KR20110100417A

KR20110100417A - 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR20110100417A
Application number: KR1020100019398A
Authority: KR
Inventors: 김우택; 김은유; 서지호
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2010-03-04
Publication date: 2011-09-14
Also published as: KR101291365B1; WO2011108795A1

Abstract

본 발명은 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 방법 및 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 CaSRP1 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 및 생장능에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환함으로서 가뭄 내성이 탁월하거나 또는 속성재배가 가능한 신기능 식물체로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 형질전환 식물체{Gene Implicated in Drought Stress Tolerance and Growth Accelerating and Transformed Plants with the Same}

본 발명은 건조 스트레스 내성과 고속 생장에 관련된 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.

고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄, 고염(high salt), 중금속, 냉해, 열충격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 중에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며, 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 식물은 단기적 또는 장기적인 물 부족에 대해 내성을 증가시키기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반응성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시킨다. 이러한 수분 스트레스에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다(Shinozaki and Yamaguchi-shinozaki, 2007). 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

고추(Capsicum annum L.)는 감자과에 속하며, 고유의 매운 맛이 있어 널리 재배되고 있는 상업적으로 중요한 작물이다. 본 발명자들은 수분 부족 스트레스에 대한 고추의 반응에 대해 관심을 가져왔다. 앞선 연구에서, 본 발명자들은 고추에서 탈수에 의해 유도되는 유전자들을 SH(subtractive hybridization)와 dd PCR(differential-display PCR) 방법을 이용하여 분리하고 특성화 하였다(Park et al., 2003; Hong and Kim, 2005). 이 cDNA들 중에서 Ca -LEAL1(Capsicum annum late embryogenesis-abundant-like protein 1)(Park et al., 2003), Ca -DREBLP1(Capsicum annum dehydration-responsive element binding - factor - like protein 1)(Hong and Kim, 2005), CaPUB1(Capsicum annum putative U- box protein 1)(Cho et al., 2006a), CaXTHs(Capsicum annum xyloglucan endotransglucosylase / hydrolase homologs)(Cho et al., 2006b) 및 CaRma1H1(Capsicum annum RING member - anchor ubiquitin ligase homolog1)(Lee et al., 2009)은 건조 스트레스에 의해서 빠르게 유도되었다. 이들은 아마도 고추에서 건조 스트레스 반응에 대해 기능적으로 양성 또는 음성 조절자일 것이다. Ca -DSR5(Capsicum annum-drought stress responsive 5)(GeneBank 접근번호 CK327621)는 앞선 연구 결과, 고추 뿌리에서 탈수에 대해 유도되는 반응을 나타낸 유전자들 중 하나이며, 일부 유전자가 동정되었다(Hong and Kim, 2005). 이 부분적 Ca-DSR5 단백질은 콩과 애기장대의 예상되는 스트레스-관련 단백질과 상동성을 갖기 때문에 그 이름을 CaSRP1(Capsicum annum stress-related protein 1)으로 다시 명명하였다. 본 발명에서는 CaSRP1 cDNA 클론의 전체길이(GenBank 접근번호 GU373985)를 분리하였다. 분리된 CaSRP1 단백질은 스트레스-관련 단백질 뿐만 아니라, 고무나무의 SRPPs(small rubber particle proteins)과도 서열 유사성이 높았다. CaSRP1의 세포적 기능을 연구하기 위해, CaSRP1이 구조적으로 발현되는 컨스트럭트를 만들어 형질전환된 애기장대(35S: CaSRP1)를 제작하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고추의 CaSRP1 유전자가 식물의 건조 스트레스에 대한 내성에 관여하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우 개선된 건조 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인하였으며, 뿐만 아니라 상기 유전자의 발현 증가가 식물체의 생장 및 개화를 촉진시킨다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 생장 및 개화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 식물체의 건조 스트레스 내성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고추의 CaSRP1 유전자가 식물의 건조 스트레스에 대한 내성에 관여하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우 개선된 건조 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물체의 건조 스트레스 내성 증진을 위하여 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 고추의 Ca -DSR5(Capsicum annum-drought stress responsive 5)(GeneBank 접근번호 CK327621)유전자의 일부 절편인 CaSRP1의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b)상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c)식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 애기장대의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 CaMV 35S 프로모터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것(NOS 3' end)(Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 NOS 서열이다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)GV3101이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법을 사용한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 방법을 제공한다.

식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 CaSRP1 유전자를 과다발현시킨 형질전환 식물은 정상조건 하에서 발아 후 동일한 시간이 흐른 뒤에 야생종보다 긴 뿌리를 가지고, 더 넓은 잎을 가지며, 또한 꽃대가 빨리 올라오는 것을 확인함으로써 결과적으로 야생종에 비하여 빠른 개화를 보일 것으로 보인다. 이러한 CaSRP1 유전자의 또 다른 유용한 특성을 이용하여 식물체의 생장속도 및 개화속도를 향상시킴으로써 속성재배가 가능한 신기능 식물체 및 바이오매스로 응용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질전환된 생장 또는 개화가 촉진된 식물세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질전환된 생장 또는 개화가 촉진된 식물체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생장 또는 개화가 촉진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 상기 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 생장 또는 개화가 촉진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진 방법을 제공한다:

본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터 또는 이를 식물 세포에 도입시키는 방법에 대해서는 앞선 본 발명의 양태에서 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 이를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 방법 및 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성 및 생장능에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환함으로서 가뭄 내성이 탁월하거나 또는 속성재배가 가능한 신기능 식물체로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 CaSRP1 cDNA 클론의 모식도를 나타낸 그림이다(Genbank 접근번호 GU373985).
도 1b는 10개의 SRP1 유사체들의 다중 정렬을 나타낸 그림이다. CaSRP1의 아미노산 서열과 포플러, 포도, 애기장대(At1g67360, At2g47780, At1g67360), 자주개자리(alfalfa), 대두(PvSRP), 고무나무(HbSRPP), GHS(Parthenium argentatum Gray) 단백질 서열을 비교한 결과, CaSRP1 단백질은 스트레스 관련 단백질 뿐만 아니라, 고무나무의 SRPP(small rubber particle protein)과도 서열 유사도가 높았다.
도 1c는 10개의 SRP1 유사체들의 계통발생적 관계를 나타낸 그림이다. CaSRP1과 포플러, 포도, 애기장대, 자주개자리, 대두, 고무나무(HbSRPP), GHS(Parthenium argentatum Gray) 단백질 간의 유연관계를 분석한 결과, CaSRP1 단백질은 포플러 및 포도와 유연관계가 높았다.
도 2는 탈수 시 고추 잎에서의 CaSRP1 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 2주동안 키운 고추를 0, 30 및 90분 간 클린 벤치에서 바람을 쏘여주어 탈수 스트레스를 주었다. 총 RNA는 잎에서 추출했으며, CaSRP1 , CaLEAL1(양성대조군) 그리고 CaACT(음성 대조군)의 특정 프라이머로 RT-PCR 분석을 하였다. 그 결과 CaSRP1은 시간에 따라 유도되는 것을 확인 할 수 있었다. CaLEAL1 유전자도 시간에 따라 유도되는 양상을 나타내는데, 이는 CaLEAL1 유전자가 탈수에 대한 양성 마커로 탈수 스트레스가 고추에 잘 처리되었음을 말해준다.
도 3은 T3 35S: CaSRP1 형질전환 애기장대의 표현형 분석결과를 나타낸 그림이다. 야생종과 T3 35S: CaSRP1 형질전환 애기장대에서의 CaSRP1 발현을 RT-PCR로 분석한 결과, #1,2,3,4 및 7 모두 야생종에 비해 과다발현 된 것을 확인하였다(도 3a). 이들 과다발현체와 야생종과의 생장의 차이를 관찰한 결과, CaSRP1 과다발현체의 경우 야생종에 비해 유묘에서 초기 뿌리생장이 빨라 뿌리의 길이가 더 긴 것(1.2-1.3배)을 확인할 수 있었다(도 3b 및 3c). 또한 2주정도 된 CaSRP1 과다발현체의 두 번째 잎의 경우는 잎의 폭이 야생종에 비해 넓어졌으며 (1.2-1.8배), 길이(1.3-2.1배)도 길어져 엽면적이 커졌다(1.6-3.6배). 나아가 엽병의 길이도 길어졌다(도 3d 및 3e). 특히 이러한 표현형은 #7에서 가장 두드러져 엽면적의 경우 야생종에 비해 4배나 커져 속성 생장의 특성이 있는 것으로 확인된다.
도 4는 T3 35S: CaSRP1 형질전환 애기장대의 꽃대가 빨리 올라오는 표현형을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 발아한지 28일된 야생종과 CaSRP1 과다발현체를 비교하였을때, 과다발현체의 꽃대가 4-5일 정도 빨리 올라오는 것을 확인하였다(도 4a 및 4b). 이러한 표현형은 #7에서 가장 두드러져 높이가 10cm 정도 차이가 난다. 이 또한 과다발현체가 속성 생장 뿐 아니라 빠른 개화를 한다는 것을 뜻한다.
도 5는 T3 35S: CaSRP1 형질전환 애기장대에서 세포분열 및 세포신장 관련 유전자의 발현을 비교한 결과를 나타낸 그림이다. CaSRP1 과다발현체의 잎과 뿌리 생장이 증가된 것이 세포 신장 또는 증식 경로의 변화때문인지를 알아보고자 7일된 야생종과 CaSRP1 과다발현체의 유묘에서 이와 관련된 유전자들의 발현 프로파일을 RT-PCR을 통해 조사해 보았다. 세포 주기 활성에 대한 마커 유전자로 사용한 AtCYCD3와 AtDCD2b의 경우 과다발현체에서 증가하였다. 반면, 세포 신장을 위한 marker인 AtEXP5의 경우, 야생종과 동일한 발현량을 보여 변화가 없었다. 이러한 결과는 CaSRP1 과다발현체의 속성 생장이 세포 주기 관련 경로의 변화와 연관이 있다는 것으로 해석할 수 있다.
도 6은 CaSRP1 과다발현체에서 CaSRP1의 과다발현은 건조 스트레스에 대한 내성 증가에 관여한다는 사실을 확인하는 그림이다. 고추에서 CaSRP1은 탈수에 의해 빠르게 그 발현이 증가되기 때문에 건조 스트레스에 대한 반응에 CaSRP1이 관여할 가능성이 있다고 생각했다. 이 가능성을 증명하기 위해 CRWL(cut rosette water loss)를 CaSRP1 과다발현체에서 분석했다. CRWL 속도는 1시간 지난 후 부터 이미 야생종과 차이가 나기 시작하며, 4시간이 되었을 때는 그 차이가 분명해진다. 야생종의 CRWL 속도는 4시간이 지났을 때 27% 감소한 반면, 과다발현체들은 42-51% 정도 감소했다(도 6a). 이는 건조 스트레스 하에서도 과다발현체의 수분 보유량이 야생종에 비해 높다는 것을 의미한다.
또한 건조 스트레스 하에서의 과다발편체의 반응을 전체 식물 수준에서 확인하고자 3주된 야생종과 과다발현체에 7일간 물을 주지 않다가 다시 물을 준 후 3일 뒤에 생존 비율을 분석하였다. 그 결과 야생종에 비해 과다발현체의 생존 비율이 3-9배 정도 높았다(도 6b). 이러한 결과를 종합해 볼때, CaSRP1 과다발현체는 야생종에 비해 수분 결핍에 더욱 잘 견딘다는 것을 의미한다.
도 7은 CaSRP1 cDNA가 삽입된 pBI121 벡터의 유전자 지도를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

식물재료

건조시킨 고추(Capsicum annuum cv. Pukang) 및 애기장대(Arabidopsis thaliana, ecotype: Columbia(Col-0)) 종자를 30% 소듐하이포아염산염(sodium hypochlorite) 용액에 10분간 담그고(블리칭), Cho 등의 방법(2006)으로 멸균수를 이용하여 과도하게 세척하였다. 유모(seedling)는 계속적인 광조건 하의 25℃ 성장 챔버 내에서 1% 수크로스, 12 μg/ml B5 비타민 및 0.8% 아가(pH 5.7)를 함유하는 MS 배지(Murashige and Skoog medium)(Duchefa, Haarlem, Netherlands)에서 생장시켰다.

탈수 스트레스의 적용

고추식물을 2주 간 광조건 하에서 용기(pot) 내에서 성장시켰다. 전체 고추 식물은 다양한 시간(0, 30 및 90 분)동안 클린 벤치에서 Kilian 등(2007)의 방법으로 바람에 노출시켰다. 배양하는 동안, 식물은 점차 FW(fresh weight)이 감소하였다.

CaSRP1 cDNA 클론의 전장 분리

수분 스트레스를 처리한 고추의 잎으로부터 제조사의 방법에 따라 λ-uni-Zap II(Stratagene, La- Jolla, CA) cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 CaSRP1의 전장 cDNA를 PCR 증폭하였다.

센스 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해 T3 프로모터에 대응하는 벡터 특이적 프라이머(표 1)를 사용하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 Ca - DSR5 cDNA 일부분의 3’말단에 대응하는 서열로부터 디자인하였다(표 1). PCR 시 고충실도의 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며, 어닐링은 52℃에서 30초간, 연장은 68℃에서 1분간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 도입하였으며, DH5 αE.coli에 형질전환 시켰다. 12개의 콜로니 산물에서 얻은 삽입 cDNA를 시퀀싱하였다.

PCR, 클로닝 및 형질전환 식물의 제작을 위한 프라이머

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
CaSRP1 cDNA의 클로닝용
T3 프로모터	5'-attaaccctcactaaaggga-3'
CaSRP1 3' UTR		5'-cttcacacttcacagaac-3'
형질전환 식물의 제조
CaSRP1 OE	5'-gcagatctatggctgaatcaaacccc-3'	5'-gcgagctcctagttggaagccacagg-3'
RT-PCR 프라이머
CaSRP1	5'-gcagatctatggctgaatcaaacccc-3'	5'-gcgagctcctagttggaagccacagg-3'
CaLEAL1	5'-atggatctgattgacaaggc-3'	5'-tcatatctctacaacctttgatg-3'
CaACT	5'-ttggactctggtgatggtgtg-3'	5'-aacatggttgagccaccactg-3'
AtACT8	5'-tactgattacctcatgaagatccttac-3'	5'-aaacgatgtctctttagtttagaagc-3'
AtCYCD3	5'-tccggtacctcccatcag-3'	5'-gagtggctacgattgccc-3'
AtCDC2b	5'-gagcagcaatggccgg-3'	5'-cattgctaccacaccattgtg-3'
AtEXP5	5'-ggtacggcaatctgtatagc-3'	5'-gttcccacacatatattcgc-3'

RNA 분리

고추 및 형질전환 애기장대 식물의 총 RNA는 RNAiso Plus 시약(Takara)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 추출하였다. 분리된 RNA는 가능한 DNA 잔기 오염을 제거하기 위하여 제조자(Promega)의 지시에 따라 DNase I을 처리해주었다.

역전사 중합효소 연쇄반응( RT - PCR )

첫 번째 가닥 cDNA 반응 생성물 전체 50 μl 중 1 μl , 유전자 특이적 프라이머 1μM(표 1), 10 mM Tris (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴, 200μM 디옥시뉴클레오타이드 및 고충실도 Ex - Taq 폴리머라아제(Takara) 2.5 유닛을 포함하는 총 부피 50 ㎕를 이용하여 이전에 기술한 방법(Jun et al.2008)에 의하여 RT-PCR을 실시하였다. 증폭은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 27 사이클 동안 자동 써멀 사이클러(Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk,CT,USA)에서 수행하였다. PCR 산물은 1.0% 아가로스 젤에서 분리하여 UV 광산 하에서 시각화시켰다.

35S: CaSRP1 형질전환 애기장대 식물의 제작

전장 pCaSRP1 cDNA를 바이너리 벡터 pBI121(Po-Yen Chen, et al., Molecular Breeding, Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T- DNA insertion from transgenic plants, 11(4):287-293(2003)의 상응하는 부위에 도입시켰다. 제조된 35S: CaSRP1 융합 유전자를 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포주인 GV3101로 전기천공법에 의하여 형질도입 하였다. 35S: CaSRP1 컨스트럭트를 포함하는 아그로박테리움 세포를 애기장대 식물(Col-0)에 꽃 침지(floral-dip) 방법(Zhang et al.2006)으로 형질전환 시켰다. T₁ 종자는 재생된 T₀ 식물로부터 수집하였다. T₁ 종자를 30μg/ml 카나마이신을 넣은 0.5 X MS(Murashige and Skoog) 배지에서 발아시켰다. 뒤이은 자화수정으로부터 동형접합 T₃ 세포주를 얻어 표현형 분석에 사용하였다. CaSRP1 유전자의 존재 및 발현은 RT-PCR로 확인하였다.

야생종 및 형질전환 애기장대 식물의 뿌리, 잎 및 옆병의 치수 파라미터 측정

야생종 및 형질전환 애기장대 식물의 뿌리 및 잎의 성장은 몇몇 변형만을 가한 후 Seo 등(2008)에 의해 기술된 방법에 의해 모니터링 하였다. 뿌리의 성장을 검사하기 위하여, 수직 방향의 아가 플레이트(0.8% 선택 아가; Life Technology, Rockville, MD, USA)를 22℃의 계속적인 빛 조건 하에서 1-7 일간 배양하였다. 배양기간 동안, 전진하는 뿌리 말단을 영상 분석 프로그램인 SCIONIMAGE(Scion Corp., Frederic, MD, USA)로 모니터링 하였다. 2주된 야생종과 형질전환 애기장대에서 잎과 엽병을 채취하였다. 표면 면적, 길이 및 폭을 SCIONIMAGE 소프트웨어를 이용하여 측정하였다

건조 스트레스를 가해준 후의 야생종과 형질전환 애기장대 식물의 생존률 측정

정상 조건에서 자란 3주된 야생종 및 35S: CaSRP1 형질전환 식물에 7일간 물을 주지 않은 건조스트레스를 가했다. 이후 식물들에 다시 물을 주고 3일 후 표현형을 검사하였다. 생존률은 건조 스트레스 후 정상조건으로 돌아왔을 때 성장을 재개하는 능력으로 정의하였다(Cho et al. 2008).

실험결과

CaSRP1 cDNA 전장의 분리 및 그 특성

본 발명자들의 이전의 연구를 통하여, 건조 스트레스 시 빠르게 발현이 유도되는 고추 Ca - DSR5(Capsicum annuum-drought stress responsive 5) 유전자 일부가 동정된 바 있다(Hong and Kim 2005). 발현된 Ca-DSR5 단백질은 콩(soybean: PvSRP) 및 애기장대의 스트레스 관련 추정 단백질과 상동성을 보였다. 따라서, 본 발명자들은 이들 유전자들을 CaSRP1(Capsicum annuum stress-related protein 1)이라고 하고 전장 cDNA를 분리하였다. 재조합된 람다 DNA는 수분 스트레스를 처리한 고추 잎으로 구축한 λ-uni-Zap Ⅱ cDNA 라이브러리로부터 수득하였다(Cho et al. 2006b). CaSRP1의 전체 코딩 부위는 람다 DNA를 주형으로 하여 5’말단의 라이브러리 벡터 서열에 상응하는 프라이머와 Ca-DSR5 cDNA 일부의 클론의 3’비번역 부위에 상응하는 프라이머를 가지고 PCR 증폭하였다(표 1).

도 1a는 pCaSRP1의 제한효소 맵을 보여준다. pCa-SRP1 클론(GenBank 접근번호 GU373985)은 978 bp의 길이이고, 68 bp의 5’비번역 부위를, 228 아미노산을 인코딩하는 684 bp의 코딩 부위 및 226 bp의 3’비번역 부위로 이루어져 있다. CaSRP1의 예상 분자량과 계산된 등전점은 각각 24.9 kDa 및 9.27이다. 데이터베이스 검색결과 CaSRP1 서열은 아직 세포내 기능이 밝혀지지 않은 포도 및 포플러 단백질과 각각 60.5 및 58.5% 동일하다(도 1b 및 1c). 나아가, CaSRP1는 스트레스 관련 단백질로 예상되는 At3g05500, At2g47780 및 At1g67360(애기장대)와 PvSRP(대두) 및 alfalfa과 51.8-28.3%의 상동성을 가진다. 이들 단백질의 기능 역시 알려져 있지 않다. 흥미롭게도, CaSRP1는 고무나무(Hevea brasiliensis)의 SRPP(small rubber A particle protein) 및 Parthenium argentatum Gray의 SRPP의 구아율 유사체(GHS)와 상당한 정도의 서열 유사성(-46%)을 보이며, 이들은 모두 천연고무(cis-1,4-polyisoprene)를 생산한다(Oh et al. 1999; Sookmark et al. 2002; Kim et al. 2004). 현재 Hevea brasiliensis는 대부분의 상업적으로 이용되는 고분자량 천연고무를 공급하는데 반해 Parthenium argentatum Gray는 천연고무의 새로운 공급원이 될 가능성이 있다(Mooibroek and Cornish 2000).

고추 잎에서의 CaSRP1 유전자에 의한 건조 유발

CaSRP1 유전자는 탈수에 대한 반응으로 고추의 뿌리에서 빠르게 유도된다(Hong and Kim 2005). CaSRP1이 탈수시에 잎 조직에서도 고발현되는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 수분 스트레스 잎에서의 CaSRP1 전사의 정상상태(steady-state) 수준을 모니터링 하였다. 건조 스트레스 처리를 위하여, 빛조건에서 생장시킨 2주된 고추식물을 클린벤치에서 시간을 증가시키면서(0, 30 및 90분) 바람을 쏘여 주었다(Kilian et al. 2007). 이후 처리된 잎에서 총 RNA를 분리하여 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하였다. 도 2는 CaSRP1 전사의 기저 수준(basal-level)이 탈수 30분 후부터 이미 증가하기 시작함을 보여준다. mRNA 수준은 계속적으로 최소 90분간 증가하였다. 비생물학적 스트레스-유도 LEA(late embryogenesis-abundant) 유사 단백질 1을 인코딩하는 CaLEAL1 유전자(Park et al.2003)를 RT-PCR 실험의 수분 부족 양성 대조군으로 선택하였다. CaLEAL1 mRNA의 양도 물의 손실에 수반하여 증가하였다. 반대로, 고추 액틴 유전자(CaACT)의 발현은 배양하는 동안 변화가 없었다. 이러한 결과는, Hong 과 Kim(2005)이 도출한 결과와 함께, 고추의 뿌리와 잎 모두에서 CaSRP1가 탈수에 의하여 유도된다는 사실을 시사한다(도 2).

CaSRP1 -과다발현 형질전환 애기장대 식물은 대조군 식물보다 빨리 자란다.

CaSRP1 유전자의 구조(도 1) 및 발현 프로파일(도 2)은 CaSRP1이 고추식물에서의 건조 스트레스에 대한 세포수준의 반응에 관여한다는 가능성을 높여준다. 따라서, 본 발명자들은 형질전환 식물체를 이용하여 CaSRP1의 세포적 기능을 분석하고자 하였다. 형질전환 고추의 제작은 매우 어렵다고 보고된 바 있다(Seo et al. 2008). 특히, 형질전환 및 재생 수율이 충분한 독립 형질전환 식물체 라인을 수득하기엔 너무 낮다. 따라서 그 대안으로 고추 유전자를 이종 기원의 애기장대 세포에 도입할 경우에도 고추 유전자는 정상적으로 기능을 하는 것으로 보인다(Cho et al. 2006a; Cho et al. 2006b; Seo et al. 2008; Lee et al. 2009). 본 발명자들은 CaSRP1 유전자를 구조적으로 발현하는 형질전환 고추 식물의 수득에 실패하였다. 따라서, 본 발명에서는 35S CaMV 프로모터 하에서 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질도입에 의하여 형질전환 애기장대를 제작하였다. 몇몇 독립된 1차 형질전환체들이 카나마이신 저항성에 의하여 동정되었다. 이후 형질전환 식물들을 재생하여 표현형 분석에 사용하였다. 도입 유전자의 존재 및 발현수준은 RT-PCR에 의하여 확인하였다. 도 3a는 정상적인 성장조건 하에서 몇몇 독립적인 T₃ 형질전환 식물체 라인(#1, #2, #3, #4 및 #7)이 다양한 양의 CaSRP1 전사체를 가짐을 보여준다. 형질전환 식물체 라인 #3이 가장 높은 수준의 CaSRP1 mRNA를 가지고, 라인 #4는 가장 낮은 레벨을 가졌다(도 3a).

표현형 분석을 위하여, 본 발명자들은 빛 조건에서 자란 4일된 CaSRP1 과다발현 유묘가 정상 성장조건 하에서 야생종 뿌리보다 매우 긴 뿌리(1.2-1.3배)를 가진다는 사실을 발견하였다(도 3b). 형질전환 및 야생종 뿌리의 길이는 초기 유묘(발아 후 1일) 시점엔 비슷하였으나, 발아 2일 후부터 차이가 나기 시작하였다. 이후에, 뿌리 길이의 차이는 발아 후 5-7일 사이에 매우 커졌다(도 3c). 나아가, 5-7일된 형질전환체의 잎의 형태는 다소 유사해 보이지만(도 3c), 2주된 형질전환체의 잎은 야생종 애기장대 잎보다 매우 넓었다(도 3d). 야생종과 비교하여 형질전환 식물의 두 번째 옆장의 길이와 옆폭 모두 각각 1.3-2.1배 및 1.2-1.8배 증가하였다(도 3e). 옆병 길이 또한 옆장 길이 및 옆폭과 유사하게 증가하였다(도 3e). 옆장의 길이의 증가는 옆폭의 증가와 함께 일어났으며, 이로 인해 35S: CaSRP1 라인은 동일한 형태를 유지하며 커졌다. 결과적으로 독립적인 CaSRP1 과다발현체들의 면적은 야생종 보다 1.6-3.6배 커졌다.

35S: CaSRP1 식물의 고속 성장 표현형의 결과 야생종에 비하여 꽃대가 빨리 올라왔다. CaSRP1-과다발현체들은 발아 20-21일 후에 꽃대가 올라왔으나, 대조군 식물은 발아 후 약 25일 후에 꽃대가 올라왔다(도 4a). 발아 28일 후에, CaSRP1-과다발현체의 꽃대 길이는 형질전환체 라인에 따라서 7.7-12.9 cm 였던 반면, 야생종은 평균 1.0cm 였다(도 4b). 이러한 결과들을 취합했을 때, 고추 유래 CaSRP1 유전자의 이소발현(ectopic expression)이 이종기원의 애기장대 식물의 빠른 성장을 유도한다는 사실을 알 수 있으며, 이는 영양체와 생식기관 모두의 발달 촉진과 관련되어 있다.

CaSRP1 - 과다발현체들에서의 세포주기 및 신장 조절 유전자의 발현 프로파일

전술한 표현형 분석 결과에 기초하여, 본 발명자들은 CaSRP1가 세포 및 조직 발달과 연관되어 있을 것이라고 가정하였다. 35S: CaSRP1 과다발현체에서의 잎과 뿌리성장의 상승이 세포 신장 또는 증식 경로의 변화에 기인한 것인지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 세포 분열 및 세포신장에 연관된 각각의 유전자들의 발현 프로파일을 조사하였다. D-타입 싸이클린 TCYCD3CYCD3(Riou-Khamlichi et al. 1999) 및 주기-의존성 카이네이즈-연관 유전자 AtCDC2b(Yoshizumi et al. 1999)를 세포주기 활성의 마커로 선택하였다. 익스펜신(expansin) 유전자인 AtEXP5(Liet al. 2002, GenBank accession No. NM_113824)는 세포 신장의 마커로 선택하였다. 총 RNA를 빛 조건하에서 자란 7일된 야생종 및 35S: CaSRP1 유모(#2 및 #7 라인)으로부터 추출하여 유전자 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR로 분석하였다(표 1). 분석결과, CaSRP1-과다발현체 #2 및 #7의 TCYCD3CYCD3 및 AtCDC2b의 mRNA 수준은 크게 증가하였다(도 5). 반대로, AtEXP5 전사체 양은 형질전환과 대조군 유묘에서 거의 동일하였다(도 5). 따라서, 이들 결과로부터 35S: CaSRP1 형질전환 식물체의 고속성장 표현형은 세포 신장 유전자 보다는 세포주기 진행 유전자와 관련되어 있음을 예상할 수 있다.

CaSRP1 의 과다발현은 건조 스트레스에 대한 내성을 부여한다.

고추에서 CaSRP1는 탈수에 의하여 신속하게 유도되기 때문에, 본 발명자들은 CaSRP1 역시 건조 스트레스에 대한 반응에 관여할 것으로 예상하였다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 35S: CaSRP1 식물의 CRWL(cut rosette water loss) 속도(Bouchabke et al. 2008)을 측정하였다. 3주된 로젯(rosette) 잎을 야생종 및 형질전화체로부터 분리하여 페트리디쉬 위에 올린 후 뚜껑을 열고 다양한 시간(0-4h) 동안 상온에서 어두운 곳 두었다. FW(fresh weight)의 감소를 모니터링한 결과, 도 6a에서 보는 바와 같이 35S: CaSRP1 식물(#1, #2, #3 및 #7 라인)에서 분리한 로젯 잎은 야생종보다 수분손실의 속도가 느렸다. 1시간 배양 후부터 야생종 및 과다발현체의 CRWL 비율의 차이가 나타나기 시작하여, 형질전환 잎의 CRWL 비율이 대조군 잎보다 훨씬 낮아졌다. 4시간의 배양 후에는, 그 차이가 보다 명확해졌다; 야생종의 잎의 평균 FW가 최초 FW의 27%로 감소한 반면, 형질전한 잎의 FW는 독립 식물체 라인에 따라 단지 42-51%가 감소하였을 뿐이다(도 6 a).

다음 실험으로서, 형질전환 라인의 건조 스트레스에 대한 반응을 전체 식물 수준에서 검사하였다. 야생종 및 35S: CaSRP1 애기장대 식물을 3주간 포트(pot)에서 정상 조건 하에서 생장시켰다. 이후 7일 간 물을 주지 않아 토양을 건조시켰다. 이러한 건조 조건을 가한 후에 야생종은 심하게 시들면서 잎이 말렸으며, 생장이 멈추었다(도 6b). 3일간 물을 다시 준 후에도 대부분의 야생종들은 다시 생장하지 못하고 죽어 9.8%의 생존율(112개 개체 중 11개 생존)만을 보였다. 반면, 상당한 숫자의 35S: CaSRP1 형질전환체의 잎들은 7일간의 단수기간 동안에도 팽팽함을 유지했으며, 녹색을 띄었다. 3일간 물을 다시 주었을 때, 많은 CaSRP1-과다발현체들은 생장을 지속하였으며 생존율은 형질전환 라인에 따라 27.3%-87.1%를 보였다(도 6b). 따라서, 이러한 결과들은 야생종 잎보다 35S: CaSRP1 잎이 느린 CRWL 속도를 가진다는 점과 일치하며(도 6a), CaSRP1-과다발현 형질전환 식물체는 대조군보다 수분부족에 더 잘 견딘다는 사실을 시사한다. 종합하면, 도 3, 4 및 6의 데이터들은 CaSRP1가 일부 세포 및 조직 발달 뿐 만 아니라 형질전환 애기장대 식물의 가뭄에 대한 반응에도 관여한다는 사실과 일치한다. 다른 한편, 독립된 35S: CaSRP1 라인의 표현형은 CaSRP1 전사체의 수준과 완전히 일치하지 않는데(도 3a), 이는 CaSRP1 과다발현체가 CaSRP1의 전사 수준이 아니라 단백질 수준이 조절된 결과라 유추할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고 문헌

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5. Lee et al. Plant cell 21:622-641(2009)

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Gene Implicated in Drought Tolerance and Accelerating and Transformed Plants with the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1017 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 cgctctagaa ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg gcacgaggct ttcattcaat 60 tttgcgactc ttcgttctta tcgaaacctg tctgatcttt ttctgtaatg gctgaatcaa 120 accccaacgc tcaacaacca gagatggcta aggttcaaag tgaggaagag aaattgaagt 180 atttggaatt tttgcaagtg gcgatgattc atgcggcgct ctatgttgca aaggtgtatg 240 gttacgctaa ggagaattct ggtccgttga agcctggtgt tcagtctgtt gaaggcaccg 300 tcaagactgt ggttggccct gtttatgata aatttcatga tgttcctgtt gaggtgctaa 360 agtttgttga tcgcaaggtt gatcagtctg ttcgtaagat tgagactcgt gttcctccta 420 tggtcaagca agctcctgca gctgctcgct ctgttgcagc tgatgtcaag agtgctggtg 480 tgatgggagc tgcatcagga cttgctaaga cggtctatgc taagtatgag cccacagcca 540 agggacttta caccaagtac gagccaattg ccgagcaata tgctgcgtca gcttggcttt 600 ctctcaacaa aattcccatg gttcctaaag tgactcaagc agttgctcca acagctgctt 660 actattctga gaaatacaat gtgatggttc agcaaacagc agataagggt tacaaggttg 720 cttcgtttct tccatttgtg cctactgaga agattgctaa ggtgttcggt actcagcctg 780 tggcttccaa ctagaaagga cctactgctt tgctttatgg ctcctacgca actagtagtt 840 tagttccttt tgaggggctc catgtgatct ggagtgcctt ggaacggtta ttatttgctt 900 attgtgttgt gggttgtttg ttctgtgaag tgtgaagtaa tcgtgtgttt gtctattcgg 960 ttttcatttt tgaaaaattg tgattaattt ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1017 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Ala Glu Ser Asn Pro Asn Ala Gln Gln Pro Glu Met Ala Lys Val 1 5 10 15 Gln Ser Glu Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Glu Phe Leu Gln Val Ala 20 25 30 Met Ile His Ala Ala Leu Tyr Val Ala Lys Val Tyr Gly Tyr Ala Lys 35 40 45 Glu Asn Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Gln Ser Val Glu Gly Thr 50 55 60 Val Lys Thr Val Val Gly Pro Val Tyr Asp Lys Phe His Asp Val Pro 65 70 75 80 Val Glu Val Leu Lys Phe Val Asp Arg Lys Val Asp Gln Ser Val Arg 85 90 95 Lys Ile Glu Thr Arg Val Pro Pro Met Val Lys Gln Ala Pro Ala Ala 100 105 110 Ala Arg Ser Val Ala Ala Asp Val Lys Ser Ala Gly Val Met Gly Ala 115 120 125 Ala Ser Gly Leu Ala Lys Thr Val Tyr Ala Lys Tyr Glu Pro Thr Ala 130 135 140 Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Tyr Glu Pro Ile Ala Glu Gln Tyr Ala Ala 145 150 155 160 Ser Ala Trp Leu Ser Leu Asn Lys Ile Pro Met Val Pro Lys Val Thr 165 170 175 Gln Ala Val Ala Pro Thr Ala Ala Tyr Tyr Ser Glu Lys Tyr Asn Val 180 185 190 Met Val Gln Gln Thr Ala Asp Lys Gly Tyr Lys Val Ala Ser Phe Leu 195 200 205 Pro Phe Val Pro Thr Glu Lys Ile Ala Lys Val Phe Gly Thr Gln Pro 210 215 220 Val Ala Ser Asn 225

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물.
(a) 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진용 조성물.
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 건조 스트레스 내성이 증진된 식물세포.
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 건조 스트레스 내성이 증진된 식물체.
다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법:
(a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
(b) 상기 식물세포로부터 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 내성 증진 방법.
서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물.
(a) 상기 제 9 항 또는 제 10 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진용 조성물.
상기 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 생장 또는 개화가 촉진된 식물세포.
상기 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 생장 또는 개화가 촉진된 식물체.
다음의 단계를 포함하는 생장 또는 개화가 촉진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법:
(a) 상기 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및
(b) 상기 식물세포로부터 생장 또는 개화가 촉진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
상기 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 식물체의 생장 또는 개화 촉진 방법.