KR100833476B1

KR100833476B1 - 성장이 향상된 ＡｔＰＦＰ 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR100833476B1
Application number: KR1020070023331A
Authority: KR
Inventors: 한태룡; 임혜민; 조만호; 전종성; 부성희
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-05-29

Abstract

본 발명은 성장이 향상된 AtPFP 형질전환 식물체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 해당과정(glycolysis)에 관여하는 애기장대(Arabidopsis thaliana) PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 코딩하는 AtPFP α1과 β 단위체를 코딩하는 AtPFP β 1를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제작함으로써 형질전환 애기장대 식물체 PFP활성의 증가와 야생형에 비하여 식물 성장이 현저한 차이를 나타내는 것을 확인하였고, 애기장대 PFP의 기능을 형질전환 담배 식물체를 통하여 다시 검증한 내용에 관한 것이다.

PFP, 형질전환 식물체, 성장, 향상, 탄수화물, 물질대사

Description

성장이 향상된 ＡｔＰＦＰ 형질전환 식물체{Growth enhancement of AtPFP transgenic plant}

도1은 야생형 애기장대에서 각각의 성장단계와 다른 조직들에서 AtPFP 발현을 semiquantitative RT-PCR를 이용하여 분석한 결과이고,

도2는 AtPFP 유전자의 과발현 및 억제(repression)를 위해 사용된 벡터 구조를 나타낸 그림이고,

도3은 AtPFP 형질전환 애기장대 식물체의 RNA 젤 블럿 분석을 나타내는 그림이고,

도4는 형질전환 애기장대 식물체의 성장 표현형과 특성을 나타내는 그림이고,

도5는 CO₂ 동화율을 나타내는 그림이고,

도6은 AtPFP 형질전환 애기장대 식물체에서 광합성에 관여하는 유전자의 발현을 나타내는 그림이고,

도7은 AtPFP 형질전환 애기장대 라인들에서의 탄수화물량을 분석한 그림이고,

도8은 AtPFP α1 (α1-7와 α1-19) 또는 AtPFP β1 (β1-5와 β1-16)을 과발현하는 형질전환 애기장대의 잎에서 중간대사 산물량을 나타내는 그림이고,

도9는 AtPFP로 형질전환 된 담배 식물체에서 AtPFP α 1와 AtPFP β1의 발현 분석과 AtPFP α1 또는 AtPFP β1 을 발현하는 형질전환 라인의 특성을 분석한 결과이다.

본 발명은 성장이 향상된 AtPFP 형질전환 식물체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 해당과정(glycolysis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 코딩하는 AtPFPα1과 β 단위체를 코딩하는 AtPFPβ1를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제작함으로써 형질전환 애기장대 식물체 PFP활성의 증가와 야생형에 비하여 식물 성장이 현저한 차이를 나타내는 것을 확인하였고, 애기장대 PFP의 기능을 형질전환 담배 식물체를 통하여 다시 검증한 내용에 관한 것이다.

세계 인구의 증가에 따른 식량문제는 우리가 풀어나가야 할 중요한 과제이다. 인류의 식량난을 해결하기 위해 신품종 육종법 등을 통한 다각적인 노력을 하였으나 그 대책을 찾지 못하다가, 최근 생명공학기술을 이용한 유전자변형작물의 개발이 식량난이 해결을 위한 핵심기술로써 기대되고 있다.

유전자변형 기술을 이용하여 제초제 저항성, 병해충 저항성, 높은 당도, 과즙영양분 다량 함유, 성장 속도 조절, 유해물질 내성, 환경저항성, 유용미생물 등의 유전자를 주입하여 초다수성 농작물, 저온건조염해 등의 불량환경이나 병충해에 강한 농작물 개발 등을 통한 생산력의 비약적 향상에 기여할 수 있으며, 영양성분이나 기능성 성분(항암 효과 등)이 많은 농작물, 알러지 원인 물질을 제거한 농작물을 생산함으로써 식량증산에 결정적으로 기여할 수 있는 가능성도 보여 주었다.

한편, PFP는 과당 6인산(fructose-6-phosphate, Fru-6-P)과 과당1,6 이인산(fructose-1,6-bisphosphate, Fru-1,6-P₂)의 가역적인 상호변환을 통하여 물질대사의 흐름이 해당과정(glycolysis)으로 진행되느냐 아니면 당신생과정(gluconeogensis)으로 진행되느냐를 결정하는데 있어 매우 중요한 효소이다.

식물의 PFP는 주로 α, β 두 개의 단위체(subunit)로 구성된 이형소중합체(heterooligomer)이다( Kowalczyk, S. (1987) Acta Biochim . Pol . 34, 253-268, Kruger, N.J. and Dennis, D.T. (1987) Arch . Biochem . Biophys. 256, 273-279, Nielsen, T.H. (1994) Physiol . Plantarum , 92, 311-321, Stitt, M. (1990) Annu . Rev. Plant Physiol . Plant Biol . 41, 153-185, Theodorou, M.E. and Plaxton, W.C. (1996) Plant Physiol . 112, 343-351, Turner, W.L. and Plaxton, W.C. (2003) Planta , 217, 113-121, Wong, J.H., Kiss, F., Wu, M.-X. and Buchanan, B.B. (1990) Plant Physiol . 94, 499-506, Yan, T.-F.J. and Tao, M. (1984) J. Biol . Chem. 259, 5087-5092). α 단위체는 조절기능을 수행하고, β 단위체는 촉매작용을 할 것으로 예상된다(Carlisle, S.M., Blakeley, S.D., Hemmingsen, S.M., Trevanion, S.J., Hiyoshi, T., Kruger, N.J. and Dennis, D.T. (1990) J. Bio .l Chem . 265, 18366-18371, Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol . Chem . 267, 21901-21905.). 애기장대의 α단위체(At1g20950와 At1g76550는 각각 AtPFP α1 와 AtPFP α 2을 코딩함)와 β단위체(At1g12000 와 At4g04040은 AtPFP β 1와 AtPFP β 2을 코딩함)를 암호화하는 두 개의 유전자가 보고되었다(Nielsen, T.H., Rung, J.H. and Villadsen, D. (2004) Trends Plant Sci . 9, 556-563). AtPFP α 1는 19 액손으로 구성되고, 반면에 AtPFP α2는 18 액손으로 구성된다. 더 작은 AtPFP-β단위체들의 유전자들은 피마자(caster bean)와 동일하게 16 액손을 포함한다(Todd, J.F., Blakeley, S.D. and Dennis, D.T. (1995) Gene , 152 , 181-186).

비록 많은 식물체에서 PFP가 두 개의 다른 단위체로 구성된 이형사중합체(heterotetramers,α₂β₂)로 존재하지만, 그 외에도 다양한 구성의 PFP가 식물에 존재한다고 알려져 있다 (Nielsen, T.H. (1994) Physiol . Plantarum, 92, 311-321, Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol . Chem. 267, 21901-21905, Theodorou, M.E. and Plaxton, W.C. (1996) Plant Physiol . 112, 343-351, Turner, W.L. and Plaxton, W.C. (2003) Planta , 217, 113-121, Wong, J.H., Kiss, F., Wu, M.-X. and Buchanan, B.B. (1990) Plant Physiol . 94, 499-506, Yan, T.-F.J. and Tao, M. (1984) J. Biol . Chem . 259, 5087-5092.). 밀 묘목, 토마도 과일과 검은 겨자 배양 세포와 같은 몇몇의 식물 조 직에서 PFP는 단지 β 단위체로 구성된다고 알려져 있다(Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol . Chem . 267, 21901-21905, Wong, J.H., Kiss, F., Wu, M.-X. and Buchanan, B.B. (1990) Plant Physiol. 94, 499-506, Yan, T.-F.J. and Tao, M. (1984) J. Biol . Chem . 259, 5087-5092).

본 발명은 식물의 성장과정 중에 PFP의 기능을 조사하기 위하여 PFP활성이 증가되거나 감소된 형질전환 애기장대 식물체를 제조하고 이들의 성장 표현형을 관찰하였다. PFP활성이 증가된 형질전환 애기장대 식물체는 야생형에 비하여 식물 성장에 현저한 차이를 나타내었다. 애기장대 PFP의 기능은 형질전환 담배 식물체를 통하여 다시 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명의 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 과발현하기 위한 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 과발현하기 위한 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 과발현하기 위한 벡터가 형질전환되어 성장이 향상된 AtPFPα 1형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 과발현하기 위한 벡터가 형질전환되어 성장이 향상된 AtPFPβ 1형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 암호화하는 유전자 를 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 암호화하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체 단백질을 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체 단백질을 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 과발현하기 위한 벡터를 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 과발현하기 위한 벡터를 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 과발현하기 위한 벡터가 형질전환되어 성장이 향상된 AtPFPα1형질전환 식물체를 포함한다.

본 발명은 해당과정(glycosis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체를 과발현하기 위한 벡터가 형질전환되어 성장이 향상된 AtPFPβ1형질전환 식물체를 포함한다.

본 발명에 따른 AtPFP 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 3과 서열번호4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3과 서열번호4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3과 서열번호4로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 과발현시 성장을 촉진하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 AtPFP 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 AtPFP 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1과 서열번호2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1과 서열번호2의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 AtPFP 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.

식물체에서 AtPFP 유전자를 과발현시키는 방법으로는 AtPFP 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 AtPFP 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 AtPFP유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 AtPFP 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 AtPFP 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 AtPFP유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 AtPFP 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 식물의 성장이 촉진될 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라 스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 성장이 촉진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 식물의 발생 또는 분화가 촉진된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 AtPFP 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　즉, AtPFP 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다.　 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 발생 또는 분화가 촉진된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제 한되는 것으로 해석되지는 않는다.

애기장대의 각각의 조직들과 다양한 발달단계에서 AtPFP 유전자의 발현양상을 semiquantitative RT-PCR로 조사하였다. AtPFP α1은 잎, 꽃과 뿌리에서 주로 발현되었고, AtPFP β 1는 모든 조직에서 AtPFP α1보다 적은 양이 발현되었다(도1a). 잎에서 AtPFP β2가 주로 발현되는 반면에 AtPFP β1의 발현은 비교적 적었다(도1a). AtPFP β2는 초기 발현 단계 즉, 15일째 가장 높은 전사체 발현율을 보였고 그 외 AtPFP 유전자 각각은 발현양의 큰 차이가 없이 모든 발달단계를 통하여 발현되었다(도 1b).

애기장대 AtPFP α 1와 AtPFP β1의 cDNA를 CaMV 35S 프로모터로 조절되는 벡터에 도입하여 형질전환 식물체를 제작하였다(도2a). 도입된 AtPFP α1 또는 AtPFP β1을 과발현하는 형질전환 식물체 라인들 중 두 개의 AtPFPα1 발현 라인(α1-7와 α1-19)과 두 개의 AtPFP β 1발현 라인(β1-5와 β1-16)을 선택하여 심도있게 분석하였다(도 3a).

AtPFP α1과 AtPFP β 1를 이중으로 과발현하는 라인은 AtPFP β1의 발현 벡터를 AtPFP α1 과발현 라인 α1-19로 도입함으로써 제작하였다(도2b). 두개의 이중 과발현 라인(α1/β1-1 와 α1/β1-5)에서 AtPFP α 1와 AtPFPβ1은 높은 수준으로 발현하였다(도3b).

AtPFP 발현이 감소된 형질전환 애기장대 라인을 제작하기 위하여, AtPFP α1 또는 AtPFP β1이 들어있는 RNAi 벡터를 애기장대에 형질전환시켰다(도2c). RNAi 형질전환 라인들 중에서, 두 개의 AtPFP α1-RNAi 라인(α1R-3와 α1R-10)과 두 개의 AtPFP β1-RNAi 라인(β1R-21와 β1R-22)은 AtPFP α1 또는 AtPFP β1의 유전자 발현이 억제됨을 확인하였다(도3c).

형질전환 애기장대 식물체들의 성장을 주의 깊게 관찰함으로써 AtPFP 단위체의 발현 변화가 성장에 영향을 끼치는 것으로 관찰되었다. AtPFPβ1과발현 라인 (β1-5와 β1-16)뿐만 아니라 AtPFP 조절에 관여하는 α단위체의 과발현 라인(α1-7와 α1-19)은 야생형보다 더 빨리 자라는 것을 관찰할 수 있었다(도4a,b). α, β 단위체가 이중으로 과발현되는 라인(α1/β1-1와 α1/β1-5)은 또한 야생형보다 더 빨리 자라는 것을 관찰할 수 있었으나 단일 과발현 라인과 비교하여 추가적인 성장의 차이는 없었다(도4a,b). 따라서 이후의 모든 실험들은 단일 과발현 라인을 이용하여 수행하였다. PFP 과발현 형질전환 식물체와 대조적으로 AtPFP α1 RNAi 또는 AtPFPβ1 RNAi 형질전환 라인은 심각한 성장의 저해를 보였다(도4a, b).

AtPFP 형질전환 애기장대 식물체는 줄기 발달에 있어서도 차이점을 보였다(도4b). 단일, 이중 과발현 라인 모두에서 주 줄기의 발달이 빠르고 성장이 향상되었다. 반면에 RNAi 돌연변이 식물체는 야생형에 비하여 주 줄기 발달이 지연되었다. 야생형과 비교하여 단일 과발현 라인의 지상 부분의 생중량(fresh weights)은 1.39 ~ 1.51배 수준으로 증가하였고, 반면에 RNAi 라인의 생중량(fresh weights)은 0.61 ~ 0.75배 수준으로 감소하였다(도4c).

형질전환 식물체의 잎에서 PFP 활성은 해당과정(glycolysis)의 방향으로 측정한다. AtPFP β1의 발현이 증가가 확인 된(도3a), β1-5와 β1-16 형질전환 라인의 PFP활성은 야생형과 비교하여 각각 2.3 ~ 2.0배로 증가하였다(도4d). 조절 단위체인 α가 과발현되는 α1-7과 α1-19라인은 PFP활성이 야생형에 비하여 2.7 ~ 2.4 배로 각각 증가하였다(도4d).

비록 많은 식물체에서 PFP가 두 개의 다른 단위체로 구성된 이형사중합체(heterotetramers,α₂β₂)로 존재하지만, 그 외에도 다양한 구성의 PFP가 식물에 존재한다고 알려져 있다 (Nielsen, T.H. (1994) Physiol . Plantarum, 92, 311-321., Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol . Chem. 267, 21901-21905., Theodorou, M.E. and Plaxton, W.C. (1996) Plant Physiol . 112, 343-351., Theodorou, M.E. and Plaxton, W.C. (1996) Plant Physiol . 112, 343-351., Wong, J.H., Kiss, F., Wu, M.-X. and Buchanan, B.B. (1990) Plant Physiol . 94, 499-506., Yan, T.-F.J. and Tao, M. (1984) J. Biol . Chem. 259, 5087-5092.). 밀 묘목, 토마도 과일과 검은 겨자 배양 세포와 같은 몇몇의 식물 조직에서 PFP는 단지 β 단위체로만 구성된다고 알려져 있다(Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol . Chem . 267, 21901-21905, Wong, J.H., Kiss, F., Wu, M.-X. and Buchanan, B.B. (1990) Plant Physiol . 94, 499-506, Yan, T.-F.J. and Tao, M. (1984) J. Biol . Chem . 259, 5087-5092.).

검은 겨자 배양 세포에서는 무기 인산 결핍에 의해 PFP α 단위체의 합성이 유도되고 α/β비율이 증가되면 이는 PFP 활성의 증가를 야기한다(Theodorou, M.E., Cornel, F.A., Duff, S.M. and Plaxton, W.C. (1992) J. Biol. Chem . 267, 21901-21905). 따라서. 비록 애기장대 PFP의 구조가 아직 밝혀지지 않았다고 하더라도, PFP 사중합체(PFP tetramer) 비율의 증가가 α1-7과 α1-19라인에서 PFP 활성의 증가를 나타내는 것으로 생각된다. 이런 사실은 AtPFP α1-RNAi라인에서 PFP 활성이 저해되는 것으로도 확인이 가능하다(도4d). α1R-3과 β1R-21 식물체에서 PFP 활성은 야생형에 비하여 0.57와 0.67배 수준으로 각각 감소하였다. 형질전환 담배와 감자 식물체에서 두 개의 단위체들의 발현 감소에 따른 PFP 활성이 감소가 보고되었다 (Hajirezaei, M. Sonnewald, U., Viola, R., Carlisle, S., Dennis, D. and Stitt, M. (1994) Planta , 192, 16-30, Nielsen, T.H. and Stitt, M. (2001) Planta , 214, 106-116, Paul, M., Sonnewald, U., Hajirezaei, M., Dennis, D. and Sitt, M. (1995) Planta , 196, 277-283).

6주가 지난 AtPFP 형질전환 애기장대 식물체의 잎에서 광합성량을 다양한 CO₂농도와 광도에서 측정하였다(도5). 광도 500 μmol m^-2s^-1에서 광합성량은 단일 과발현 라인인 AtPFP α1 (α1-7)와 AtPFP β1 (β1-16)에서 CO₂ 농도가 높을때 (300 μmol mol^- ¹이상) 약간 증가하였다(도5a). 야생형의 광합성은 대략 광도 300 μmol m^-2s^-1에서 포화된 반면, 단일 과발현 라인은 좀 더 높은 광도(600 μmol m^-2s^-1 이상)에서 광합성이 포화되었다(도5b). 높은 광도(1000 μmol m^-2s^-1)에서, CO₂ 동화율을 비교한 결과, 형질전환 라인인 α1-7와 β1-16가 야생형보다 훨씬 더 높았다. 그러나 저광도(300 μmol m^-2s^- ¹이하)에서는 차이점이 없었다(도5b). 이러한 결과는 AtPFP 유전자의 과발현은 일상조건(CO₂ 농도400 μmol mol^-1, 광도 100 μmol m^-2s^-1)에서는 형질전환 애기장대 식물체의 광합성량을 증가시키지 않는다는 것을 의미한다.

형질전환 식물체에서 AtPFPs의 발현을 증가시켰을 때, 광합성 유전자 발현의 다면발현성 효과(pleiotropic effect)가 있는지 조사하기 위하여 광합성 유전자인 NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP - GAPDH), SBPase, phosphoribulokinase (PRK), chlorophyll a/b binding protein 1 (CAB1), cytosolic FBPase (cFBPase), plastid FBPase (pFBPase), Rubisco 작은 단위체 (RbcS)와 plastocyanin (PC)의 발현을 semiquantitative RT-PCR을 통하여 분석하였다. RT-PCR결과 단일 과발현 라인에서 광합성 유전자의 발현에 어떠한 차이점도 나타나지 않음을 확인하였다(도6).

형질전환 애기장대 식물체의 잎에서 PFP활성 변화에 따른 탄소 분배(carbon partitioning)를 조사하기 위하여, 탄수화물인 슈크로스, 글루코스, 프락토스, 전분과 이들의 중간대사산물인 dihydroxyacetonephosphate (DHAP), glyceraldehydes 3-phosphate (G3P), Fru-1,6-P₂, Fru-6-P, glucose-6-phosphate (Glc-6-P), glucose-1-phosphate (Glc-1-P)와 UDP-glucose (UDP-Glc)의 함량을 야생형과 비교 분석하였다.

탄수화물 함량의 분석 결과 α1-19, β1-16, α1R-3, α1R-10, β1R-21 와β1R-22라인의 슈크로스가 약간 감소하였고, 단일 과발현 라인에서 글루코스가 약간 증가하였다. 그러나 변화된 PFP 단위체들의 발현과 탄수화물의 함량 사이에서의 명백한 상관관계는 알 수 없었다(도7). 게다가, 단일 과발현 라인에서 중간대사산물의 발현량에 큰 변화가 없었다(도8). 이런 결과는 형질전환 애기장대 식물체의 잎에서 PFP의 발현량과 PFP의 활성의 변화는 탄소의 분배에 있어 가시적인 변화가 관찰되지 않는 것을 알수 있게 한다. 일관되게도, PFP발현량과 PFP의 활성이 심각하게 감소된 형질전환 감자 식물체와 형질전환 담배 식물체의 탄소 분배에 미치는 영향은 미비하게 나타났다 (Hajirezaei, M. Sonnewald, U., Viola, R., Carlisle, S., Dennis, D. and Stitt, M. (1994) Planta , 192, 16-30, Nielsen, T.H. and Stitt, M. (2001) Planta , 214, 106-116).

다른 식물종에서 AtPFP가 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 아그로박테리움을 매개로 한, AtPFP α1 와 AtPFPβ1 (도2a) 발현 벡터의 도입으로 담배 형질전환 식물체를 제조하였다. 제작된 형질전환 담배 중 다섯 개의 AtPFP α 1와 네 개의 AtPFP β1 형질전환 라인에서 AtPFP의 발현율이 높았다 (도 9a). AtPFP 유전자가 과발현되는 형질전환 담배라인들은 야생형에 비하여 높은 성장을 나타냈다. 예를 들어, 형질전환 담배 라인 Ntα1-19, Ntα1-32 (AtPFP α1)와 Ntβ1-1, Ntβ1-9 (AtPFP β1)은 야생형에 비하여 향상된 영양성장을 나타냈다(도9b,c). 이러한 네 개의 형질전환 담배 라인은 또한 야생형에 비하여 더 큰 잎을 만들었고, 성장 속도 또한 빨랐다. 이러한 결과는 AtPFP α 1와AtPFP β1이 담배와 같은 이종 조직에서 기능적으로 발현된다는 것을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물 재료와 성장조건

애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)와 담배 식물체(Nicotiana tabacum cv. Havana SR1)의 멸균된 종자는 성장 쳄버안(22 ℃, 16 h light/8 h dark cycle, 광도 100 μmol m^-2s^-1)에서 2%슈크로즈가 참가된 Gamborg B5와 MS 아가 고체배지에서 각각 발아시킨다. 발아 후, 묘목은 상업적인 포팅믹스인 Sunshine mix5가 담긴 포트에 옮겨 성장 쳄버에서 더 배양한다.

실시예2. 벡터 구성

애기장대 PFP가 과발현된 형질전환체를 생성하기 위하여 AtPFP α1 (At1g20950) 와 AtPFP β1 (At1g12000)의 cDNA를 애기장대 잎의 cDNA 라이브러리로부터 증폭하여 pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI)에 서브클론한다. PCR 증폭을 위한 프라이머는 AtPFP α1에는 KpnI 와 BamHI 제한효소자리를 갖는 5'-GGTACCATGGATTCAGATTTCGGAATC-3'(서열목록5)와5'-GGATCCTCATTGACCACCATTTGAAGA-3'(서열목록6)를 사용하였고, AtPFP β1에는 KpnI 와 XbaI 를 갖는 5'-GGTACCATGGCCCCTGCTCTCGCCGTTAC-3'(서열목록7)와 5'-TCTAGATTATTGAGCCCCGAGTTCAAG-3'(서열목록8)를 사용하였다.

시퀀스를 확인한 후에 AtPFP α1 와 AtPFP β1 는 CaMV 35S 프로모터와 nos 터미네이터를 갖는 pPZP211-Ex 플라스미드(Hajirezaei, M. Sonnewald, U., Viola, R., Carlisle, S., Dennis, D. and Stitt, M. (1994) Planta , 192, 16-30)에 클로닝하여 과발현 벡터를 제조하였다(도2). AtPFP α 1와 AtPFP β1이 모두 과발현되는 형질전환체를 제작하기 위하여 AtPFP β1 cDNA는 BamHI 와 XhoI 을 포함하는 프라이 머5'-GGATCCATGGCCCCTGCTCTCGCCG-3'서열목록9) 와 5'-CTCGAGCTATTGAGCCCCGAGTTC-3'(서열목록10)을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 AtPFP1은 하이그로마이신 저항성 유전자를 선별마커로 갖는 발현벡터 pPZP2Ha3 (Fuse, T., Sasaki, T. and Yano, M. (2001) Plant Biotechnol . 18, 219-222.)로 클로닝하여 과발현 벡터를 제조하였다(도2). 이러한 결과물은 AtPFP α1 과발현 형질전환체로 도입되었다.

AtPFP RNAi 벡터를 제작하기 위하여 AtPFP α1 (cDNA에서 염기 551 - 1050)과 AtPFP β1 (cDNA에서 염기 627 - 1126 in the cDNA)의 cDNA 단편을 증폭하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머는 AtPFP α1에는 5'-GCTCTAGAGGCGCGCCTTGTTATCATTGGAGGCG-3'(서열목록11) 와 5'-CGGGATCCATTTAAATTACACCCTGCCTCAGCA-3'(서열목록12), AtPFP β1에는 5'-GCTCTAGAGGCGCGCCTGAAAACTTCAGGAGTAA-3'(서열목록13) 와 5'-CGGGATCCATTTAAATTCAGGGATTGCTCGGTG-3'(서열목록14)를 사용하였다. 정방향 프라이머에는 XbaI 와 AscI, 역방향 프라이머에는 BamHI와 SwaI 를 삽입하였다. AtPFP α1 와 AtPFP β1의 cDNA 단편은 센스와 안티센스 방향으로 RNAi 벡터pFGC5941에 삽입하였다.

실시예3. 애기장대의 형질전환과 선별

AtPFP 발현벡터는 아그로박테리움을 매개로 한 floral dip method (Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Plant J. 16, 735-743)로 애기장대에 형질전환시켰다. 외부에서 도입된 AtPFP 유전자를 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 선별하기 위해 카나마이신 (25 mg/L)을 사용하였고, 이중 과발현 형질전환체(double- overexpression transformants)는 하이그로마이신 (25 mg/L)을 포함하는 고체배지에서 선별하였다.

AtPFP RNAi 형질전환체를 선별하기 위하여, 0.05% BASTA를 성장 10일이 지난 형질전환체에 살포하였고, 이것에 5일 간격으로 두 번을 추가로 살포하였다. T3세대에서 100 생존률을 보이는 T2식물체는 동형접합 형질전환체(homozygous transgenic lines)로써 선택하여 다음 실험을 진행하였다.

실시예4. 담배 형질전환과 선별

AtPFP α1 또는 AtPFP β 1 의 과발현을 위한 벡터를 아그로박테리움을 매개하여 Horsch et al. (1985)방법으로 형질전환시켰다. 형질전환 담배 식물체는 카나마이신(50 mg/L)이 포함된 배지에서 선별하였다. 동형 접합 형질전환라인(Homozygous transgenic lines)은 상기에 설명한 애기장대 형질전환체를 선별한 방법과 동일하다.

실시예5. Semiquantitative RT-PCR분석

Tri Reagent (Invitrogen, Carlsbard, CA)을 이용하여 애기장대의 각각의 조직들과 발달단계에서 전체 RNA를 추출하였다. 단일 가닥의 cDNA는 RT-PCR 키트(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 첫 번째 cDNA 합성을 하였다. 첫 번째 가닥의 cDNA로 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 대조구로써 튜블린을 사용하였다. 유전자 특이적 프라이머는 AtPFP α1에는 5'- ACACTCGAAGTCTCACACCAC-3'(서열목록15)와 5'- TCATTGACCACCATTTGAAGA-3'(서열목록16)를 , AtPFP α2에는 5'-ATCTTCTCTGAGTCTCTCTGA-3'(서열목록17) 와 5'- TTAAGCAAATTGCTGACCGCT-3'(서열목록18) 를, AtPFP β1에는 5'- TAGTCTCTCGACTAACCACC -3'(서열목록19) 와 5'- CCTAATAGACCCGCAAAGGAC-3'(서열목록20)를, AtPFP β2에는 5'-TAAAGAATTTTGGTACTGTGAG-3'(서열목록21) 와 5'- TGTATGAAATTGCGAAACTTT-3'(서열목록22)를 사용하였다.

광합성 관련 유전자 NADP - GAPDH의 증폭에 사용된 프라이머는 5'-AAGGAACCGGAGTGTTTGTG-3'(서열목록23)와 5'-CACTAGTGGCTCATCGCAGA-3'(서열목록24)이고, SBPase에는 5'-ACACTCATCAGCGACACGAC-3'(서열목록25) 와 5'- AGGAATCCACGAGATGGTTG -3'(서열목록26) 를, PRK에는 5'-ACACTCATCAGCGACACGAC-3'(서열목록27) 와 5'- AGGAATCCACGAGATGGTTG -3'(서열목록28) 를 cFBPase에는 5'-GTCGACATTCGTGTTGAATGAACAATC-3'(서열목록29) 와 5'-TCTAGATTTGTTTCCCCTGCAAGTCCA-3'(서열목록30)를, pFBPase에는 5'-GCTGCCGTCTCTACTGGTTC-3'(서열목록31)와 5'-CATCAGAACCTTTCCCTCCA -3'(서열목록32)를, RbcS에는 5'-GAGCACGGATTTGTGTACCGTGAG-3'(서열목록33) 와 5'-TGTTGTCGAATCCGATGATCCTAATGAAGG-3'(서열목록34), PC에는 5'- CCACCGTCAGAATCCAAACT-3'(서열목록35) 와 5'-ACAACAACAATCACGGTCCA-3'(서열목록36)를, TUB2 (Snustad, D.P., Haas, N.A., Kopczak, S.D. and Silflow C.D. (1992) Plant Cell , 4, 549-556)에는 5'-CTCAAGAGGTTCTCAGCAGTA-3'(서열목록37) 와 5'- TCACCTTCTTCATCCGCAGTT-3'(서열목록38)를 사용하였다. PCR조건은 95 °C에서 5분동안 초기 반응시키고 95 °C에서 1분, 56 °C에서 1분, 72 °C에서 1분으로 27사이클을 반응시킨 후, 72 °C에서 7분동안 반응시킨다.

실시예6. RNA 젤 블럿 분석

모든 RNA는 Tri 시약을 사용하여 형질전환 식물체와 야생형 식물체의 잎으로부터 추출하였다. 전체 RNA(40㎍)는 변성 포름알데히드 아가로스 젤(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 분리한 후 Hybond-N⁺ 맴브레인(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 블럿팅한 후 [α-³²P]-dCTP로 표지된 AtPFP α 1와 AtPFPβ1의 cDNA는 탐침을 사용하여 분석하였다.

실시예7. PFP분석

야생형과 형질전환 애기장대에서의 해당과정의 방향의 PFP 활성은 NAD⁺의 생성을 측정하여 (Hatzfeld, W.-D., Dancer, J. and Stitt, M. (1990) Planta , 180, 205-211) 결정한다. 간단하게, 단백질 시료는 24일 동안 성장한 애기장대 식물체의 잎으로부터 추출하였다. NAD⁺의 생성은 CARY 300 Bio 자외선/가시광선 분광분석기(Varian, Palo Alto, CA)를 사용하여 340 nm에서 흡광도의 변화로 측정하였다. PFP활성 단위는 1분당 1 μmole NAD⁺의 형성으로 정의한다. 5개의 식물체로부터 ± SD로 결과를 표시하였다.

실시예8. 대사산물의 추출과 측정

슈크로스, 글루코오스, 프락토스와 전분을 포함하는 대사산물은 변형된 Lu and Sharkey(Lu, Y. and Sharkey, T.D. (2004) Planta , 218, 466-473)의 방법으로 24일 동안 성장한 애기장대 잎 에서 추출하였다. 간단하게, 애기장대 잎(0.2 - 0.3 g)을 액체 질소로 가루로 만들어질 때까지 갈았다. 분쇄된 조직에 killing solution (80% ethanol, 20% formic acid) 1 mL 을 첨가하고 80 °C에서 20분동안 반응시킨다. 용매는 농축기(concentrator, Eppendorf 5301, Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 증발시키고, 잔여물은 500 μL H₂O로 추출하고 원심분리한다. 상층액은 당과 중간대사산물의 함량을 측정하는데 사용한다. 전분함량을 분석하기 위하여 원심분리한 침점물을 물에 녹이고, 121 °C 에서3시간동안 가열한다. 이 용액 50μL는 20 mM Na-acetate (pH 4.8)로 조정하고, 30 U α-amylase와 25 U amyloglucosidase로 37 °C 에서12시간 동안 가수분해한다(Walters, R.G., Ibrahim, D.G., Horton, P. and Kruger, N.J. (2004) Plant Physiol. 135, 891-906). 가수분해 산물은 전분함량을 결정하기 위해 분석한다. 야생형과 형질전환 애기장대의 잎에 있는 탄수화물과 전분함량은 (Stitt, M., Lilley, R.M.C., Gerhardt, R. and Heldt, H.W. (1989) Method Enzymol . 174, 518-522)에서 설명한 방법으로 CARY 300 Bio UV/Vis spectrophotometer(Varian, Palo Alto, CA)을 이용하여 분석하였다.

실시예9. 가스교환 측정

다양한 세포간 CO₂농도(C_i)와 광량 하에서의 CO₂동화율은 LI-6400 portable photosynthesis measurement system (Li-Cor, Lincoln, NE)으로 측정하였다. CO₂는 자동 주입기로 공급되고, 세포간 CO₂ 농도와 CO₂동화율은 von Caemmerer and Farquhar(von Caemmerer, S. and Farquhar, G.D. (1981) Planta , 153, 376-387)의 방법으로 계산한다. 빛은 잎 챔버에 부착된 LED로 공급된다. 가스의 습도는 대략 10 ~ 30% 을 유지하고, 잎의 온도는 22 ~ 24 °C을 유지한다. 모든 광합성 측정은 각각의 돌연변이주의 적어도 다섯 개의 잎에서 수행하였다.

이상의 실시 예를 통하여 명백하게 나타난 바와 같이, 본 발명은 해당과정(glycolysis)에 관여하는 애기장대 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체를 코딩하는 AtPFPα1과 β 단위체를 코딩하는 AtPFPβ1를 과발현하는 형질전환 애기장대를 제공함으로써 형질전환 애기장대 식물체 PFP활성의 증가되어 야생형에 비하여 식물 성장이 현저히 향상된 AtPFP 형질전환 애기장대와 AtPFP 형질전환 담배 식물체를 제공 할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 발달 또는 성장을 촉진시키는 애기장대 유래의 AtPFPα1 단백질.
서열번호4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 발달 또는 성장을 촉진시키는 애기장대 유래의 AtPFPβ1 단백질.
제1항에 있어서, 해당과정(glycosis)에 관여하는 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 α단위체로서 식물의 발달 또는 성장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 단백질.
제2항에 있어서, 해당과정(glycosis)에 관여하는 PFP(Pyrophosphate:fructose-6-phosphate 1-phosphotransferase)의 β단위체로서 식물의 발달 또는 성장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 단백질.
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제1항의 AtPFPα1 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항의 AtPFPβ1 단백질을 코딩하는 유전자.
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제7항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제8항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제13항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
제14항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
제7항의 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 발달 또는 성장을 촉진하는 방법.
제8항의 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 발달 또는 성장을 촉진하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대 또는 담배인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대 또는 담배인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항 또는 제19항의 방법에 의해 식물의 발달 또는 성장이 촉진된 형질전환 식물체.
제18항 또는 제20항의 방법에 의해 식물의 발달 또는 성장이 촉진된 형질전환 식물체.
제21항의 형질전환 식물체의 종자.
제22항의 형질전환 식물체의 종자.