KR100990369B1

KR100990369B1 - 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＡｔＵＢＰＨ1 및ＡｔＵＢＰＨ2 유전자의 돌연변이체 및 상기 유전자가도입된 성장을 촉진시키는 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR100990369B1
Application number: KR1020080066363A
Authority: KR
Inventors: 김우택; 조석근; 유문영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2008-07-09
Publication date: 2010-10-29
Also published as: KR20100006228A

Abstract

본 발명은 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체 및 이의 종자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 식물의 성장을 촉진시키는 방법, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자가 모두 돌연변이된 스트레스 저항성이 증진된 애기장대 돌연변이체 및 이의 종자, 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

애기장대, 스트레스 저항성, 성장 촉진, 형질전환, 유비퀴티네이션, AtUBPH1, AtUBPH2

Description

식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＡｔＵＢＰＨ1 및 ＡｔＵＢＰＨ2 유전자의 돌연변이체 및 상기 유전자가 도입된 성장을 촉진시키는 형질전환 식물체{Loss-of-function atubph1 and atubph2 mutant plants increasing resistance against plant stress and transgenic plants transformed by AtUBPH1 and AtUBPH2 promoting plant growth}

본 발명은 식물 스트레스 저항성을 증가시키는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체 및 상기 유전자가 도입된 성장을 촉진시키는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

유비퀴티네이션은 모든 진핵생물이 가지고 있는 기작으로서, 기질 단백질에 유비퀴틴이라고 하는 76개의 아미노산으로 구성된 단백질이 공유결합에 의해서 사슬을 형성하는 일련의 효소 활동 기작을 의미한다. 유비퀴티네이션이 일어나는 기질 단백질은 매우 다양하며, 세포 내의 거의 모든 생리활동이 이들 기작과 연관됨을 많은 연구 결과를 토대로 알 수 있었다. 특히 비생물학적 스트레스에 관여하는 이러한 E3 유비퀴틴 라이게이즈는 아직까지 많은 연구가 필요하다.

국내 자생식물과 같은 중요한 식물 자원에서 분리된 유용 유전자의 특허와 상품화는 생명공학 분야의 많은 부분을 차지하고 있으며, 식물의 스트레스 조절에 관여하는 유전자의 발현억제 및 과다발현 식물체의 개발은 다양한 신기능 자생식물체 (노화지연 식물, 고추의 색깔이나 크기변화, 다양한 외부 스트레스에 저항하는 식물, 뿌리 길이 변화 식물 등)의 생산과 산업화라는 가능성에 대한 기대가 증가하고 있다. 더 나아가 농업적으로 중요한 다양한 작물에도 적용되어 그 생산성 향상에 기여할 수 있을 것이다.

이러한 식물의 환경 스트레스에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 한국공개특허 제2006-80235호에는 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다. 또한, 한국등록특허 제833476호에는 식물 성장이 향상된 AtPFP 형질전환 식물체가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 식물의 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 저항성을 연구하던 중, 애기장대 유래의 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자를 분리하고, 이들 유전자를 돌연변이 시킴으로써 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것을 밝히고, 한편 상기 유전자들의 과다발현 식물체는 야생종에 비해 성장이 빨라진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 식물의 성장을 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자가 모두 돌연변이된 스트레스 저항성이 증진된 애기장대 돌연변이체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 성장 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 분리된 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 단백질은 식물의 스트레스에 대한 성장을 촉진시키며, 이들 유전자가 망가진 돌연변이체는 건조(가뭄) 스트레스에 의한 저항성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명은 U-BOX 유전자인 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 과다발현 식물 형질전환체의 경우는 성장이 빨라짐을 알 수 있었다 (도 3 참고).

상기 AtUBPH1 또는 AtUBPH2 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, AtUBPH1 또는 AtUBPH2 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서 열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물의 종 자이며, 가장 바람직하게는 애기장대의 종자이다.

본 발명은 또한, 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 재조합 벡터는 식물 발현 벡터일 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 HvNHX1 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtUBPH1 또는 AtUBPH2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 성장을 촉진시키는 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환에 이용되는 재조합 벡터 및 숙주 세포로 이용될 수 있는 식물은 전 술한 바와 같다.

본 발명은 또한, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자가 모두 돌연변이된 스트레스 저항성이 증진된 애기장대 돌연변이체를 제공한다. 상기 스트레스는 생물학적 또는 비생물학적 스트레스일 수 있으며, 바람직하게는 가뭄 (건조) 스트레스이다. 상기 2개의 유전자가 돌연변이된 녹아웃 돌연변이체를 제작하였으며 (도 4 참고), 이들 유전자의 돌연변이체는 가뭄 스트레스에 의해서 저항성이 증가함을 알 수 있었다 (도 5 참고).

본 발명은 또한, 상기 애기장대 돌연변이체의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 식물의 성장 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 AtUBPH1 유전자 및 AtUBPH2 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 식물의 성장 촉진용 조성물은 유효 성분으로서 애기장대 유래의 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 또는 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하며, 상기 유전자 AtUBPH1 또는 AtUBPH2를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 성장을 촉진시킬 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

1. 유전자의 분리 획득

본 발명에서는 건조 스트레스에 의해서 발현이 유도되는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자를 애기장대의 cDNA로부터 통상적인 방법에 의해 분리하였다.

2. 식물 성장조건 및 시료 채취

해당 유전자의 애기장대 씨앗을 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 10분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 씻어 주었다. 처리된 씨는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지에 vertical로 심은 후 약 2주간 생장 챔버 (16시간 광 조건/ 8시간 암 조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. Green whole plant를 재료로 사용한 경우는 씨앗을 Sunshine MIX #5 (Sun Gro Horticulture) 흙을 넣어 준 화분에 심어서 약 3주간 생장 챔버 (16시간 광 조건/ 8시간 암 조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다.

3. 스트레스(염, 저온, 건조) 처리

본 발명에서는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 스트레스에 대한 유전자의 발현을 확인하기 위해, 건조 스트레스는 배지에서 2주간 키운 애기장대 유묘를 공기 중에 노출한 후 1시간 및 2시간 후에 샘플링하였다. 염 스트레스는 2주간 키운 애기장대에 300 mM의 염화나트륨을 처리한 후 1시간, 2시간이 경과한 후 뿌리 조직만 샘플링하였다. 저온 스트레스는 배지에서 2주간 키운 애기장대 유묘를 4℃가 유지되는 인큐베이터에서 6시간, 12시간 동안 배양하고 조직을 샘플링하였다.

다양한 스트레스를 처리한 조직을 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 가루로 만든 다음 1 g 당 2 ml의 추출 완충액 (4 M 구아니딘-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 0.5% 사르코실, pH 9)과 β-머캅토에탄올을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI (페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 = 25 : 24 : 1)와 혼합하여 5분간 흔들어 준 다음 3,500 rpm에서 25분간 원심분리 하였다 (한일 원심분리기, HA-1000-3). 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고, 동량의 PCI를 혼합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 수행하고, 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2회 에탄올 침전 및 1회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다.

4. 정량적인 역전사효소(RT)-PCR

형질전환 식물체와 야생종의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하여 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합액 (각 1.25 mM) 8 ㎕, 그리고 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제를 넣어 총 부피를 50 ㎕로 만들었다.

Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 25회 수행하였고, 25회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. PCR에 사용된 유전자의 프라이머는 아래와 같다.

AtUBPH1 Foward : 5'- GAATCTCAACGACATGTGTCAGT -3' (서열번호 3)

AtUBPH1 Reverse : 5'- AAGCAGGATACGAATCATACAAA -3' (서열번호 4)

AtUBPH2 Foward : 5'- GCAACGACTCAGAAAATGGG -3' (서열번호 5)

AtUBPH2 Reverse : 5'- CATCAGCAGGGATATGCAAG -3' (서열번호 6)

RD29a Foward : 5'- CAGGTGAATCAGGAGTTGTT -3' (서열번호 7)

RD29a Reverse : 5'- CCGGAAATTTATCCTCTTCT -3' (서열번호 8)

RD22 Foward : 5'- GCAGCGAAGGAGACTCAGCT -3' (서열번호 9)

RD22 Reverse : 5'- GTTCCAAGCTGAGGTGTTCTT -3' (서열번호 10)

18s rRNA Foward : 5'- GCATTTGCCAAGGATGTTTT -3' (서열번호 11)

18s rRNA Reverse : 5'- GTACAAAGGGCAGGGACGTA -3' (서열번호 12)

UBC10 Foward : 5'- ATGGCGTCGAAGCGGATC -3' (서열번호 13)

UBC10 Reverse : 5'- TTAGCCCATGGCATACTTCTG -3' (서열번호 14)

Ubiquitin Foward : 5'- ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTC -3' (서열번호 15)

Ubiquitin Reverse : 5'- TCAACCACCACGGAGCCTGA -3' (서열번호 16)

6. AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 벡터 구축물의 제조

본 발명에서는 말토오즈에 결합하는 단백질과 AtUBPH1 및 AtUBPH2를 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해 AtUBPH1의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 PstI 제한효소에 해당하는 서열을 붙여놓은 프라이머 세트, AtUBPH2의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 EcoRI 제한효소에 해당하는 서열을 붙여놓은 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA)를 EcoRI 제한효소로 자른 다음 T4 DNA 라이가제(New England Bio Lab) 효소를 이용하여 라이게이션(ligation) 하였다. 재조합된 MBP-CaRma1H1을 대장균 BL21-CodonPlus (DE3) RIL(스트라테이진)에 발현시킨 후, 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제시켰다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다.

또한, 본 발명에서는 형질전환체 제작을 위하여 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 포함하고 있는 바이너리 벡터인 pBI121을 애기장대의 형질전환을 위해 사용하였다. 형질전환을 하기 위하여 pAtUBPH1 및 pAtUBPH2 cDNA를 주형으로 하여 high fidelity EX-tag polymerase(Takara, Kyoto, Japan)를 이용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 단백질의 번역 부위를 완전히 포함하고 있는 cDNA 조각을 얻을 수 있었으며, AtUBPH1의 경우는 SmaI, SacI 그리고 AtUBPH2의 경우는 XbaI, SacI 제한효소로 자른 뒤 pBI121 벡터로 도입하였다.

7. 아그로박테리움으로 AtUBPH1 및 AtUBPH2 형질전환 및 형질전환 애기장대 식물체의 제조

제작된 구축물은 아그로박테리움(GV3101)에 전기천공법을 이용하여 형질전환하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다. 약 4 주된 애기장대(columbia [Col-0])의 지상 부위를 0.05% 실웨트가 포함된 MS 배지에 1분 30초간 담구는 방법으로 형질전환 시켰다(clough and Bent, 1998, Plant J 16; 735-743). 약 3주간 23℃의 생장 챔버에서 배양하고, 씨를 받은 후(T1), 25 ㎍/㎖ 의 카나마이신과 250 ㎍/㎖의 카르베니실린이 포함된 배지에서 살아남는 개체들을 골라 형질전환 유전자의 존재 여부를 RT-PCR 및 노던 블롯을 통해 검증하였다.

8. AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질의 효소활성 분석

본 발명에서는 AtUBPH1 그리고 AtUBPH2 단백질의 효소활성 분석을 위해, pMAL-X 벡터에 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 ORF를 MBP(maltose binding protein) 프레임에 맞게 서브클로닝을 수행하였다. 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 2 mM 디티오트레이톨(DTT), 300 ng/㎕ 유비퀴틴, 25 μM MG132, 500 ng UBA1, 500 ng UBC8, MBP-AtUBPH1 또는 MBP-AtUBPH2 500 ng을 각각의 튜브에 넣어준 후 30℃ 배양기에서 배양하였다. 샘플 완충용액을 넣어준 다음 100 ℃에서 5분간 끓이고 항-MBP(New England Bio Labs), 항-유비퀴틴 (Santa Cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

실시예 1: AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질의 효소활성 분석

도 1B는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질의 효소활성 분석을 나타낸 것이다. 상기 단백질들에 MBP(maltose binding protein)를 붙인 다음 셀프-유비퀴티네이션을 수행한 것으로, UBA1, UBC8, 유비퀴틴, AtUBPH1 혹은 AtUBPH2를 1시간 동안 30도에서 배양 후 단백질 변화를 확인하기 위해서 MBP 및 유비퀴틴의 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. MBP-AtUBPH1 및 MBP-AtUBPH2 단백질의 분자량이 증가됨을 MBP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 알 수 있었고, 이들의 증가가 유비퀴틴에 의한 것인 지를 확인하기 위해 유비퀴틴 항체를 이용하여 확인하였다. 이 결과를 토대로 AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질은 유비퀴틴 단백질을 붙여주는 라이게이즈의 효소활성 능력을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 2: 스트레스 (염, 저온, 건조) 처리에 따른 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 발현 조사

도 2는 비생물학적 스트레스 (냉해, 건조, 및 염분) 조건에서 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자는 저온, 건조, 및 염 스트레스에 의해서 발현이 유도됨을 알 수 있었다. 또한, 스트레스 저항성에 관여하는 RD29A 유전자의 발현도 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 3: AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 과발현 형질전환 애기장대의 표현형 분석

도 3A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자를 포함하는 35S: AtUBPH1 및 35S:AtUBPH2 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형을 분석한 결과이다. 정상 조건에서 상기 형질전환체는 야생종에 비해 성장이 빨라지며, 뿌리의 길이도 길어짐을 알 수 있었다. 따라서, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자는 식물의 성장을 촉진시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

또한, 도 3B는 이들 유전자의 과발현 식물체를 RT-PCR을 통하여 확인을 한 것이다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 과발현 식물체는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자를 과발현하고 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이를 갖는 애기장대의 건조 스트레스 저항성 분석

도 4A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체에 관한 그림이다. 두 개 유전자의 엑손에 T-DNA가 삽입된 위치를 보여주고 있다. 도 4B는 이들 유전자를 교배시켜서 두 개 유전자가 동시에 돌연변이가 된 녹아웃 돌연변이체를 제작하였고, 이들 유전자와 T-DNA 부근의 프라이머를 이용하여 PCR의 방법으로 T-DNA가 삽입됨을 보여준다. 도 4C는 각각의 돌연변이체의 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 유전자의 발현을 조사한 것이다. 도 4C에서 보는 바와 같이, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 발현이 억제됨을 알 수 있었다.

도 5A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체의 가뭄 스트레스에 관한 표현형 분석이다. 12일간 물을 주지 않았을 때 야생종에 비해 건조 스트레스에 저항성을 보이는 것을 알 수 있었다. 도 5B는 건조 스트레스를 1시간 처리하였을 때의 상기 유전자의 형질전환체 및 돌연변이체의 유전자 발현 분석을 한 것이다. 돌연변이체의 경우 스트레스 저항성에 관여하는 RD29a 및 RD22 유전자의 발현이 증가 함을 알 수 있었고, 상기 유전자의 과다발현 형질전환 식물체는 해당 유전자의 발현이 감소함을 RT-PCR 결과를 토대로 알 수 있었다.

따라서, AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체는 가뭄 스트레스에 저항성을 가짐을 알 수 있었다.

도 1A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질의 분석을 나타낸 것이다. AtUBPH1은 435개의 아미노산, AtUBPH2는 411개의 아미노산으로 구성되며, 회색지역은 상기 단백질이 공통적으로 가지는 U-BOX 도메인을 지칭한다. 도 1B는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 단백질의 효소활성 분석을 나타낸 것이다.

도 2는 비생물학적 스트레스 (냉해, 건조, 및 염분) 조건에서 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다.

도 3A는 35S:AtUBPH1, 및 35S:AtUBPH2 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형을 분석한 결과이다. 도 3B는 이들 유전자의 과다발현 식물체를 RT-PCR을 통하여 확인을 한 것이다.

도 4A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체에 관한 그림이다. 도 4B는 이들 유전자를 교배시켜서 두 개 유전자가 동시에 돌연변이가 된 녹아웃 돌연변이체를 제작하였고, 이들 유전자와 T-DNA 부근의 프라이머를 이용하여 PCR의 방법으로 T-DNA가 삽입됨을 보여준다. 도 4C는 각각의 돌연변이체의 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 유전자의 발현을 조사한 것이다.

도 5A는 AtUBPH1 및 AtUBPH2 유전자의 돌연변이체의 가뭄 스트레스에 관한 표현형 분석이다. 도 5B는 건조 스트레스를 1시간 처리하였을 때의 상기 유전자의 형질전환체 및 돌연변이체의 유전자 발현 분석을 한 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Loss-of-function atubph1 and atubph2 mutant plants increasing resistance against plant stress and transgenic plants transformed by AtUBPH1 and AtUBPH2 promoting plant growth <130> PN08112 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1645 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gctaacttat tcaaaccaat tcacatatct cctaaatctc aacgactgca ctttgaagct 60 ttttgtttag attcgttcgt cgtttccatt gattaagtct acttcttttt tttcatattt 120 tcgagcgggt caaatggatc aagagataga gattccttcc ttcttccttt gtccaatctc 180 tctagatatc atgaaagatc cggtgatagt ttccaccgga ataacctacg accgagaaag 240 catcgagaag tggctctttt ccggtaagaa aaactcatgt ccagtcacca aacaagtcat 300 aaccgaaact gatcttaccc caaaccacac tcttcgccgt ttgattcaat cttggtgtac 360 cctcaacgca tcatatggta tagagaggat cccaactcca aaacctccga tctgtaaatc 420 ggagatcgaa aagcttatca aagagtcgtc atcttcgcat ctaaaccaag tcaaatgcct 480 caaacgactt cgtcaaatag tatctgagaa tacaaccaac aaacggtgct tagaagccgc 540 agaagttccg 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Claims

애기장대 유래의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 성장이 촉진되는 식물체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
제1항에 따른 식물체의 종자.
삭제
애기장대 유래의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 AtUBPH1 또는 AtUBPH2 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 성장을 촉진시키는 방법.
제6항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtUBPH1 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 AtUBPH2 유전자가 모두 녹아웃(knock-out)된 건조 스트레스 저항성이 증진된 애기장대 돌연변이체.
삭제
제8항에 따른 애기장대 돌연변이체의 종자.
애기장대 유래의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 AtUBPH1 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 22) 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 AtUBPH2 (Arabidopsis thaliana U-Box Protein Homolog 23) 유전자를 포함하는 식물의 성장 촉진용 조성물.
삭제
제11항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 조성물.