KR101431125B1 - ｇｒｘＣ 유전자가 형질전환된 저온 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 grxC 유전자를 포함하는 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성 향상용 조성물, 그리고 상기 조성물로 형질전환된 식물 세포 또는 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환시켜 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 형질전환 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환시켜 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ｇｒｘＣ 유전자가 형질전환된 저온 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 그 제조방법 {Transgenic plant with enhanced tolerance to cold stress by introducing grxC gene and preparation method thereof}

본 발명은 grxC (glutaredoxin 3) 유전자를 포함하는 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성 향상용 조성물, 그리고 상기 조성물로 형질전환된 식물 세포 또는 식물체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환시켜 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 형질전환 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환시켜 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

다양한 산화효소 및 과산화효소의 활성을 통해 발생되는 활성산소 (Reactive oxygen species, ROS)는, 내부 발생 신호 또는 외부 환경 자극에 반응하여 세포 내 신호전달 물질로 작용하여 항산화효소나 열충격 단백질과 같은 식물생체 방어에 필요한 유전자들의 발현을 유도하게 되지만, ROS 의 농도가 증가되면 생리적인 장해를 유발하게 된다. 가뭄, 저온, 염분, 건조, 공해, 상처, 오존, 과다한 자외선 노출 및 삼투압 충격과 같은 각종 비생물적 환경 스트레스에 의하여 식물 내 ROS 가 과도하게 축적될 수 있으며, 이에 의하여 세포 내 거대분자들(macromolecules)을 손상되고 세포가 죽음에 이를 수 있다.

최근 식물에서 ROS에 의하여 매개되는 신호전달 경로에 대한 관심이 증가하고 있으며, 이들 경로를 조절하게 되면 세포 내의 항산화 효소 및 생체방어 단백질의 발현을 증가시킬 수가 있고 궁극적으로는 각종 환경 스트레스에 저항성을 가진 식물체를 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

한편, 식물 내 항산화 시스템에서, 글루타레독신 (glutaredoxin, Grx)의 생리적 역할은 잘 알려져 있지 않다. Grx 는 거의 모든 동물, 식물, 미생물에 존재하는 글루타치온-의존성 환원효소로 알려져 있으며, 글루타치온 의존적 반응을 촉매하여 활성산소에 의한 손상으로부터 특정 세포 단백질을 보호한다. E.coli 는 5개의 Grx (EcGrxA , EcGrxB , EcGrxC , EcGrxD, 및 EcNrdH)를 가지고 있으며, 애기장대는 31개의 Grx 를 가지고 있다.

본 발명자들은 E.coli 의 Grx 유전자들이 식물의 환경 스트레스에 대한 저항성에 미치는 영향을 연구하던 중, grxC 유전자가 형질전환된 식물체의 경우 저온 스트레스에 대한 내성을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 grxC 유전자를 포함하는, 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성 향상용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물로 형질전환된 식물 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물로 형질전환된 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 grxC 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 형질전환 식물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 grxC 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 grxC 유전자를 포함하는, 식물의 저온 스트레스 저항성 향상용 조성물에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 상기 grxC 유전자는 대장균(E.coli) 유래의 것일 수 있다.

바람직하게, 상기 grxC 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게, 상기 grxC 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 grxC 유전자는 식물 발현용 재조합 벡터 형태로 포함된 형태일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물로 형질전환되어 저온 스트레스 저항성이 증진된 식물 세포에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물로 형질전환되어 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 형질전환 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 grxC 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

글루타레독신 (glutaredoxin, Grx)은 거의 모든 동물, 식물, 미생물에 존재하는 글루타치온-의존성 환원효소로 알려져 있으며, CXXC, CXXS 를 활성 부위로 가지고 있고, 글루타치온 의존적 반응을 촉매하여 활성산소에 의한 손상으로부터 특정 세포 단백질을 보호한다. E.coli 는 5개의 Grx (EcGrxA , EcGrxB , EcGrxC , EcGrxD, 및 EcNrdH)를 가지고 있다.

본원에서, grxC 유전자는 대장균 유래의 것이 바람직하다. 대장균 유래의 grxC 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열을 가지며, 이에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다.

바람직하게, 본 발명에서 grxC 유전자는 기능적으로 균등한 코돈 또는 (코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 유전자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 배열하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 배열된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 배열 방법은 당업계에 공지되어 있다.

Grx 가 식물 내 항산화 시스템에서 환경 스트레스 저항성에 어떤 영향을 미치는지는 알려져 있지 않은 상황에서, 본 발명자들은 grxC 유전자를 형질전환시킨 식물체의 저온 스트레스에 대한 저항성이 월등하게 향상됨을 처음으로 규명하였다. 따라서, grxC 유전자를 이용하여 저온 스트레스 저항성이 증진된 식물을 제조할 수 있다.

식물체 내에 grxC 유전자의 도입은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 식물 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다. 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB(blue copper binding protein) 프로모터를 포함할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 또는 제초제(예: 바스타) 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt) 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터(cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.

상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며(Agrobacterium - mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes )를 사용할 수 있다. 그밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.

본원에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 형질전환 대상이 되는 식물은, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있다.

grxC 유전자를 식물에 도입하여 저온 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 기후 변화에 따른 이상 저온에 견디거나 추운 지방에서 농작물 또는 화훼작물의 생산성 증진을 도모할 수 있다.

도 1은 EcGrxC 유전자를 발현시키기 위한 벡터의 구성(A) 및 벡터의 제조 과정(B)을 나타낸 것이다.
도 2는 EcGrxC 유전자를 형질전환시킨 애기장대 #3-6, #4-6, #5-7 에 대하여 EcGrxC 유전자가 발현함을 확인한 전기영동 결과이다.
도 3 은 냉동 조건에서 Col-0 (Columbia-0 생태형) 및 EcGrxC 를 발현하는 식물체의 각 표현형을 비교한 것이다. 냉동 처리 후 2주 후의 사진으로, 대표적인 식물체들을 나타내었다.
도 4는 저온 저항성을 평가하기 위해 콜드 스트레스를 처리한 스케쥴을 나타낸다.
도 5는 Col-0 생태형과 EcGrxC 를 발현하는 형질전환 식물체를 17일간 생장시키고 프리징 처리한 후 정상 조건에서 2주간 회복시킨 경우의 표현형을 나타낸 것이다.
도 6은 17일간 생장시킨 애기장대 식물체에 대한 프리징 어세이 결과 각 식물체의 생존률을 나타낸 것이다. 각 실험은 독립적으로 3회 반복하여 실시하였으며, 막대는 평균값±표준편차를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물 재료 및 성장조건

애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia) 씨를 5% 소듐 하이포클로라이트 및 0.05% Triton-X 100에서 5분 동안 소독하고 증류수로 5회 세척한 후, 0.8% agag와 0.5x MS (Murashige-Skoog salts, Duchefa)와 1% sucrose 농도 및 pH 5.7 배지에서 110 μmolm^-2s^{- 1} 의 빛 강도 하에서 생장시켰다. 7일 후에 흙으로 식물을 옮겨 준 후 파종 후 17일이 되는 날에 스트레스 테스트에 사용하였다. 모든 식물체는 16 hr/8 hr 낮:밤의 주기를 가지고 65% 습도를 유지하는 23도 챔버에서 생장시켰다.

실시예 2. 플라스미드 제조 및 형질전환 식물체 제조

2-1. EcGrxC 바이너리 벡터 제조

Entry vector의 제조를 위해 gateway cloning system을 이용하였다 (도 1). Gateway cloning system은 λ phage의 부위 특이적 재조합 (attB × attP → attL × attR)에 기반한다. 대장균의 약 20ng의 gDNA에서 두 종류의 Forward primer : 5'-AAA GCA GGC TCC ATG GCC AAT GTT GA-3' (서열번호 3)와 reverse priemr : 5'-AAA GCT GGG TTT TAT TTC AGC AGG GGA-3'(서열번호 4)를 이용하여 grxC 유전자를 분리 및 증폭시켰다. PCR은 1 unit의 r-Taq (Takara)를 이용하여 5cycle (94도 30초; 55도 30초; 72도 30초) 후, 30cycle (94도 30초; 60도 30초; 72도 30초)로 실시하였다. BP 재조합을 위해 두번째 PCR을 attB1 primer 5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTG CCA TGG-3' (서열번호 5) 및 attB2 primers 5'-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTA CTA GGT CAC C-3' (서열번호 6)를 이용하여 attB1 attB2 site를 PCR product 뒷부분에 만들어주었다(attB1- ORF of EcRrxC-attB2). PCR은 1 unit의 r-Taq (Takara)를 이용하여 5cycle (94도 30초; 50도 30초; 72도 30초) 후, 30cycle (94도 30초; 60도 30초; 72도 30초)로 실시하였다. BP reaction의 donor vector로는 pYJ3를 사용하였으며, pYJ3는 attP1-ccdB-attP2 cassette를 가지고 있으며, BP clonase (Invitrogen)를 이용하여 BP 부위 특이적 재조합을 시행하였다. ccdB 유전자는 attP1과 attP2 사이에 있어 재조합이 시행되었을 경우 제거되어, 유전자 재조합이 된 벡터만 선별이 가능하게 해준다. BP 재조합은 100ng의 PCR product와 40ng의 vector plasmid (pYJ3), 1㎕ of 5 X BP Clonase reaction buffer (Invitrogen), 0.2㎕ of BP Clonase enzyme mix (Invitrogen) 및 TE buffer (pH8,0)를 사용하였으며, 25도에서 1시간 재조합반응을 시킨후, 제조된 plasmid를 전기충격 트랜스포메이션 방법으로 E.coli(DH5α)에 주입한 후, 100 mg/㎕ ampicilin이 들어간 LB plate에 스프레딩 하여 단일 콜로니를 획득하였다. 획득한 콜로니를 LB 액체배지에서 배양하여 플라스미드를 대량으로 얻어 LR 재조합 방법에 이용하였다. LR 재조합에서는 attR-ccdB-attR2 cassette를 가지고 있는 pEarleygate vector를 이용하였다. ccdB 유전자는 attR1과 attR2 사이에 있어 재조합이 시행되었을 경우 제거되어, 유전자 재조합이 된 벡터만 선별이 가능하게 해준다. LR 재조합은 100ng의 재조합이 된 pYJ3와 40ng의 vector plasmid (pEarleygate), 1㎕ of 5 X LR Clonase reaction buffer (Invitrogen), 0.2㎕ of LR Clonase enzyme mix (Invitrogen) 및 TE buffer (pH8,0)를 사용하여 25도에서 1시간 배양시켰다. 재조합 반응 이후, 제조된 plsmid를 전기충격 트랜스포메이션 방법으로 E.coli (DH5α)에 주입한 후, 100 mg/㎕ kanamycin이 들어간 LB plate에 스프레딩 하여 단일 콜로니를 획득하였다. 획득한 콜로니를 LB 액체배지에서 배양하여 플라스미드를 대량으로 얻어 정제 후 sequencing 하여 E.coli grxC 유전자와 비교했을 때, 100% matching 되는 것을 확인하였다.

2-2. 과다발현된 형질전환 식물체의 제조

실시예 2-1 에서 제조된 과발현 플라스미드를 애기장대에 침지법 (floral dipping)을 통해 식물체에 형질전환시켰으며, 확보된 T1 종자를 상토에 심은 후 0.01%의 글루포시네이트 암모늄을 포함하는 BASTA 용액을 사용하여 형질전환체를 선별하고, 개체별로 T2 종자를 확보하였다. T2 종자들은 0.5 X MS, 1% Sucrose 및 50 μg/ml 의 DL 포스피노트리신(DL- phosphinothricin, PPT) 를 첨가한 배지에 파종하여 바스타(BASTA) 저항성을 가지는 개체와 민감한 개체의 수를 측향하고 콰이-스퀘어 검정법으로 p-값이 0.05 미만인 라인을 과다발현된 T-DNA가 한 카피가 삽입된 것으로 간주하였다. 표 1 은 T2 세대에서의 grxC 라인을 선별한 과정을 나타낸다.

(sum : 총 식물체, PPT R: 바스타저항성, PPT S: 바스타 민감성, X²값은 3:1의 기대비율, X²= (o-e)²/e(바스타R)+ (o-e)²/e(바스타 s); X² 이 3.84 이하인 경우 P<0.05)

선별된 T2 식물체를 한 세대 더 키워 종자를 수확한 후 다시 파종하여 PPT가 들어간 배지에서 100% 살아남는 호모 라인을 선별하였고, 식물체의 로젯 잎에서 RNA를 분리하여 각 유전자의 과다 발현 정도를 각 유전자들의 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 검출하였다 (도 2). 그 결과, 각 유전자는 각 식물체에서 일정수준 이상으로 발현하였음을 알 수 있었고, 대장균의 유전자인 만큼 WT 애기장대 (Col-0)에서는 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 표 2는 T3 세대에서의 선별 결과를 나타낸다.

실시예 3. 콜드 스트레스 처리 및 프리징 어세이

실시예 1에 기재한 조건에서 17일 동안 키운 식물체를 도 4에 나타난 바와 같이 콜드 스트레스 처리에 이용하였다. 구체적으로, 프리징 민감성에 대한 효과를 테스트 하기 위해, 애기장대 ecotype Col-0와 대장균의 grxC 가 들어간 식물체를 17일 동안 생장시켰다. 17일 동안 생장시킨 형질전환 식물체는 야생형 식물체와 비교했을 때 형태학적으로는 별 차이가 없었다 (도 3). 이후 암조건에서 8시간 -1도 처리; 빛조건에서 1시간 마다 1도를 낮추면서 -1도부터 -12도까지 처리한 후 -12도에서 2시간 처리; 다시 암 조건에서 12시간 동안 4도 처리. 프리징 후 식물체들을 정상 23도 성장 챔버에서 2주동안 생장시켰다. 정상 성장 조건 하에서 2주 동안 회복시킨 후, 특정 온도에서 전체 식물체 중 살아있는 식물체의 백분율을 계산하여 저온 저항성을 평가하였다. 실험은 16개의 식물체들에서 서로 독립적으로 세 번씩 반복하였다.

실험결과

1. 대장균의 grxC 유전자를 이용한 식물에서의 저온내성 증진

식물체에서 스트레스 발생시 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 발생하며, 이는 식물에게 치명적인 영향을 끼치게 된다. 이런 ROS 를 줄이기 위해 수많은 환원효소가 필요하며, 식물의 GRX는 약 31개가 존재한다고 알려져 있으며, GRX like protein과 같이 비슷한 기능을 한다고 알려진 유전자는 80여개가 넘는다고 알려져 있다. 식물에서의 GRX의 기능을 유추해 보기 위해 그보다 수가 적고, 식물의 GRX의 기능을 포함할 꺼라 생각되는 대장균의 grxC 유전자를 부위 특이적 재조합 방법을 이용해 클로닝 하였으며, 침지법을 이용하여 35S 프로모터로 발현되는 EcGrxC 유전자를 가지는 5개의 제조체 저항성 애기장대 형질전환체를 T2 세대에서 선별하였으며, EcGrxC 과다발현 하는 동종접합 라인들을 T3 세대에서 선택적 항생제 마커를 이용한 분리분석 (segregation analysis) 를 통해 선택 한 후, 최종 3개의 식물체를 선별하였다 (#3-6, #4-6, #5-7). 세 개의 grxC 형질전환 식물체를 가지고 저온내성 스트레스를 처리해본 결과, 애기장대 WT 식물체는 25% 만이 프리징 테스트에서 생존한 반면에, EcGrxC 과다발현 식물체인 #3-6, #4-6, #5-7는 28.1%, 34,4%, 50.0% 정도 생존하였다. 대부분의 WT식물체의 잎에서 스트레스에 의한 손상의 사인으로 잎의 황화 (leaf yellowing)가 발생하며, 살아남은 WT의 식물체들의 크기도 작은 반면에, EcGrxC 과다발현 형질전환 식물체의 경우, 생존한 식물체의 개체수 뿐만 아니라 성장 정도도 차이가 남을 확인하였다(도 5 및 도 6). 이러한 결과로 볼 때, 프리징 스트레스를 통해서 발생되는 ROS에 의해 WT의 식물체는 심각한 손상을 입고, 성장에도 영향을 끼치는 반면, EcGrxC 과다발현 형질전환 식물체의 경우 대장균의 grxC 유전자 애기장대 내에서 ROS에 의한 손상을 감소시켜 저온 내성을 증가시킬 수 있다는 것을 제시할 수 있다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Transgenic plant with enhanced tolerance to cold stress by introducing grxC gene and preparation method thereof <130> DPP20128105KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 83 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(83) <223> amino acid sequence of grxC <400> 1 Met Ala Asn Val Glu Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Cys Pro Tyr Cys His 1 5 10 15 Arg Ala Lys Ala Leu Leu Ser Ser Lys Gly Val Ser Phe Gln Glu Leu 20 25 30 Pro Ile Asp Gly Asn Ala Ala Lys Arg Glu Glu Met Ile Lys Arg Ser 35 40 45 Gly Arg Thr Thr Val Pro Gln Ile Phe Ile Asp Ala Gln His Ile Gly 50 55 60 Gly Cys Asp Asp Leu Tyr Ala Leu Asp Ala Arg Gly Gly Leu Asp Pro 65 70 75 80 Leu Leu Lys <210> 2 <211> 252 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(252) <223> nucleic acid sequence of grxC <400> 2 atggccaatg ttgaaatcta taccaaagaa acctgcccgt attgccatcg tgcaaaagca 60 ctgctgagca gcaagggcgt gagtttccag gagctgccga tcgatggcaa cgccgccaag 120 cgtgaagaga tgatcaaacg cagcggtcgc accacggttc cccagatttt tattgacgca 180 cagcacattg gcggctgtga tgacttgtat gcattggatg cacgtggtgg actggatccc 240 ctgctgaaat aa 252 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 aaagcaggct ccatgcgcat tactat 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 aaagctgggt tttatttcag cagggga 27 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 primer <400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ccatgg 36 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 primer <400> 6 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta ctaggtcacc 40

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 글루타레독신C(grxC, glutaredoxin 3) 유전자를 포함하는, 식물의 저온 스트레스에 대한 저항성 향상용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 grxC 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 grxC 유전자는 식물 발현용 재조합 벡터 형태로 포함된 것인 조성물.
6. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된, 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물 세포.
7. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된, 저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물.
8. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 글루타레독신C(grxC, glutaredoxin 3) 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는,
   저온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 형질전환 식물을 제조하는 방법.
9. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열로 이루어진 글루타레독신C(grxC, glutaredoxin 3) 유전자를 식물에 형질전환하는 단계를 포함하는,
   식물의 저온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법.
   

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