의 안티센스 염기서열이 CHSA를 사이에 두고 서로 역방향이 되도록 배치되고, 프로모터와 작동가능하게 연결된 식물 발현 재조합벡터이다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 벡터는 도 1에 기재된 pFGC5941-DWF3 벡터이다.

본 명세서에서 유전자와 프로모터가 작동가능하게 연결되었다고 함은 핵산 서열들이 이들의 의도된 기능을 수행하도록 연결된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 서열을 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 프로모터 서열이 목적하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 지시할 수 있게 하는 방식으로 프로모터 서열과 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 의미한다.

본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주의 대표적인 예는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 세포; 및 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

숙주 세포에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에서는 식물체 형질전환에 사용하기 위하여 아그로박테리움 속 균주를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터에 의한 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다.

예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

아그로박테리움 벡터에 의한 식물체의 형질전환을 위한 최적 절차는 형질전환될 식물체의 종류에 따라 다양하다. 아그로박테리움 매개 형질전환을 위한 대표적인 방법은 멸균된 묘목 및/또는 작은 식물체로부터 유래된, 배축, 정단(shoot tip), 줄기 또는 잎 조직의 외식편의 형질전환을 포함한다. 그와 같은 형질전환된 식물체는 유성생식으로 또는 세포 또는 조직 배양에 의해 번식될 수 있다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 이전에 다수의 상이한 종류의 식물체를 위해 기재되었으며 그와 같은 형질전환을 위한 방법은 당업계에 공지된 문헌에서 찾을 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 균주라도 사용이 가능하다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 큰 것으로 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스, 더욱 바람직하게는, 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자 pCAMBIA 1300 플라스미드가 들어 있는 GV3101 계통의 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용할 수 있다.

본 발명에서 형질전환되는 식물체는 본 실시예에서 사용된 애기장대 뿐만 아니라 리아트리스, 에키네시아, 가우라, 플록스 등 경제적으로 사용될 수 있는 관상식물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 난쟁이 표현형을 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 RNA 재조합 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 난쟁이 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: dwf3 에 대한 RNA 간섭 재조합 벡터 제작

ChromDB와 CAMBIA 웹사이트에 기재된 방법에 의하여 재조합 RNA 간섭 벡터를 제작하였다. 즉, RNA 간섭 벡터인 pFGC5941에 난쟁이 유전자 dwf3 절편(서열번호 3)을 CHSA 인트론을 사이에 두고 정방향 및 역방향으로 클로닝 하였다.

서열번호 1의 염기서열의 DNA(Tair name AT5G05690.3)를 템플리트로 아래의 센스 프라이머(서열번호 4)와 안티센스 프라이머(서열번호 5)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 각 프라이머는 제노텍(한국)사에 의뢰하여 제작하였다.

5'-TCTAGAGGCGCGCCGAGGAAGAAGGAGCGGAG-3' (센스)

5'-GGATCCATTTAAATGGGTTGAAAGTGCGAGCATC-3' (안티센스)

상기 프라이머는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA의 PCR 증폭시 클로닝이 용이하도록 정방향은 AscI 및 SwaI의 제한효소 부위를 갖도록 하였고 역방향은 BamHI 및 XbaI의 제한효소 부위를 갖도록 디자인하였다. PCR 조건은 전변성 94℃에서 5분, 변성 94℃에서 1분, 어닐링 55℃에서 1분, 신장 72℃에서 1분, 확장 72℃에서 10분간 총 30회 수행하였다.

상기 PCR 산물 3㎕, 2X 반응 버퍼 5㎕, pGEM-T 벡터(Promega, USA) 1㎕와 T4 DNA 라이게이즈(ligase)를 이용하여 25℃에서 2시간동안 라이게이션한 후, E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킨 다음, E. coli 플라스미드를 분리하였다.

분리한 pGEM-T-DWF3 벡터를 AscI 및 SwaI로 절단하는 한편, pFGC5941 벡터 (식물 내 이중가닥 RNA 제조를 위한 이원 벡터 (http://www.chromdb.org/rnai/vector_info.html))를 동일한 제한효소로 절단한 후, 절단된 DWF3 유전자 5㎕, 절단된 pFGC5941 벡터 3㎕, 10X 반응버퍼 1㎕와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 25℃에서 2시간동안 라이게이션한 후(정방향), E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킨 다음, E. coli 플라스미드를 분리하였다. 분리된 정방향 유전자가 삽입된 벡터를 BamHI 및 XbaI로 절단하는 한편, 동일한 제한효소로 절단한 DWF3 유전자를 위와 동일한 방법으로 라이게이션한 후(역방향) E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킨 다음, E. coli 플라스미드를 분리하였다.

위의 방법으로 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA를 포함하는 RNA 간섭 벡터가 삽입된 식물 발현용 이원(binary) 벡터인 pFGC5941-DWF3 재조합벡터를 제작하였다 (도 1). 재조합 벡터에 상기 제한효소로 절단하여 452bp의 밴드를 확인하여 삽입 여부를 확인하였다. 상기 재조합벡터 pFGC5941-DWF3에서 유전자 삽입이 적합한 방향으로 되었는지와 판독 프레임을 제한효소 지도 작성과 DNA 서열 결정에 의하여 확인하였다.

실시예 2: 아그로박테리움 투메파시엔스 형질전환

식물 형질전환에 사용될 재조합 아그로박테리움 투메파시엔스의 제조를 위해 전기천공법(electroporation)을 사용하였다.

아그로박테리움 컴피턴트 세포(GV3101) 200㎕에 상기 제작된 pFGC5941-DWF3 재조합 벡터 DNA를 1㎕ (50ng/㎕이상)를 넣고 ice에 30분간 방치한 후 알코올로 소독된 큐벳에 넣고 미세-전기천공 챔버를 이용하여 2.4kV의 전류를 가한 후 ice로 옮겨주었다. 이렇게 전류를 준 아그로박테리움 용액에 LB배지 800㎕를 넣고 피펫을 이용하여 15ml 튜브로 옮겨서 25℃에서 4시간 동안 키운 뒤 50mg/L의 겐타마이신과 25mg/L의 카나마이신 항생제가 들어간 LB 고체 배지에 도말하여 25℃에서 2일간 배양하였다.

배양된 아그로박테리움 단일 콜로니를 액체 배양하여, 플라스미드 DNA를 추출하여 PCR 방법으로 확인하였다. PCR 조건은 전변성 94℃에서 5분, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초, 확장 72℃에서 7분, 그리고 총 30싸이클을 수행하였다. 선별된 아그로박테리움 클론에 서열번호 3의 염기서열을 갖는 DNA가 삽입된 것을 확인하고 식물 형질전환에 사용하였다.

실시예 3: 아그로박테리움을 이용한 애기장대의 형질전환

상기에서 제작된 재조합벡터 pFGC5941-DWF3이 삽입되어 있는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens, GV3101)를 멸균된 LB 액체 배지에 넣고 항생제(카나마이신 50mg/ℓ)를 첨가하여 36시간 동안 28℃에서 150rpm의 속도로 조절된 진탕배양기에서 배양한 후, 원심분리기에 넣고 2500rpm으로 10분간 원심분리시킨 다음, 원심분리된 균을 0.05% silwet L-77(Cat. No. VIS-02, Lehle Seed, USA)을 포함하는 10% 수크로오스 액체로 현탁시켜 애기장대의 형질전환에 사용하였다.

파종후 로제트(Rosette) 생성후 꽃대가 올라온 애기장대의 로제트와 잎에 상기 제조된 아그로박테리움 용액을 스프레이하여 형질전환시켰고 0.4%의 제초제(BASTA) 500ml을 격일로 3회 처리하여 형질전환체를 선별하였다. 상기 애기장대는 흙에서 발아시켰고, 광주기 16h, 22℃ 조건에서 성장 시켰다.

실험예 1: 형질전환체의 표현형 확인

난쟁이 유전자인 dwf3가 삽입된 형질전환 애기장대의 표현형을 야생형과 비교 확인하였다.

구체적으로, 0.4% BASTA로 1주일 동안 격일로 분무한 후 살아 남은 형질전환 애기장대를 파종후 4주 동안 성장시켰다. 대조군으로 파종후 4주 동안 키운 야생형을 사용하였다. 상기 야생형 및 형질전환 애기장대는 광주기 16h, 22℃ 조건에서 성장시켰다. 그 결과를 도2에 나타내었다. 도2에 나타난 바와 같이 형질전환된 애기장대의 초장이 야생형에 비해 현저히 감소된 것으로 나타났으며, 강한 억제형과 약한 억제형이 얻어졌다.

실험예 2: 난쟁이 유전자인 dwf3 의 도입 확인

난쟁이 유전자인 dwf3의 도입분석 확인을 위하여, Southern blot 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 형질전환된 애기장대로부터 난쟁이 유전자인 dwf3를 포함하는 재조합 벡터의 도입분석 확인을 위하여, 파종후 4주후의 형질전환 애기장대의 잎에서 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 추출한 genomic DNA 시료에 대해 Southern blot 분석을 수행한 후, 겔 상에서 전기영동하였다.

형질전환 애기장대의 잎에서 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 추출한 genomic DNA 40㎕, 10X 반응버퍼 5㎕와 EcoRI 5㎕를 overnight 처리한 다음 겔상에 전기영동한후 니트로셀룰로스 멤브레인에 트랜스퍼하고 방사선 동위원소를 이용하여 Southern blot를 수행한 후 X-ray 필름에 감광시켜 밴드를 확인하였다. DNA 사이즈 마커로 λHind III(TaKaRa)를 사용하였다.

그 결과, 형질전환된 애기장대의 잎에서 난쟁이 유전자인 dwf3를 포함하는 재조합 벡터의 도입을 확인하였다 (도 3). 도 3에 나타난 바와 같이, 2, 3번 레인에서만 나타난 CHSA 인트론에 대한 밴드를 통해 형질전환되었음을 알 수 있었다.

실험예 3: 난쟁이 유전자인 dwf3 의 발현저해 확인

난쟁이 유전자인 dwf3의 발현이 저해되었는지 확인하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실험예 1의 형질전환 애기장대 및 야생형의 잎에서 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 추출한 RNA 시료에 대해 DNaseI (Takara, 일본)-처리 전체 RNA를 ImProm-II^TM Reverse Transcription System (Promega,USA)과 제조사 지시에 따른 올리고-dT 프라이머를 사용하여 역전사하였다. 이어서, 제1 가닥 cDNA를 dwf3 유전자-특이적 프라이머와 내부 표준 18S rRNA 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.

하기 프라이머 세트로 dwf3 유전자를 증폭하여 1059 bp 단편을 제조하였다.

5'-ATGAAAGGTTCTTTGCATAAAC-3' (서열번호 6)

5'-AGTAGCAAAATCACGGCGCTTC-3' (서열번호 7)

내부 표준 18S rRNA 프라이머는 하기의 세트를 사용하였다.

5'-GGATGGGTCGGCCGGTC-3' (서열번호 8)

5'-CAGGCTGAGGTCTCGTTC-3' (서열번호 9)

PCR에서, 증폭 프로그램은 초기 94℃ 5분, 이어서 94℃ 1분; 55℃ 1분; 72℃ 1분의 28-35 사이클, 및 최종 연장 72 ℃ 10분으로 구성하였다.

PCR 산물을 겔상에서 전기영동하였다 (도 4). 형질전환된 애기장대의 잎에서 난쟁이 유전자인 dwf3의 발현이 높은 효율로 저해되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> transformed dwarf plants <130> P10-020-KHU <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1062 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1059) <400> 1 atg aaa ggt tct ttg cat aaa cgt atg cac tct ctc acc atg agc ttt 48 Met Lys Gly Ser Leu His Lys Arg Met His Ser Leu Thr Met Ser Phe 1 5 10 15 gct aat tct tca atc att aaa gac cat ctc atg ctt gat att gac cgg 96 Ala Asn Ser Ser Ile Ile Lys Asp His Leu Met Leu Asp Ile Asp Arg 20 25 30 tta gtc cgg ttt aat ctt gat tct tgg tct tct cgt gtt ctc ctc atg 144 Leu Val Arg Phe Asn Leu Asp Ser Trp Ser Ser Arg Val Leu Leu Met 35 40 45 gaa gaa gcc aaa aag ata acg ttt gag cta acg gtg aag cag ttg atg 192 Glu Glu Ala Lys Lys Ile Thr Phe Glu Leu Thr Val Lys Gln Leu Met 50 55 60 agc ttt gat cca ggg gaa tgg agt gag agt tta agg aaa gag tat ctt 240 Ser Phe Asp Pro Gly Glu Trp Ser Glu Ser Leu Arg Lys Glu Tyr Leu 65 70 75 80 ctt gtc atc gaa ggc ttc ttc tct ctt cct ctc cct 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315 320 Ser Trp Val Pro Ala Glu Gln Asp Lys Leu Val Phe Phe Pro Thr Thr 325 330 335 Arg Thr Gln Lys Arg Tyr Pro Ile Phe Val Lys Arg Arg Asp Phe Ala 340 345 350 Thr <210> 3 <211> 452 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> misc_feature <222> (1)..(452) <223> dwf3 fragment for RNAi <400> 3 gaggaagaag gagcggagag aaagaaagat atgcttgcgg cgttgcttgc ggcggatgat 60 ggattttccg atgaagagat tgttgacttc ttggtggctt tacttgtcgc cggttatgaa 120 acaacctcca cgatcatgac tctcgccgtc aaatttctca ccgagactcc tttagctctt 180 gctcaactca aggaagagca tgaaaagatt agggcaatga agagtgattc gtatagtctt 240 gaatggagtg attacaagtc aatgccattc acacaatgtg tggttaatga gacgctacga 300 gtggctaaca tcatcggcgg tgttttcaga cgtgcaatga cggatgttga gatcaaaggt 360 tataaaattc caaaagggtg gaaagtattc tcatcgttta gagcggttca tttagaccca 420 aaccacttca aagatgctcg cactttcaac cc 452 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for DWF3 RNAi <400> 4 tctagaggcg cgccgaggaa gaaggagcgg ag 32 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for DWF3 RNAi <400> 5 ggatccattt aaatgggttg aaagtgcgag catc 34 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for dwf3 identification <400> 6 atgaaaggtt ctttgcataa ac 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer for dwf3 identification <400> 7 agtagcaaaa tcacggcgct tc 22 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for 18s rRNA <400> 8 ggatgggtcg gccggtc 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense primer for 18s rRNA <400> 9 caggctgagg tctcgttc 18

Claims

2개의 T-DNA 보더 사이에 제초제 저항성 선택마커, 프로모터, 스페이서 및 터미네이터를 포함하고, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 dwf3 유전자의 RNA 간섭을 위한 센스 염기서열 및 이의 안티센스 염기서열이 스페이서를 사이에 두고 서로 역방향이 되도록 배치되고, 프로모터와 작동가능하게 연결된, 식물 발현용 RNA 간섭 재조합 벡터.
삭제
제1항에 있어서, RNA 간섭 재조합 벡터는 도 1에 기재된 pFGC5941-DWF3 벡터인 식물 발현용 RNA 간섭 재조합 벡터.
제1항 또는 제3항의 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움 투메파시엔스.
삭제
제1항 또는 제3항의 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대.
제1항 또는 제3항의 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 애기장대의 제조방법.