KR102077511B1

KR102077511B1 - 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102077511B1
Application number: KR1020190024508A
Authority: KR
Inventors: 이형석; 박현; 이정은; 김우택; 변미영; 최려화
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2019-03-04
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2020-02-14
Also published as: KR20190083626A

Abstract

본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 에 관한 것으로, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2) 유전자 및 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2 (Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2)를 이용한 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법; 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법; 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질 전환 식물체; 이의 종자; 및 상기 DaGolS2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자 및 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2 (Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 환경 스트레스에 대한 내성이 탁월하므로, 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도{Novel Gene Implicated in Plant Environmental Stresses Tolerance and Use Thereof}

본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 에 관한 것이다.

식물은 고정된 생착 환경 내에서 건조, 고염, 냉해, 중금속, 열충격, 홍수 및 오존과 같은 다양한 환경 스트레스에 지속적으로 직면하게 되며, 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되어 작물생산 감소 및 경작환경 제한으로 인한 경작지 감소의 주요 원인이 된다.

환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서, 수분 스트레스, 저온 스트레스, 염해 스트레스, 산화 스트레스 등이 있다. 특히 수분 스트레스는 탈수, 고염도 및 저온과 같은 외부 환경에 의해 유발되며, 식물의 생장을 저해하는 환경 스트레스에 있어서 가장 가혹한 스트레스 중의 하나이다.

한편, 식물은 상기 스트레스에 대한 방어 기작을 가지고 있어서 생육에 부적합한 환경에 처하게 되면 그들의 형태를 조절하거나 생리적 대사과정을 조절함으로써 환경에 적응하여 생존하고자하는 경향이 있다. 상기 스트레스 조건을 극복하기 위해, 식물은 신속하고 효율적인 유전자 발현 프로그램을 통해 스트레스 적응 또는 내성과 연관된 수많은 유전자를 발현한다. 수많은 스트레스-유도성 유전자들이 다양한 식물 종에서 밝혀진 바 있고, 상기유전자 산물의 기능이 보고된 바 있다(Lushchak, 2011 Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 153, 175-190).

즉, 식물은 비생물학적 스트레스에 노출된 이후, 유전자 발현의 패턴에서 일련의 변화가 일어나며, 이러한 반응은 성장속도, 생산성 및 종 분포에 영향을 미친다.

특히, 열대 또는 아열대 원산지를 갖는 곡물류인 벼는 종종 저온 손상을 받으며, 이러한 손상을 받은 식물체는 퇴록, 괴사 또는 생장 지연과 같은 다양한 증상을 나타낸다 (De Datta, 1981). 온대 지역에서, 벼는 종종 개화시기 뿐 아니라 유식물체 단계에서도 저온 손상에 직면하게 된다.

저온-반응 기전을 이해하기 위하여, 연구자들은 몇 종의 식물체에서 저온-유도성 단백질을 코딩하는 다수의 유전자를 분리하였으며(Guy, 1999; Thomashow, 1999), 저온 하에서 유도되는 유전자들은 다양한 유전산물을 생성시킴으로써 세포를 보호하는 기능을 하는 것으로 예측되었다. 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스-관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반응 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.

남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)은 남극 지방의 가혹한 환경에서 번성하는 유일한 단자엽 식물로서, 환경 스트레스에 대응하는 고등식물의 방어 메카니즘 연구에 매우 유용한 식물이다. 최근 남극좀새풀을 이용하여 저온, 건조 및 염 스트레스에 대한 내성에 관여하는 유전자를 발굴하고자 하는 노력이 계속 되어오고 있지만, 아직 남극좀새풀 내 환경 스트레스 저항성을 조절하는 유전자는 거의 밝혀진 바가 없다. 본 발명자들은, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 및 벼(Oryza sativa (japonica))에 존재하는 갈락티놀 합성효소 2 (galactinol synthase 2)와 상동성을 가지는 유전자들(상동체)을 탐색한 결과, 고염, 냉해 및 건조 스트레스에 관여하는 신규한 유전자들을 동정하였고, 이를 각각 DaGolS2 (Deschampsia antarctica Desv. Galactinol synthase 2) 및 OsGolS2 (Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2)라 명명하였다.

본 발명자들은 신규 유전자로서 상기 DaGolS2 및 OsGolS2와 비생물학적 스트레스의 관계를 최초로 규명하였다.

본 발명자들은 식물의 비생물학적 스트레스, 특히 저온 및 건조에 의해 발생하는 환경 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴함으로써 궁극적으로 식물의 생산성을 향상시키고 경작지 제한을 극복하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2 유전자 또는 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2 유전자의 발현을 대상 식물체에서 증가시킬 경우 상술한 환경 스트레스에 대하여 내성이 강화된다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식물의 환경 스트레스 내성 증진 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 환경 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물의 환경 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스(environmental stresses)에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다:

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 또는

서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;

를 제작하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터 중 1 종 이상을 식물세포에 형질전환시켜 GolS2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계.

본 발명에서 사용되는 용어 "환경 스트레스"는 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress) 및 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 구별된다.

생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 건조, 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 고염, 저온(냉해), 건조, 강한 빛, 고온, 과산화수소 또는 메틸비올로겐 스트레스일 수 있고, 바람직하게는 고염, 저온(냉해) 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 본 발명의 상기 (a) 단계의 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 또한, 상기 (a) 단계의 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3로 표시된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명에 따르면, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열은 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 가해준 뒤 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과, 대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 새롭게 밝혀진 남극좀새풀 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며, 이 유전자의 이름은 본 발명자들에 의해 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2)로 명명되었다.

또한, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열은 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 가해준 뒤 유전자 발현 프로파일을 조사한 결과, 대조군에 비해 발현이 유의적으로 증가하는 것으로 새롭게 밝혀진 벼 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며, 이 유전자의 이름은 본 발명자들에 의해 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2)로 명명되었다.

후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 유전자들을 각각 과발현시킨 식물체는 다양한 비생물학적 스트레스가 가해지는 환경에서도 그 생존률이 크게 증가함을 확인하였다.

*본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Desv. Galactinol synthase 2) 단백질의 범위는 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

마찬가지로, 본 발명에 따른 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질의 범위는 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.)로부터 분리된 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

상기 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 DaGolS2 유전자 서열 또는 OsGolS2 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 (a) 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.

본 명세서에서 용어 "바이너리 벡터"는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 구체적으로는 전기천공법(electroporation)을 사용한다.

특정 뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 환경 스트레스(environmental stresses)에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다:

중 1 종 이상을 식물세포에 형질전환시켜 GolS2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 환경 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

본 발명에서 이용되는 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 재조합 벡터에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체의 제조는 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263-271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182 (1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 각 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "식물(체)"는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물을 포함하며, 바람직하게는 단자엽 식물이다.

상기 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다.

상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다.

상기 쌍자엽 식물체는 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana)일 수 있고, 단자엽 식물체는 바람직하게는 벼(Oryza sativa)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자; 를 포함하는, 식물의 환경 스트레스(environmental stresses) 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터에 포함된 형태로 포함할 수 있다. 상기 유전자들은 식물체의 환경 스트레스 내성을 증진시키는 효과가 우수하다.

본 발명의 조성물은 상술한 아미노산 서열, 뉴클레오타이드 서열 및 이들을 포함하는 재조합 벡터를 이용하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 남극좀새풀(Deschampsia antarctica Desv.) 유래의 DaGolS2(Deschampsia antarctica Desv. Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자; 또는 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 환경 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 각각 과발현시킨 형질전환 식물체는 환경 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후나 환경에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 다른 외떡잎 식물로부터의 상동체(homologs)와 본 발명의 남극좀새풀 및 벼에서 각각 분리한 갈락티놀 합성효소 2(galactinol synthase 2) 유전자 2 종 (DaGolS2, OsGolS2)의 계통학적 분석 결과를 보여준다. 외떡잎식물은 대부분 2개의 상동유전자를 가지고 있고(Monocot type I, II), 쌍떡잎 식물은 더 많은 수의 상동유전자를 가지고 있어서 애기장대의 경우 7개의 상동유전자를 가진다. 외떡잎식물에 존재하는 두 개의 상동유전자들은 종에 상관없이 type I과 type II로 구분되므로 쌍떡잎식물의 조상 초기에 유전자 복제가 일어난 후 종분화가 일어났을 것으로 추측된다.
도 2는 본 발명의 남극좀새풀에서 분리한 갈락티놀 합성효소 2(galactinol synthase 2) 유전자인 DaGolS2의 다양한 비생물학적 환경 스트레스(냉해, 건조, 고염) 조건에서의 발현 분석 결과를 보여준다. 다양한 비생물학적 환경 스트레스(냉해, 건조, 고염)를 처리한 남극좀새풀 식물체 내 DaGolS2 발현 양상에 대한 qPCR 분석 결과, DaGolS2는 저온과 건조 스트레스에 의해 유전자 발현이 증가하였고, 고염 스트레스에서는 별다른 차이를 보이지 않았다. 왼쪽의 수직 축은 유전자 전사체 양의 상대적 비율을 내부 대조군인 DaEF1과 비교하여 상대적 비율로 표시하였다.
도 3은 본 발명의 벼에서 분리한 갈락티놀 합성효소 2(galactinol synthase 2) 유전자인 OsGolS2의 비생물학적 환경 스트레스(건조, 고염) 조건에서의 발현 분석 결과를 보여준다. 비생물학적 환경 스트레스(건조, 고염) 를 처리한 벼 식물체 내 OsGolS2 발현 양상에 대한 RT-PCR 분석 결과, OsGolS2는 건조와 고염 스트레스에 의해 발현이 증가하였다. 내부 대조군인 OsUbiQ10은 발현변화가 없는 하우스키핑 유전자이고, OsRab16b는 환경스트레스에 의해 발현이 변화하는 양성 대조군으로 사용하였다.
도 4는 DaGolS2 과다발현 식물체(#1 및 #2)와 야생형 벼(WT)의 냉해 스트레스에 대한 저항성을 비교한 결과를 보여준다. 약 6 주된 식물을 4℃ 저온 챔버에서 5 일 내지 8 일 간 배양한 후 다시 정상조건인 28℃에서 키우며 생장을 비교해본 결과 DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 냉해 스트레스에 대해 저항성이 3 배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 5는 DaGolS2 과다발현 식물체(#1 및 #2)와 야생형 벼(WT)의 건조 스트레스에 대한 저항성을 비교한 결과를 보여준다. 약 6 주된 식물을 건조 조건 하에서 16 일 간 배양한 후 다시 정상적으로 물을 주어 키우며 생장을 비교해본 결과 DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 건조 스트레스에 대해 저항성이 2 배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 OsGolS2 과다발현 식물체(#1 및 #2)와 야생형 벼(WT)의 냉해 스트레스에 대한 저항성을 비교한 결과를 보여준다. 약 6 주된 식물을 4℃ 저온 챔버에서 7 일 간 배양한 후 다시 정상조건인 28℃에서 키우며 생장을 비교해본 결과 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 냉해 스트레스에 대해 저항성이 3 배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 OsGolS2 과다발현 식물체(#1 및 #2)와 야생형 벼(WT)의 건조 스트레스에 대한 저항성을 비교한 결과를 보여준다. 약 6 주된 식물을 건조 조건 하에서 20 일 간 배양한 후 다시 정상적으로 물을 주어 키우며 생장을 비교해본 결과 DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체가 야생형 벼보다 건조 스트레스에 대해 저항성이 3 배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 8은 DaGolS2 과다발현 식물체와 OsGolS2 과다발현 식물체 및 야생형 벼(WT)의 냉해 스트레스에서 체내 갈락티놀과 라피노스의 함량 변화를 보여준다. 정상조건인 28℃에서 2 주간 배양한 식물체와 이들을 냉해 조건인 4℃ 저온 챔버에 옮겨 10일 간 배양한 식물체를 대상으로 체내 갈락티놀(galactinol)과 라피노스(raffinose)의 함량을 측정하여 비교하였다. 두 가지 과다발현 식물체의 경우 공통적으로 정상 조건에서도 더 많은 량의 갈락티놀과 라피노스를 함유하고 있었다. 또한 냉해 조건에서 야생형 벼의 경우 두 가지 당의 함량이 증가했으나, 과다발현 식물체의 경우 더욱 급격하게 증가하여 체내에서 과발현된 GolS2 유전자가 식물체 내 당의 함량에 많은 영향을 미쳤음을 알 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

유전자 클로닝

DaGolS2의 경우, 종래에 보고된 transcriptome 데이터(Lee et al., 2013)로부터 Setaria italica의 GolS2(galactinol synthase 2, 진뱅크 접근번호 XP_004984579.1)에 대한 전체 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 알고리즘을 통해 전체 유전자 서열을 수득하여 DaGolS2라 명명하였다.

OsGolS2의 경우, NCBI 염기서열 데이터베이스로부터 종래에 보고된 Setaria italica의 GolS2(galactinol synthase 2, 진뱅크 접근번호 XP_004984579.1)에 대한 전체 아미노산 서열을 이용한 tBLASTN 알고리즘을 통해 Oryza sativa Japonica Group의 GolS2(galactinol synthase 2, 진뱅크 접근번호 XP_015645380.1)에 대한 전체 유전자 서열을 수득하여 OsGolS2라 명명하였다.

식물체 배양

남극좀새풀의 경우, 자연조건에서 생장한 남극좀새풀[Deschampsia antarctica Desv.(Poaceae)]을 킹 조지섬 바톤 반도의 대한민국 세종 남극기지 인근(62°14'29"S; 58°44'18"W)에서 채집하였다. 채집한 식물을 연구실로 옮긴 후 2% 수크로오스를 포함하는 0.5X MS(Murashige and Skoog)배지를 공급하면서 150 μmol m^-2 s^-1의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건 하에서 남극좀새풀의 루비스코(RuBisCo) 활성이 높아지는 15℃(Pet et al., 2006)에서 수경재배하였다.

벼의 경우, 야생형 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 세척한 종자를 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 키운 후, Sunshine MIX #5 (Sun Gro Horticulture)와 수도용 상토를 섞어서 만든 흙에 심어서 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 성장시켰다.

RT-PCR을 이용한 유전자 발현 양상 분석

RNeasy Plant 미니 킷(Qiagen)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 식물 샘플의 잎으로부터 총 RNA를 추출하였다. Superscript (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 시료에서 추출한 1 μg 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

DaGolS2의 경우, 유전자 특이적 프라이머는 DaGolS2의 서열에 따라 설계하였다; DaGolS2 정방향 프라이머(서열번호 5) (5'-GACGTGTACAAGCCCATCCC-3'), 및 역방향 프라이머(서열번호 6) (5'-TGAACGACCTTCACCTTGCC- 3'). 대조군 유전자인 DaEF1를 내부 대조군으로 사용하였다: DaEF1 정방향 프라이머(서열번호 7) (5'-TTTGTCCACTGCTACACTCGTGGT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 8 (5'-TCGAAGGCTGACGGACATAACCAA-3'). 생물학적으로 복제된 샘플을 가지고 SYBR Premix Ex Taq™ DNA 폴리머레이즈(Takara) 및 Mx3000P 실시간 PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 세 번 수행하였다.

OsGolS2의 경우, 유전자 특이적 프라이머는 OsGolS2의 서열에 따라 설계하였다; OsGolS2 정방향 프라이머(서열번호 9) (5'-GTCAAGGACTGCTTCTGCGA-3'), 및 역방향 프라이머(서열번호 10) (5'-GGGGATGGGCTTGTACTGTT-3'). 대조군 유전자인 OsUbiQ10를 내부 대조군으로 사용하였다: OsUbiQ10 정방향 프라이머(서열번호 11) (5'-ATGCAGATCTTTGTGAAGACATTG―3') 및 역방향 프라이머(서열번호 12) (5'-TTACTGACCACCACGGAGGC-3'). 생물학적으로 복제된 샘플을 가지고 SYBR Premix Ex Taq™ DNA 폴리머레이즈(Takara, Seoul, Korea) 및 Mx3000P 실시간 PCR 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 이용하여 qPCR을 세 번 수행하였다.

유전자 과다발현 컨스트럭트 제작

DaGolS2 또는 OsGolS2를 과다발현시키는 플라스미드를 재조합하기 위해 각 유전자의 코딩 부분의 5' 및 3' 쪽에 해당하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물을 pENTR SD-TOPO 벡터(Invitrogen)에 삽입한 후, LR 크로나아제 효소(Invitrogen)를 이용하여 유비퀴틴 프로모터 하에서 유전자를 과다발현시키는 pGA2897 벡터에 치환시켰다. 대장균에서 플라스미드를 추출한 후 이를 아그로박테리움(LBA4404)에 전기천공법을 이용하여 삽입하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다.

과다발현 형질전환체 제작

과다발현 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움을 이용한 벼 조직배양을 수행하였다. 캘러스 유도 배지(CHU media)에서 약 7일간 키운 캘러스에 아그로박테리움을 감염시킨 후 200 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)을 포함하는 배지에서 4일간 배양한 후 함께 자란 아그로박테리움을 수세하고 항생제가 들어있는 캘러스 유도배지로 옮겨주었다. 항생제 선별과정에서 새롭게 자란 캘러스를 옥신과 싸이토키닌이 들어있는 재분화배지에 옮겨 식물로 재분화시킨 후 흙으로 옮겨 순화과정을 거친 뒤 흙으로 옮겨 온실조건에서 키워 T0 세대의 식물을 획득하였다.

벼 식물체 배양

야생형, DaGolS2 및 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, 2,4-D (2 mg/L), 0.03% 카제인 수화물, 25 mM L-프롤린, 0.2% 젤라이트로 구성된 CHU 배지(Duchedfa Biochemie)에 심은 후 약 1주간 생장 챔버(16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 28℃)에서 키워 캘러스(callus)를 유도하여 조직배양의 재료로 사용하였다. 같은 방법으로 소독한 종자를 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 키운 후, Sunshine MIX #5 (Sun Gro Horticulture)와 수도용 상토를 섞어서 만든 흙에 심어서 약 3주간 생장 챔버(16시간 광/8시간 암, 28℃ 조건)에서 성장시키고 이를 온실에 옮겨 약 4 달간 키운 후 종자를 수득하였다.

RT-PCR을 이용한 과다발현 확인

과다발현 돌연변이 식물체에서 유전자의 발현을 확인하기 위하여 전체 RNA를 추출하고 올리고 dT 프라이머와 M-MLV 역전사효소(Enzynomics)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Intron) 2.5 ㎕, dNTP 혼합액(각 2.5 mM) 2 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Intron)를 넣어 총 부피를 25 ㎕ 로 만들고 BioRad 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 95℃에서 3분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 28회 수행하였고, 28회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1과 같다.

RT-PCR에 사용된 유전자의 프라이머

프라이머	서열
DaGolS2 RTFW(서열번호 5)	GACGTGTACAAGCCCATCCC
DaGolS2 RTRV(서열번호 6)	TGAACGACCTTCACCTTGCC
DaEF1 RTFW(서열번호 7)	TTTGTCCACTGCTACACTCGTGGT
DaEF1 RT RV(서열번호 8)	TCGAAGGCTGACGGACATAACCAA
OsGolS2 RT FW(서열번호 9)	GTCAAGGACTGCTTCTGCGA
OsGolS2 RT RV(서열번호 10)	GGGGATGGGCTTGTACTGTT
OsUbiQ10 RT FW(서열번호 11)	ATGCAGATCTTTGTGAAGACATTG
OsUbiQ10 RT RV(서열번호 12)	TTACTGACCACCACGGAGGC

저온(냉해) 스트레스 처리

남극좀새풀에서 저온 스트레스에 의한 DaGolS2의 발현 변화를 조사하기 위하여, 2% 수크로오스와 0.5X MS(Murashige and Skoog), 0.7% 아가로 구성되어 있는 배지에 옮긴 배양체를 150 μmol m^-2 s^-1의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 15℃ 생장 챔버에서 3주동안 키운 뒤 4℃ 저온챔버로 옮겨 일정시간동안 처리하고 샘플링하여 RNA 추출에 사용하였다.

야생형, DaGolS2 및 OsGolS2 과다발현 돌연변이 벼 식물체의 저온 스트레스에 대한 저항성을 비교하기 위하여, 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2 주간 생장 챔버(16 시간 광/ 8시간 암, 28℃ 조건)에서 배양하고 흙으로 옮겨 4주 동안 키운 뒤 실험에 사용하였다. 약 6주 된 식물을 7일 동안 4℃의 저온 챔버에서 키운 후, 다시 28℃의 생장 챔버로 옮겨 키우며 생장을 관찰하는 방법으로 저온 스트레스에 대해 내성을 갖는 정도를 비교하였다.

건조 스트레스 처리

남극좀새풀에서 건조 스트레스에 의한 DaGolS2의 발현변화를 조사하기 위하여, 2% 수크로오스와 0.5X MS(Murashige and Skoog), 0.7% 아가로 구성되어 있는 배지에 옮긴 배양체를 150 μmol m^-2 s^-1의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 15℃ 생장 챔버에서 3주동안 배양하였다. 각 배양체에서 배지를 제거하고 여과지에 올려놓고 건조 시킨 후, 샘플링하여 RNA 추출에 사용하였다.

벼에서 건조 스트레스에 의한 OsGolS2의 발현변화를 조사하기 위하여, 야생형 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하고, 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 28℃ 생장챔버에서 배양하였다. 10일동안 키운 배양체를 여과지에 올려놓고 건조 시킨 후, 샘플링하여 RNA 추출에 사용하였다.

야생형, DaGolS2 및 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 비교하기 위하여, 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, B5 비타민(12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광/ 8시간 암, 28℃ 조건)에서 키우고 이를 흙으로 옮겨 4주 동안 키운 뒤 실험에 사용하였다. 16일에서 20일 동안 물을 주지 않고 식물을 키우며 변화를 관찰한 후 다시 물을 주며 식물의 생장을 관찰하여 건조 스트레스에 대해 내성을 갖는 정도를 비교하였다.

고염 스트레스 처리

남극좀새풀에서 고염 스트레스에 의한 DaGolS2의 발현변화를 조사하기 위하여, 2% 수크로오스와 0.5X MS(Murashige and Skoog), 0.7% 아가가 첨가된 배지에 배양체를 옮겨 150 μmol m^-2s^-1의 광강도로 16시간 광 조건/ 8시간 암 조건, 15℃에서 생장챔버에서 3주동안 키운 뒤, 150mM 염화나트륨이 들어있는 액체 MS 배지에 넣고 고염 스트레스를 처리한 후, 샘플링하여 RNA 추출에 사용하였다.

벼에서 고염 스트레스에 의한 OsGolS2의 발현변화를 조사하기 위하여, 야생형 종자를 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 30분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하고, 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 28℃ 생장챔버에서 배양하였다. 10일동안 키운 배양체를 300mM 염화나트륨이 들어있는 액체 MS 배지에 넣고 고염 스트레스를 처리한 후, 샘플링하여 RNA 추출에 사용하였다.

실시예 1. 비생물학적 스트레스별 각 유전자의 발현 양상

1-1. 남극좀새풀에서 DaGolS2 발현 양상 확인

본 발명자들은 다양한 비생물학적 스트레스(냉해, 고염, 건조) 조건 하에서의 DaGolS2 발현 변화를 조사하고자 남극좀새풀 식물체에 다양한 비생물학적 스트레스를 처리하여 DaGolS2 발현 수준을 내부 대조군인 DaEF1와 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 고염 스트레스 조건 하에서는 DaGolS2 발현이 유의하게 증가하지 않았으나, 반면 저온 및 건조 스트레스 조건 하에서는 DaGolS2 발현이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 벼에서 OsGolS2 발현 양상 확인

본 발명자들은 비생물학적 스트레스(고염, 건조) 조건 하에서의 OsGolS2 발현 변화를 조사하고자 벼 식물체에 건조와 고염 스트레스를 처리하여 OsGolS2 발현 수준을 내부 대조군인 OsUbiQ10와 비교하였다. 이때, OsRab16b는 환경 스트레스에 의해 발현이 변화하는 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 건조 및 고염 스트레스 조건 하에서 OsGolS2 발현이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. DaGolS2 과다발현 형질전환체의 환경 스트레스 표현형 분석

2-1. DaGolS2 과다발현 형질전환체의 저온 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 저온(냉해) 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 6 주된 DaGolS2 과다발현 식물과 야생종에 저온 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 4℃의 조건에서 5일 내지 8일 간 배양하여 저온 스트레스를 처리한 후 정상조건인 28℃에서 다시 배양하며 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔으나, DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성(저항성)이 탁월하게 증진된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 저온 스트레스 조건 하에서, 야생종의 생존율에 비해, DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 생존율은 3 배 이상 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

2-2. DaGolS2 과다발현 형질전환체의 건조 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 건조 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 6 주된 DaGolS2 과다발현 식물과 야생종에 건조 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 약 6 주된 식물을 건조 조건 하에서 16 일 간 배양한 후 다시 정상적으로 물을 주어 배양하며 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔으나, DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 건조 스트레스에 대한 내성(저항성)이 탁월하게 증진된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 건조 스트레스 조건 하에서, 야생종의 생존율에 비해, DaGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 생존율은 2 배 이상 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 DaGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 건조 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. OsGolS2 과다발현 형질전환체의 환경 스트레스 표현형 분석

3-1. OsGolS2 과다발현 형질전환체의 저온 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 저온(냉해) 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 6 주된 OsGolS2 과다발현 식물과 야생종에 저온 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 4℃의 조건에서 7일 간 배양하여 저온 스트레스를 처리한 후 정상조건인 28℃에서 다시 배양하며 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔으나, OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 OsGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성(저항성)이 탁월하게 증진된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 저온 스트레스 조건 하에서, 야생종의 생존율에 비해, OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 생존율은 3 배 이상 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 OsGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 저온 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

3-2. OsGolS2 과다발현 형질전환체의 건조 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 건조 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자 6 주된 OsGolS2 과다발현 식물과 야생종에 건조 스트레스를 처리하여 저항성을 비교하였다. 약 6 주된 식물을 건조 조건 하에서 20 일 간 배양한 후 다시 정상적으로 물을 주어 배양하며 성장을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 야생종은 식물이 생장이 멈추고 시들어갔으나, OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체는 지속적으로 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 OsGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 건조 스트레스에 대한 내성(저항성)이 탁월하게 증진된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 건조 스트레스 조건 하에서, 야생종의 생존율에 비해, OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체의 생존율은 3 배 이상 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 OsGolS2의 과다발현 형질전환 식물체가 야생종에 비하여 건조 스트레스에 대한 내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 실시예 3의 OsGolS2 과발현체의 표현형은 DaGolS2 형질전환체와 거의 동일한 것으로 나타났으므로, 본 발명의 벼와 남극좀새풀의 유전자 2 종은 진화적으로 보존되어 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 4. DaGolS2 과다발현, OsGolS2 과다발현 형질전환체의 환경 스트레스 표현형 분석

4-1. GolS2 과다발현 형질전환체의 저온 스트레스 표현형 분석

본 발명자들은 야생형 벼(WT), DaGolS2 과다발현 돌연변이 및 OsGolS2 과다발현 돌연변이 식물체(형질전환체)의 저온(냉해) 스트레스에 대한 내성 변화를 조사하고자, 정상조건인 28℃에서 2 주간 배양한 식물체와 이들을 냉해 조건인 4℃ 저온 챔버에 옮겨 10일 간 배양한 식물체를 대상으로 체내 갈락티놀(galactinol)과 라피노스(raffinose)의 함량을 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 두 가지 과다발현 식물체의 경우 공통적으로 정상 조건에서도 더 많은 양의 갈락티놀과 라피노스를 함유하고 있었다. 또한, 냉해 조건에서 야생형 벼의 경우 두 가지 당의 함량이 증가했으나, 과다발현 식물체의 경우 더욱 급격하게 증가하여 체내에서 과발현된 GolS2 유전자가 식물체 내 당의 함량에 많은 영향을 미쳤음을 알 수 있다.

이러한 식물체 내 갈락티놀과 라피노스 두 종의 당 함량을 분석한 결과는, 과다발현 식물체에서 야생형에 비해 두 종의 당이 모두 증가했기 때문에 이들이 식물의 환경스트레스 저항성을 부여하는 데 관여한다는 것을 제시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Novel Gene Implicated in Plant Environmental Stresses Tolerance and Use Thereof <130> KIOST-1-21p <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1011 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Deschampsia antarctica Desv. <400> 1 atggctcccg agctggccgg caagatgacc gccaaggctg ccgtggcgac atcgaagccc 60 gcgacgaagg ccttcgtgac gttcctggcc ggcgacggtg actactggat gggtgtggtt 120 gggctggcca agggcctgcg caaggcgggc tcggcatacc cgcttgtgtt ggccgtgctg 180 cccgacgtgc ccgagtccca ccgccgcata ctcgtctccc agggctgcat catccgcgag 240 atcgtccccg tttacccgcc cgagaaccag acccagttcg ccatggccta ctacgtcatt 300 aactattcaa agctccgcat ctgggagttt gtggagtacg agaggatggt gtacctcgac 360 gccgatatcc aggtgttcga caacatcgac gagttgttcg atctgcccaa ggggcacttc 420 tacgccgtga tggactgctt ctgtgagaag acgtggagcc atacgccgca gtaccagatc 480 ggctactgcc agcagtgccc cgacaaggtg acgtggccga gcgccgagat ggggccgccg 540 ccggcactct acttcaacgc cggcatgttc gtgcacgagc ccagcatggc caccgccaaa 600 gcgctcctcg agaccctccg cgtgtctccg accactccat tcgcagagca ggatttcctg 660 aacatgttct tcagggagca atacaagccg atccccctgg tgtacaacct tgtgctggcg 720 atgctctgga ggcacccgga gaatgtccag ctcgagaagg tcaaagtcgt gcactactgc 780 gcagcgggat cgaagccgtg gaggttcact ggcaaggagg ccaacatgga caggaaggac 840 atcaagatac tcgtcaggaa ttggtggaac atctacaacg acgagagcct cgacttcaac 900 cgcgtgcctg tcgacgccga cgatgtcgag gcggccgcga agaagccgat ccatgctgca 960 ctggaggagg ccggcactgt caagttcata actgcgccat tggccgcgtg a 1011 <210> 2 <211> 337 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Deschampsia antarctica Desv. <400> 2 Met Ala Pro Glu Leu Ala Gly Lys Met Thr Ala Lys Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Thr Ser Lys Pro Ala Thr Lys Ala Phe Val Thr Phe Leu Ala Gly Asp 20 25 30 Gly Asp Tyr Trp Met Gly Val Val Gly Leu Ala Lys Gly Leu Arg Lys 35 40 45 Ala Gly Ser Ala Tyr Pro Leu Val Leu Ala Val Leu Pro Asp Val Pro 50 55 60 Glu Ser His Arg Arg Ile Leu Val Ser Gln Gly Cys Ile Ile Arg Glu 65 70 75 80 Ile Val Pro Val Tyr Pro Pro Glu Asn Gln Thr Gln Phe Ala Met Ala 85 90 95 Tyr Tyr 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Asp Val Glu Ala Ala Ala Lys Lys Pro Ile His Ala Ala 305 310 315 320 Leu Glu Glu Ala Gly Thr Val Lys Phe Ile Thr Ala Pro Leu Ala Ala 325 330 335 *** <210> 3 <211> 987 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Oryza sativa (japonica) <400> 3 atgatggggc cgaacgtgtc gtcggagaag aaggcgttgg cggcggcgaa gaggagggcg 60 tacgtgacgt tcctggccgg cgacggcgac tactggaagg gcgtcgtggg gctcgccaag 120 gggctccgcc gcgtccgctc ggcgtacccg ctggtggtcg ccgtgctccc ggacgtcccc 180 ggcgagcacc ggcggaagct ggtcgagcag gggtgcgtgg tccgggagat tcagccggtg 240 tacccgccgg agagccagac gcagttcgcc atggcctact acgtgatcaa ctactcgaag 300 ctccgcatct gggagttcgt ggagtacgag cggatggtct acctcgacgc cgacatacag 360 gtgttcgaca acatcgacca cctgttcgac ctcgacaagg gcgccttcta cgccgtcaag 420 gactgcttct gcgagaagac gtggagccac acgccgcagt acgacatcgg ctactgccag 480 cagcgccccg acgaggtggc gtggccggag cgcgagctcg gccccccgcc gccgctctac 540 ttcaacgccg gcatgttcgt ccacgagccc ggcctcggca ccgccaagga cctgctcgac 600 gcgctcgtcg tcacgccgcc caccccgttc gccgagcagg acttcctcaa catgttcttc 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Claims

다음 단계를 포함하는 벼의 냉해 및 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터를 벼 세포에 형질전환시켜 OsGolS2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계.
삭제
다음 단계를 냉해 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 벼의 제조 방법:
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 벼 세포에 형질전환시켜 OsGolS2 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및
(b) 상기 벼 세포로부터 냉해 및 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 벼를 수득하는 단계.
삭제
제3항의 방법에 의해 제조된 냉해 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 벼.
삭제
삭제
제5항에 따른 냉해 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 벼의 종자.
서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 벼(Oryza sativa (japonica)) 유래의 OsGolS2(Oryza sativa (japonica) Galactinol synthase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 벼의 냉해 및 건조 스트레스 내성 증진용 조성물.
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