WO2012165714A1 - 비생물학적 스트레스 내성 관련 유전자 및 형질전환 식물체 - Google Patents

비생물학적 스트레스 내성 관련 유전자 및 형질전환 식물체 Download PDF

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WO2012165714A1
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김우택
유문영
조석근
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연세대학교 산학협력단
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme

Definitions

  • the present invention relates to genes related to abiotic stress resistance, in particular dry stress resistance, and to plants having increased resistance to abiotic stress.
  • Ubiquitin is a protein consisting of 76 amino acids expressed in all eukaryotes, and has the property of covalently binding to various substrate proteins by El-E2-E3 (ubiquitin activation, ubiquitin binding, ubiquitin ligase) chain enzyme reaction. Ubiquitin has a wide variety of matrix proteins that affect almost every physiological activity in cells, and studies show that many diseases are linked to these mechanisms. First known of ubiquitin The function was to promote the breakdown of proteins by binding to other proteins, but recently, other functions of ubiquitin have been discovered one after another.
  • Ubiquitin binds to the substrate by the sequential action of three proteins, El, E2 and E3. Glycine in the C-terminal domain of ubiquitin binds to N3 ⁇ 4 in the R group of the lysine of the substrate protein to form a covalent bond with the substrate.
  • ubiquitin-attached proteins are broken down by proteasomes.
  • polyubiquitin having several ubiquitins attached to the substrate.
  • proteasome-dependent degradation of a substrate occurs only when the polyubiquitin bound to at least four ubiquitins is attached to the substrate, but this is controversial because it is an in vitro experiment.
  • Polyubiquitin bonds, which cause proteasome dependent degradation are forms in which other ubiquitin binds to the 48th lysine of ubiquitin.
  • E1 enzymes There are only two types of E1 enzymes in an individual. There are many different types of E2 and generally serve to transfer ubiquitin from E1 to E3 or substrate.
  • E3 also known as the E3 ligase enzyme, is the last step in attaching ubiquitin to the substrate.
  • E3 determines the specificity of the substrate to be ubiquitated. That is, the substrate that can interact with a given E3 enzyme is specifically determined.
  • E3 enzymes can be broadly divided into two types, one having a RING domain and one having an HECT domain. E3 enzymes with a RING domain help to position E2 and substrate close together. That is, when E2 and substrate combine with E3, a close distance is formed between the ubiquitin in E2 and the substrate. At this time, the ubiquitin in E2 chemically moves to the substrate.
  • those belonging to the E3 enzyme with the HECT domain after receiving the ubiquitin from E2 will be transferred to the substrate.
  • the At5g01520 gene encodes a protein having E3 ubiquitin ligase enzyme activity. Ubiquitation is a mechanism that all higher organisms, as well as plants, are known to have a variety of functions, but little is known about genes involved in abiotic stress.
  • the inventors have isolated and acquired the At5g01520 gene, which is induced by Abihormonal stress and ABA hormone, Overexpressing transformants and expression inhibitory mutants of the genes were prepared and their physiological phenotypes analyzed.
  • the present inventors made diligent research efforts to find genes that can improve abiotic stress resistance of plants. As a result, when the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is involved in the traits of the above-described plants and suppresses the expression of these genes, it is possible to obtain a transgenic plant having the above-described improved traits. By confirming, this invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a composition for enhancing abiotic stress resistance of a plant and a plant cell or plant having enhanced abiotic stress resistance transformed with the composition.
  • Another object of the present invention to provide a composition for promoting germination of plants.
  • the present invention provides a composition for enhancing abiotic stress resistance of plants comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the second sequence of the sequence listing.
  • the present inventors made diligent research efforts to find genes that can improve abiotic stress resistance of plants.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is involved in the trait of the plant described above and suppresses the expression of these genes, it is possible to obtain a transformed plant having the above-described improved trait. Confirmed.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the sequence listing second sequence consists of the nucleotide sequence of the sequence listing first sequence.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 sequence is the nucleotide sequence of the At5g01520 gene of Arabidopsis, which is named AtAIRP2 (Arabidopsis thai i ana ABA Insensitive Ring Protein 2).
  • the gene encodes a RING protein with E3 ubiquitin ligase enzyme activity, and the inventors have found that the gene has increased expression of the gene by various abiotic stresses and ABA hormones. It is apparent to those skilled in the art that the nucleotide sequence used in the present invention is not limited to the nucleotide sequence described in the attached sequence listing.
  • nucleic acids do not result in changes in proteins.
  • Such nucleic acids include functionally equivalent codons or codons encoding the same amino acids (eg, due to the degeneracy of the codons, there are six codons for arginine or serine), or codons encoding biologically equivalent amino acids. And nucleic acid molecules.
  • nucleic acid molecules used in the present invention are also construed to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the substantial identity is at least 603 ⁇ 4 of phase when the sequence of the present invention is aligned with any other sequence as best as possible and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • a sequence that shows homology more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mo J. Bio.
  • the abiotic stress of the invention is selected from the group consisting of dry stress, low temperature stress and salt stress.
  • the inventors confirmed that the expression of the gene increases when the plant is subjected to dry, low temperature or salt stress, and the resistance to these stresses increases when the expression of the gene is increased.
  • the abiotic stress of the present invention is dry stress.
  • the present invention provides a kit comprising: (a) the nucleotide sequence described in the present invention; (b) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence and forming an RNA molecule in a plant cell; And (c) a plant expressing a recombinant vector for plant expression comprising a poly A signal sequence that acts on plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.
  • the term “operationally binding” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the regulatory sequence Is to regulate the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Promoters suitable for the present invention, any conventionally used in the art for gene introduction of plants can be used, for example,
  • SP6 Promoter T7 Promoter, T3 Promoter, PM Promoter, Corn Ubiquitin Promoter, Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S Promoter, Nopalin Thinase (nos) Promoter, Pigwart Mosaic Virus 35S Promoter, Suga Crane Basiloid Virus Promoter, Commelina Yellow Morlovirus promoter, ribulose-1, 5-bis-phosphate carboxylase small subunit (ssRUBISCO) photoinducible promoter, rice cytosol triosphosphate isomerase (TPI) promoter, of Arabidopsis Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) promoter and octopine synthase promoter.
  • the promoter in the present invention is a CaMV 35S promoter.
  • the poly A signal sequence leading to 3'-end polyadenylation suitable for the invention is derived from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (N0S 3 'end (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11 (2): 369-385 (1983)), derived from the Octopine synthase gene of Agrobacterium rheumatization, protease inhibitor I or ⁇ gene of tomato or potato 3 'terminal portion, CaMV 35S terminator and 0CS terminator (octopine synthase terminator) sequence.
  • the 3'-terminal poly A signal sequence causing the polyadenylation suitable for the present invention is a 0CS terminator sequence.
  • the vector may additionally carry genes encoding reporter molecules (eg, luciferase and ⁇ -glucuronidase).
  • reporter molecules eg, luciferase and ⁇ -glucuronidase
  • the vector of the present invention may be selected as a marker for antibiotics (e.g. neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, etc.) and resistance genes (e.g. neomycin phosphotransferase ipt ⁇ ) Mycin phosphotransferase Uipt), and the like).
  • the recombinant vector for plant expression of the present invention is Agrobacterium It is a binary vector.
  • the binary back frame] is the LBGeft border (RB) and RB (right), which are required for movement in the TKtumor inducible plasmid. It is a vector that divides the plasmid with the border and the plasmid with the genes needed to move the target nucleotide.
  • the transforming Agrobacterium of the present invention may be any one suitable for the expression of the nucleotide sequence of the present invention, and in particular, the Agrobacterium strain for plant transformation in the present invention is usually Agrobacterium tumefaciens ( ⁇ ra «Cier / izro tumefaciens)? Is preferable.
  • the method of introducing the recombinant vector of the present invention to Agrobacterium can be carried out through various methods known to those skilled in the art, for example, particle bombardment, electroporation, transfection ), The lithium acetate method (lithium acetate method) and the heat shock (heat shock). Preferably electroporation is used.
  • the present invention provides plant cells having enhanced abiotic stress resistance transformed with the composition of the present invention.
  • the present invention provides a plant having enhanced abiotic stress resistance transformed with the composition of the present invention.
  • the exogenous polynucleotide can be inserted into a carrier such as a vector such as a plasmid or a virus to transform the plant, and the Agrobacterium bacteria can be used as a medium (Chilton et ai. Cell 11: 263: 271 (1977)), Plants can be transformed by introducing foreign polynucleotides directly into plant cells (Lorz et ai. Mo J. Genet. 199: 178-182; (1985)). For example, when using a vector that does not include a T-DNA site, electroporation, microparticle bombardment, and polyethylene glycol-mediated uptake may be used.
  • agrobacterium tumefaciens g7 wc e / v1 ⁇ 27 tumefaciens transformed with an exogenous polynucleotide (see: United States of America) Patent Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).
  • a person skilled in the art can develop a plant by culturing or culturing the transformed plant cell or seed under known and appropriate conditions.
  • plant (sieve) is understood as meaning including not only mature plants but also plant cells, plant tissues and seed of plants that can develop into mature plants.
  • the plant of the present invention is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, arms, oats and millet;
  • Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, peppers, strawberries, tomatoes, watermelons, cucumbers, cabbages, melons, pumpkins, green onions, onions, and carrots;
  • Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanuts and rapeseed;
  • Fruit trees including apples, pears, jujube trees, fussola, legumes, grapes, chisels, persimmons, plums, apricots and bananas;
  • Flowers including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, and yulipols;
  • fodder crops including lygras, redclover, orchardgrass, alphaalpha,
  • the present invention provides a composition for promoting germination of a plant comprising a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the second sequence of the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the present invention consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the At5g01520 gene. According to the present invention, when suppressing the expression of the nucleotide sequence of the present invention, it is possible to suppress immature germination
  • the nucleic acid molecules of the present invention enable long term seed storage based on good germination rates.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, peptide ide nucleic acids (PNA) or antisense oligonucleotides. More preferably, the nucleic acid molecule of the present invention is T-DNA.
  • ⁇ ⁇ ⁇ is a short double chain that can induce RNAKRNA interference through cleavage of specific mRNAs.
  • RNA stands for. It consists of a sense RNA strand having a sequence homologous to mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto.
  • siRNA is provided as an efficient gene knockdown method or gene therapy because it can inhibit the expression of the target gene.
  • siRNAs are not limited to completely paired pairs of double-stranded RNA pairs of RNA, but are paired by mismatches (bases not complementary), bulges (no bases on one chain), etc. May be included.
  • the total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, most preferably 20 to 70 bases.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect.
  • the cohesive end structure is possible in both a three-terminal protruding structure and a five-terminal protruding structure.
  • the number of protruding bases is not limited.
  • the number of bases may be 1 to 8 bases, preferably 2 to 6 bases.
  • siRNA is a small molecule RNA (eg, a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, virus RNA or artificial RNA) at the proximal end of one end to the extent that the expression inhibitory effect of the target gene can be maintained. RNA molecules).
  • the siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop type structure in which one terminal portion of the double chain RNA is connected by a linker RNA.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem parts.
  • RNA refers to a nucleotide composed of 50-70 single strands and forms a stem-loop structure in vivo.
  • Long RNAs of 19-29 nucleotides complementary to both loop regions of 5-10 nucleotides form base pairs to form a double stranded stem.
  • miRNA regulates gene expression and has a total length of 20-50 nucleotides, preferably 20-45 nucleotides, more preferably 20-40 nucleotides, even more preferably 20- A single stranded RNA molecule consisting of 30 nucleotides, most preferably 21-23 nucleotides.
  • miRNAs are ligonucleotides that are not expressed intracellularly and have a short stem-tup structure. miRNAs are homologous, in whole or in part, with one or more mRNAs (messenger RNAs) and inhibit target gene expression through complementary binding to the mRNAs.
  • Ribozyme refers to an RNA molecule having a function such as an enzyme that recognizes a base sequence of a specific RNA and cleaves it by itself as a kind of RNA. Ribozyme is a complementary nucleotide sequence of a target messenger RNA strand consisting of a region that binds with specificity and a region that cleaves the target RNA.
  • PNA protein nucleic acid
  • PNA protein nucleic acid
  • PNA hybridizes with the native nucleic acid of complementary base sequence 03 ⁇ 4 1 ⁇ 23 011) to form a double strand.
  • PNA / DNA double strands are more stable than DNA / DNA double strands and PNA / RNA double strands are more stable than DNA / RNA double strands.
  • N- (2-aminoethyl) glycine is repeatedly connected by an amide bond.
  • the backbone of the peptide nucleic acid is electrically different from that of the negatively charged natural nucleic acid.
  • the four nucleic acid bases present in the PNA have approximately the same spatial size and distance between nucleic acid bases as for natural nucleic acids.
  • PNA is not only chemically stable than natural nucleic acids, but also biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases.
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or derivatives thereof that contain a nucleotide sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, which binds to a complementary sequence within the mRNA and translates the mRNA into a protein.
  • Antisense nucleotide sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence complementary to the mRNA of the target gene and capable of binding to the mRNA of the target gene, and the translation of the target gene into mRNA and translocation into the cytoplasm. cation), maturation, or any other essential biological activity.
  • the antisense oligonucleotides are 6 to 100 bases in length, preferably 10 to 40 bases.
  • the antisense oligonucleotides can be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5 (3): 343-55, 1995 ). Oligonucleotide backbones can be modified with phosphorothioates, phosphoesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic sugar linkages, and the like. In addition, antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense oligonucleotides may comprise modified bases—modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methyl pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, Gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 —thiouracil, 2 -thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6- Aminonuclear) adenine, 2, 6-diaminopurine and the like.
  • modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methyl pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, Gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 —thiouracil, 2 -thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguan
  • T-DNA refers to a DNA fragment delivered to the nucleus of a host plant cell as transfer DNA of a Ti (tumor-inducing) plasmid of Agrobacterium spp. 25 bp repeats exist at both edges of the T-DNA, and delivery begins at the left border and ends at the right border.
  • the bacterial T-DNA is about 20,000 bp long and is used to cause insertional mutagenesis by disrupting the target gene by their insertion, and the inserted T-DNA sequence not only causes the mutation but also marks the target gene. do.
  • the present inventors used seed of Arabidopsis gene whose gene expression was suppressed through transduction of Ti plasmid.
  • the present invention (a) a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the nucleotide sequence disclosed in the present invention; (b) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence and forming an RNA molecule in a plant cell; And (c) provides a composition for promoting the germination of plants comprising a recombinant vector for plant expression comprising a poly A signal sequence that acts in plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.
  • the present invention provides a composition for enhancing abiotic stress resistance of plants and a composition for promoting germination.
  • the nucleotide sequence of the present invention is involved in the resistance to the dry stress of the plant, the transgenic plants overexpressing it is excellent in resistance to various abiotic stresses, including drought stress, regardless of the climate of the growing region It can be usefully used as a new functional crop.
  • nucleotide sequence of the present invention is involved in the susceptibility to the ABA hormone of the plant, the plant expression suppressed plant can be usefully used as a new functional plant and biomass with a greatly improved germination ability and increased storage period have.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results confirmed by the RT-PCR expression of AtAIRP2 gene after various abiotic stress and ABA hormone treatment.
  • ABA hormone FAA
  • FIG. Lb dry stress
  • FIG. Lc salt stress
  • FIG. ID cold stress
  • each RNA was isolated to confirm the expression pattern of the gene.
  • RD29A was used as a gene
  • the RAB18 gene was used as the ABA treatment.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of analyzing the promoter activity of the AIRP2 gene by histochemical staining GUS analysis. After 3 hours of 100M ABA treatment or 2 hours of dry stress, the GUS signal is strong, indicating that the activity of the AtAIRP2 promoter is increased.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of analyzing the enzyme activity of the AtAIRP2 protein.
  • the protein changes after incubation of HIS-UBAl, HIS-UBC8, ubiquitin and MBP-AtAIRP2 for 1 hour at 30 ° C.
  • Western blot analysis was performed using MBP and ubiquitin antibodies.
  • the molecular weight of the AtAIRP2 protein was increased by Western blot analysis using the MBP antibody.
  • Ubiquitin antibody was used to confirm whether the increase was due to ubiquitin.
  • the AtAIRP2 protein was found to have the enzymatic activity of the E3 ubiquitin lyase to attach the ubiquitin protein.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the AtAIRP2 gene mutant and its dry stress resistance.
  • Figure 4a is a diagram showing the insertion of T-DNA into genomic DNA of ⁇ / ⁇ gene, T-DNA is inserted into the axon a / r /-1) and intron (3 / / ⁇ /-) of the gene
  • Figure 4b shows that the genome DNA of these mutants was extracted and T-DNA was inserted by PCR using primers near the gene and T-DNA.
  • Figure 4d shows that the expression of the mutants is suppressed by the RT-PCR method, which shows that the mutants suppress the expression of the genes.
  • FIG. 5 is a diagram of an overexpressed transformant of the AtAIRP2 gene.
  • a Arabidopsis transformed with 35S: AtAIRP2-GFP recombinant vector was prepared and overexpressed using GFP antibody (FIG. 5A). Western blotting showed that the AtAIRP2-sGFP protein was well expressed.
  • Figure 5b is a comparison of resistance to dry stress overexpression of the AtAIRP2 gene and wild type Arabidopsis. Each plant grown for 2 weeks was treated with dry stress without watering for 14 days, and then watered again to compare the number of surviving individuals. As a result, the overexpressing transformants were found to be more resistant to dry stress than the wild type. 6 shows mutants and overexpression of the AtAIRP2 gene.
  • Figure 6A shows wild type, atairp2-l and ABA hormones in media treated with concentrations of 0.1 and 0.5 uM, respectively. 7 days after planting atairp2-2 mutant. In the case of mutant plants, germination was better in the medium containing ABA than in the wild type.
  • Figure 6b is a picture taken 7 days after planting wild type, atairp2-2 and AtAIRP2sGFP overexpressing transgenic plants in medium treated with ABA hormone at a concentration of 0.2, 0.4 ⁇ , respectively. Overexpression of ⁇ / genes showed that germination was significantly inhibited in the medium containing ABA hormone, and the atairp2-2 mutant showed resistance under the same conditions. Therefore, the germination rate of overexpression type transformants decreased by ABA hormone, and the mutants increased germination rate.
  • MMLV Reverse Transcriptase So Single stranded cDNA was synthesized. 20 ng of cDNA was used as a template for PCR. Two primers were used at 10 pmole, respectively, 10 x Taq polymerase complete solution (Takara) 5 ⁇ , dNTP mixture (1.25 mM each) 8 and 1 unit of Taq. DNA polymerase (Takara) was added to make a total volume of 50. PCR was performed with a Perkin Elmer DNA thermal cycler.
  • AtAIRP2 overexpressed transformant of the AtAIRP2 gene
  • construct was performed using the Invitrogen gateway system.
  • AtAIRPl-sGFP was added to pENTR SD Topo vector (Invitrogen, USA), and then replaced with plant pEarlygate 100 vector (Arabidopsis research center, USA) using LR clonase enzyme (Invitrogen).
  • AtAIRP2 expression-suppressive mutant plants were prepared using SIGNAL Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (http: /). / signal .salk.edu /).
  • Plants grown in a growth chamber (16 hours light condition / 8 hours dark condition) for 2 weeks were performed as material.
  • put seeds into Sunshine MIX # 5 (Sun GroHorti culture) Plants were planted in semi-pots and grown in a growth chamber (16 hours light condition / 8 hours dark condition) for about 3 weeks.
  • RNA was isolated using. Quantitative Reverse Transcriptase (RT) -PCR
  • T-DNA 7 ⁇ Genomic DNA Extraction of Inserted Mutants and Acquisition of Homozygous Mutants Wild-type and Expression-Inhibited Mutants The seedlings of Arabidopsis cultivars were planted in soil for 2 weeks, each leaf was sampled, and liver Then 700 ml of CTAB buffer (2% CTAB, 100 mM Tr is pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% PVP) was added and mixed and heated at 65 ° C. for 10 minutes. 200 ml of chloroform was added to the mixture, followed by centrifugation to obtain a supernatant, and isopropane was mixed to precipitate DNA.
  • CTAB buffer 2% CTAB, 100 mM Tr is pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% PVP
  • the precipitate obtained after centrifugation was washed with 70% ethane and dried to use the obtained genome DNA by dissolving with water. Afterwards, genotyping PCR was performed using primers of the front and rear portions of the T-DNA border primer (LB_6313R) and the T-DNA insertion site.
  • T-DNA was inserted into the second exon and the first intron, and PCR was performed using the front and rear portions of the region where T-DNA was inserted and the border primers of T-DNA.
  • T-DNA is inserted by the method of (Fig. 4b).
  • Fig. 4b it was found that the expression of the gene was suppressed by using the AtAIRP2 FW1 and AtAIRP2 RV1 primers by extracting the RNA of the expression inhibitory mutant (RT-PCR) (FIG. 4C).
  • PCR is performed using a primer set that connects the sequences corresponding to Xbal and Pstl restriction enzymes to the 5 'and 3' sides of the AtAIRP2 coding region to recombine the plasmid to be expressed by fusion of the protein binding to maltose with AtAIRP2. It was. PCR results and pMAL-X vectors (New England Biolabs, Beverly, MA) were cut with Xbal and Pstl restriction enzymes and then ligated using T4 DNA ligase (New England Bio Lab) enzymes. Recombinant MBP-AtAIRP2 was expressed in E. coli BL21-CodonPlus (DE3) RIL (stratagene) and purified using amylose column chromatography.
  • AtAIRP2-sGFP was added to the pENTR SD topo vector (Invitrogen, USA), and then replaced with plant pEarlygate 100 vector (Arabidopsis research center, USA) using LR clonase enzyme (Invitrogen).
  • AtAIR2 Transformation and Transformation with Agrobacterium The prepared construct was transformed into Agrobacterium (GV3101) using electroporation and the presence of genes was confirmed by PCR.
  • the enzymatic activity analysis of the AtAIRP2 protein subcloning was performed in the pMAL-X vector according to the MBPOnaltose binding protein (0RF) frame of the AtAIRP2 gene.
  • Wild-type Arabidopsis grown in medium for 10 days was treated with lOOmM ABA and drought stress for 3 hours or 2 hours, respectively, followed by 5 minutes with 90% acetone. Fixed. After acetone was removed, the mixture was washed three times with a Rincing solution to which 50 mM NaPO 4 , lmM K 3 Fe (CN) 6 and lmM K 4 Fe (CN) 6 were added. After washing, replace with a solution containing 2mM X-Gluc (5-br omo-4-ch 1 or o ⁇ 3-i ndo 1 y 1 glucuronide, sigma) in the rinse solution It was. After dyeing until the color changes to dark at 371C, chlorophyll was removed with 90% ethane.
  • a Rincing solution to which 50 mM NaPO 4 , lmM K 3 Fe (CN) 6 and lmM K 4 Fe (CN) 6 were added. After washing, replace with a solution containing 2mM X-
  • AtAIRP2 gene expression was confirmed by RT-PCR at various abiotic stresses. RNA at low temperature (12 hours, 24 hours) and dry stress (1 hour, 2 hours), 300 mM brine for 1.5 hours and 3 hours, 100 ⁇ ABA hormone for 1.5 hours and 3 hours, respectively As a result of checking the expression patterns of the genes, it was confirmed that the expression of the genes was increased than when the stress and hormones were not treated, and the AtAIRP2 gene was induced by low, dry, salt stress and ABA hormones. It was confirmed (FIG. 1). In addition, ABA hormone and dry stress were treated for 3 hours and 2 hours, respectively, and then stained with tissue staining chemical GUS analysis. 2).
  • MBPOnaltose binding protein was attached to AtAIRP2 proteins, followed by incubation of UBAl, UBC8, ubiquitin, and AtAIRP2 at 30 ° C for 1 hour to perform salp-ubiquitination.
  • Western blot analysis was performed.
  • Western blot analysis using MBP antibody confirmed that the molecular weight of the AtAIRP2 protein was increased, and that the increase was due to ubiquitin using the ubiquitin antibody (FIG. 3). Based on these results, AtAIRP2 protein was found to have the enzymatic activity of ligase to attach ubiquitin protein. Obtaining atairp2 Mutants
  • the seed obtained here was planted in a medium and confirmed by Western blot that the protein was well made in # 10 and # 19 transformants using GFP antibody (FIG. 5A).
  • FIG. 5A To compare the resistance of drought stress between the overexpressed transformants of the AtAIRP2 gene and wild-type Arabidopsis plants, each plant grown for 2 weeks was subjected to drought stress without watering for 41 days, and then watered to survive. The number of individuals was compared. Wild type 10%, AtAIRP2 overexpressing plant # 10 was 87. # 19 was 84.2%. Therefore, it was found that the overexpressing transformants are more resistant to drought stress than the wild type plants (FIG. 5B).

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Abstract

본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 발아 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 가뭄 스트레스를 비롯한 각종 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하다. 또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 ABA 호르몬에 대한 민감성에 관여를 하며, 이를 발현억제시킨 식물체는 발아능이 크게 개선된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 재배지역의 기후에 구애받지 않는 신기능 작물 또는 저장기간이 증가된 장기보관용 종자로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
비생물학적 스트레스 내성 관련 유전자 및 형 질전환 식물체 【기술분야】
본 발명은 비생물학적 스트레스 내성， 특히 건조 스트레스 내성에 관련된 유전자 및 이를 형 질전환한 비 생물학적 스트레스 내성 이 증가된 식물체에 관한 것이다. 【배경기술】
고등식물은 이동이 불가하기 때문에 그들의 일생동안 다양한 환경 요인들인 가뭄， 고염 (high salt ) , 중금속 , 넁해 , 열층격 및 오존과 같은 스트레스에 직면하게 된다. 이러한 비생물학적 스트레스는 작물의 생장과 발달의 제한 요인이 되며 이들 스트레스 증에서 수분 부족은 작물생산 감소의 주요 원인으로 여겨지는 가장 심각한 환경 요인이다. 세계적으로 물의 소비는 계속적으로 증가되어 왔으며， 깨끗한 물의 이용가능성은 인간에 게 뿐만 아니라 고등식물에게 또한 중요한 문제가 될 수 있다. 식물은 단기적 또는 장기 적 인 물 부족에 대해 내성을 증가시키 기 위해 신호 네트워크 경로를 조절하거나 스트레스-반웅성 유전자들을 유도하는 등의 다양한 방어 전략을 작동시 킨다. 이 러 한 수분 스트레스에 대한 세포적 또는 유전적 방어 메카니즘은 널리 알려져 있다 (Shinozaki and Yamaguchi- shinozaki , 2007) . 그러나 아직까지 고등식물에 있어서 스트레스에 대한 내성 이나 민감성에 관여하는 스트레스 -관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태다. 그러므로 작물의 생산성을 증가시키기 위해 스트레스 반웅 유전자들에 대한 기능 연구가 중요하다.
유비퀴틴은 모든 진핵생물에서 발현되는 76 개의 아미노산으로 구성된 단백질로써， El-E2-E3(유비퀴틴 활성화 , 유비퀴틴 결합, 유비퀴틴 연결효소) 연쇄 효소반웅에 의해서 다양한 기 질 단백질에 공유결합이 되는 특성을 가진다. 유비퀴틴이 붙게 되는 기질 단백질은 매우 다양하여 세포 내의 거의 모든 생리활동에 영향을 주며， 많은 질병 이 이 러한 기작과 연결되어져 있다는 연구결과들이 잘 밝혀져 있다 . 유비퀴틴의 처음 알려진 기능은 다른 단백질에 결합함으로써 단백질의 분해를 촉진하는 것이었으나 최근 들어 유비퀴틴의 다른 기능들이 속속 밝혀지고 있다.
유비퀴틴은 세 종류의 단백질， 즉 El, E2 및 E3 의 순차적인 작용에 의해 기질에 결합하게 된다. 유비퀴틴의 C 쪽 말단 도메인에 있는 글리신이 기질 단백질의 라이신의 R 기에 있는 N¾ 에 결합함으로써 기질과 공유 결합을 형성하게 된다. 일반적으로 유비퀴틴이 붙은 단백질은 프로테아좀에 의해 분해가 된다. 이 때, 프로테아좀에 의해 분해가 되기 위해서는 유비퀴틴이 여러 개가 붙은 폴리유비퀴틴이 기질에 붙어야 한다. 현재까지는 적어도 4 개의 유비퀴틴이 결합한 폴리유비퀴틴이 기질에 붙을때만 기질의 프로테아좀 의존적인 분해가 일어난다고 알려져 있으나 이것은 in vitro 실험결과이기 때문에 논란의 여지는 있다. 프로테아좀 의존적인 분해를 일으키는 폴리유비퀴틴결합은, 유비퀴틴의 48 번째 라이신에 다른 유비퀴틴이 결합하는 형태이다.
E1 효소는 개체 내에 두 종류만이 존재한다. E2 는 여러 종류가 존재하고, 일반적으로 유비퀴틴을 E1 에서 E3 또는 기질로 전달해주는 역할올 한다. E3 는 E3 리가아제 (ligase) 효소라고도 하며, 유비퀴틴을 기질에 붙게 하는 마지막 단계의 효소이다. E3 가 유비퀴티네이션이 될 기질의 특이성을 결정하게 된다. 즉, 주어진 E3 효소와 상호작용할 수 있는 기질은 특이적으로 결정되어 있다. E3 효소는 크게 2 가지 형태로 나눌 수 있는데, RING도메인을 갖는 것과 HECT도메인을 갖는 것이 그것이다. RING 도메인을 갖는 E3 효소들은 E2 와 기질이 서로 가깝게 위치하도록 도와주는 역할을 한다. 즉, E2 와 기질 두 물질이 E3 와 결합을 하면， E2 에 있는 유비퀴틴과 기질 사이에 층분히 가까운 거리가 형성되고 이 때 화학적으로 E2 에 있던 유비퀴틴이 기질로 이동을 하게 된다. 반면 HECT도메인을 갖고 있는 E3 효소에 속하는 것들은, E2 에서 유비퀴틴을 전달받은 후, 이것을 기질로 이동을 시키게 된다.
At5g01520 유전자는 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하고 있다. 유비퀴티네이션은 식물 뿐 아니라 모든 고등 생명체가 가지는 하나의 메카니즘으로써， 다양한 기능을 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나, 비생물학적 스트레스에 관여하는 유전자는 거의 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 애기장대의 비생물학적 스트레스 및 ABA 호르몬에 의해 발현이 유도되는 At5g01520유전자를 분리획득 한 후, 이들 유전자의 과다발현 형질전환체 및 발현 억제 돌연변이체를 제작하여 이들의 생리적인 표현형을 분석하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이들 유전자의 발현을 억제할 경우 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인함으로써 , 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 상기 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포 또는 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 식물체의 비생물학적 스트레스 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이들 유전자의 발현을 억제할 경우 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환식물체를 수득할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 본 발명에 따르면, 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열은 애기장대의 At5g01520 유전자의 뉴클레오타이드 서열이며， 이 유전자의 이름은 AtAIRP2 (Arabidopsis thai i ana ABA Insensitive Ring Protein 2)로 명명되었다. 상기 유전자는 E3 유비퀴틴 라이게이즈 효소 활성을 가지는 RING 단백질을 코딩하고 있으며, 본 발명자들은 상기 유전자는 다양한 비생물학적 스트레스 및 ABA호르몬에 의해서 그 유전자의 발현이 증가함을 발견하였다. 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어， 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 60¾의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성 , 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)； Needleman and Wunsch, J. Mo J. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24： 307-31(1988)； Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988)； Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989)； Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al . , Meth. Mol. Biol. 24:307- 31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 :403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx 와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT 는 http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://丽. ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/blastJielp. html에서 확인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 식물체에 건조， 저온 또는 염 스트레스를 가할 경우 유전자의 발현이 증가하며 , 상기 유전자의 발현을 증가시킬 경우 이러한 스트레스들에 대한 내성이 증가함을 확인하였다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명에서 개사하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합 (operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 백터를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어□작동적으로 결합口은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열， 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산서열의 전사 및 /또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 백터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며， 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al . Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다. 본 발명에 적합한 프로모터는， 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며， 예를 들어，
SP6프로모터， T7프로모터， T3 프로모터 , PM프로모터 , 옥수수의 유비퀴틴 프로모터， 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터， 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리품 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모를 바이러스 프로모터, 리불로오스 -1， 5-비스 -포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터， 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 프로모터는 CaMV 35S 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (N0S 3' end) (Bevan et al . Nucleic Acids Research, 11(2) :369-385(1983)) , 아그로박테리움 류머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Π 유전자의 3' 말단 부분， CaMV 35S 터미네이터 및 0CS 터미네이터 (octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 0CS 터미네이터 서열이다.
선택적으로， 상기 백터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β- 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 백터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신， 카베니실린， 카나마이신, 스펙티노마이신， 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예： 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 ipt ΙΓ) , 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 Uipt) , 등)를 포함할수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 식물발현용 재조합백터는 아그로박테리움
Figure imgf000008_0001
바이너리 백터이다.
본 명세서에서 용에 바이너리 백테]는 TKtumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LBGeft border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 백터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고， 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스 ( §ra«cier/izro tumefaciens) ？이 바람직하다.
본 발명의 재조합 백터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법 (particle bombardment ) , 전기천공법 (electroporation) , 형질감염법 (transfection), 리튬아세테이트법 (lithium acetate method) 및 열충격법 (heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법을사용한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 ^^Uiethods of Enzymology, Vol. 153， (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 백터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고， 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며 (Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다 (Lorz et ai . Mo J. Genet. 199 :178-182 ;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 백터를 이용하는 경우에는 전기천공법 (electroporation), 입자층격법 (microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol -mediated uptake)을 이용할 수 있다.
일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스 ( g7 wc e/v½7 tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다 (참조: 미합중국 특허 제 5，004，863， 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다. 본 명세서에서， 용어 "식물 (체 ) " 는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포 , 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 본 발명의 식물체는 벼 , 밀， 보리 , 옥수수， 콩， 감자， 밀 , 팔, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대， 배추, 무 , 고추， 딸기 , 토마토， 수박, 오이， 양배추, 참외 , 호박， 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배 , 목화， 참깨， 사탕수수, 사탕무우, 들깨 , 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류 ; 사과나무， 배나무， 대추나무 , 복승아， 양다래 , 포도, 감글, 감, 자두， 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미 , 글라디올러스 , 거베라, 카네이션 , 국화， 백합 및 률립올 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버， 오차드그라스， 알파알파， 를페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본 발명에 따르면， 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열은 At5g01520 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다. 본 발명에 따르면 , 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제할 경우, 미숙발아를 억제하는
ABA 호르몬에 대한 민감성이 감소되면서 발아율이 증가된 것을 확인하였다. 따라서 , 본 발명의 핵산분자는 우수한 발아율에 기반한 장기간의 종자 저장이 가능하도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 , 본 발명의 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 (ribozyme)， PNA(pept ide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는， 본 발명의 핵산 분자는 T-DNA 이다.
본 명세서에서 용어 ᄆ^皿ᄆ는 특정 mRNA 의 절단 (cleavage)을 통하여 RNAKRNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬
RNA 를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA 와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA 는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적 인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 , 유전자치료 (gene therapy)의 방법으로 제공된다. siRNA 는 RNA 끼리 짝을 이루는 이중사술 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대웅하는 염기가 상보적 이지 않음) , 벌지 (일방의 사슬에 대웅하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기， 바람직하게는 15 내지 80 염기， 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt )말단 혹은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다 . 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다 . 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어， 염기 수로는 1 내지 8 염기 ， 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한， siRNA 는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어 , 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어 , tRNA, rRNA, 바이 러스 RNA 와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고， 이중사슬 RNA 의 일방의 말단 부위가 링 커 RNA 에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링 커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "shRNA" 는 단일 가닥으로 50-70 개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며 , in vivo 상에서 스템 -루프 (stem-loop) 구조를 이루고 있다 . 5-10 개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29 개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA 가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성 한다 .
본 명세서에서 용어 "miRNA(microRNA)" 는 유전자 발현을 조절하며 , 전장 20-50 개 뉴클레오타이드， 바람직하게는 20-45 개 뉴클레오타이드， 보다 바람직하게는 20-40 개 뉴클레오타이드 , 보다 더 바람직하게는 20- 30 개 뉴클레오타이드 , 가장 바람직하게는 21-23 개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA 분자를 의미한다. miRNA 는 세포내에서 발현되지 않는 을리고뉴클레오타이드이며 , 짧은 스템 -투프 구조를 가진다. miRNA 는 1 또는 2 이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며， 상기 mRNA 와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시 킨다 . 본 명세서에서 용어 "리보자임 (ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA 를 절단하는 영역으로 되어 있다.
본 명세서에서 용어 "PNA(Peptide nucleic acid)" 는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서 , DNA 또는 RNA 와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA 는 핵산염기 (nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음보고되었다 (문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt 0, "Sequenceᅳ selective recognition of DNA by strand dis lacement with a thymine-subst i tuted polyamide" , Science 1991, Vol. 254： pp 1497- 1500] ) . PNA 는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화0¾ 1^^23 011) 반웅을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다， PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2- 아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며， 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격 (backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA 는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소 (nuclease)나 단백질분해효소 (protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 을리고뉴클레오타이드" 이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고， mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA 의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 오타이드 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA 에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA 에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역， 세포질내로의 전위 (trans의 cation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고， 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격 (backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al . , Curr Opin Struct Biol. , 5(3) :343-55, 1995) . 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트， 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트， 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한， 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티 (sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다ᅳ 변형된 염기에는 하이포크잔틴， 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘 (특히 5- 메틸시토신), 5-하이드톡시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌， 2—티오우라실， 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5- 하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6- 아미노핵실)아데닌， 2, 6-디아미노퓨린 등이 있다.
본 명세서에서 용어 "T-DNA" 는 Agrobacterium 종의 Ti (tumor- inducing) 플라스미드의 전달 (transfer) DNA 로서 숙주 식물세포의 핵으로 전달되는 DNA 절편을 말한다. T-DNA 의 양 끝 가장자리에는 25 bp 의 반복서열이 존재하며， 전달은 왼쪽 경계 (border)에서 전달이 시작되어 오른쪽 경계에서 종료된다. 박테리아 T-DNA 는 약 20,000 bp 길이로서 이들의 삽입에 의하여 타겟 유전자를 붕괴시킴으로서 삽입 돌연변이 (insertional mutagenesis)를 일으키는 데에 사용되며， 삽입된 T- DNA 서열은 돌연변이를 일으킬 뿐 아니라 타겟 유전자를 표지하기도 한다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 Ti 플라스미드의 형질도입을 통하여 유전자가 발현 억제된 애기장대의 종자를 이용하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명에서 개시하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산분자; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합 (operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 백터를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 이용되는 핵산분자, 식물발현용 재조합 백터 및 이를 식물체에 도입하는 방법은 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물 및 발아촉진용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성에 관여를 하며, 이를 과발현시킨 형질전환 식물체는 가뭄 스트레스를 비롯한 각종 비생물학적 스트레스에 대한 내성이 탁월하여 재배지역의 기후에 구애받지 않는 신기능 작물로 유용하게 이용될 수 있다.
(C) 또한， 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 ABA 호르몬에 대한 민감성에 관여를 하며, 이를 발현억제시킨 식물체는 발아능이 크게 개선되어 저장기간이 증가된 신기능 식물체 및 바이오매스로 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 다양한 비생물학적 스트레스 및 ABA 호르몬 처리 후 AtAIRP2 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다. ABA호르몬 (도 la), 건조 스트레스 (도 lb), 염분 스트레스 (도 lc), 및 냉해 스트레스 (도 Id)를 각각 처리한 후 각각의 RNA 를 분리하여 그 유전자의 발현 패턴을 확인하였다. 건조, 염분 및 Cold 처리의 대표적인 컨트를 유전자로 RD29A를 사용하였고， ABA 처리구에서는 RAB18유전자를 사용하였다.
도 2 는 조직 염색화학 GUS 분석으로 AIRP2 유전자의 프로모터 활성을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 100 Μ ABA 를 3 시간 처리하거나 건조 스트레스를 2 시간 동안 주었을 경우 GUS 신호가 강하게 나오며 이는 AtAIRP2프로모터의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 3 은 AtAIRP2 단백질의 효소 활성을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. AtAIRP2 단백질들에 MBPOnaltose binding protein)를 붙인 다음 오토 -유비퀴티네이션을 수행한 것으로, HIS-UBAl, HIS-UBC8, 유비퀴틴 및 MBP-AtAIRP2 를 1 시간 동안 30°C에서 배양 후 단백질 변화를 확인하기 위해서 MBP 및 유비퀴틴 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. AtAIRP2 단백질의 분자량이 증가됨을 MBP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 알 수 있었고， 이들의 증가가 유비퀴틴에 의한 것인지를 확인하기 위해 유비퀴틴 항체를 사용하였다 . 이 결과， AtAIRP2 단백질은 유비퀴틴 단백질을 붙여주는 E3 유비퀴틴 라이 게이즈의 효소활성 능력을 가짐을 알 수 있었다.
도 4 는 AtAIRP2 유전자 돌연변이체 및 이의 건조스트레스 저항성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4a 는 ^^/^ 유전자의 genomic DNA 에 T-DNA 가 삽입된 지도를 나타낸 그림이며， T-DNA 가 유전자의 액손 a/r/ - 1) 및 인트론 ( 3//ᅳ/ - 에 삽입된 위치를 보여준다. 도 4b 는 이들 돌연변이체의 지놈 DNA 를 추출하여 이 유전자와 T-DNA 부근의 프라이머를 이용하여 PCR 의 방법으로 T-DNA 가 삽입되었음을 보여준다. 도 4c 는 돌연변이체의 RNA 를 추출하여 RT-PCR 의 방법으로 유전자의 발현을 조사한 결과를 나타낸 그림 이다. 이들 결과를 토대로 돌연변이체는 해당 유전자의 발현이 억제됨을 알 수 있었다. 도 4d 는 AtAIRP2 유전자의 돌연변이체와 야생형 애기장대의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교한 그림 이다. 2 주 동안 키운 각각의 식물체에 13 일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후, 물을 층분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 돌연변이체가 야생형에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 낮은 저항성을 보였다.
도 5 는 AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체에 관한 그림이다 . 35S:AtAIRP2-GFP 재조합 백터로 형 질전환된 애기장대를 제작하여 GFP 항체를 이용하여 과다발현 여부를 확인하였다 (도 5a) . 웨스턴 블롯팅 결과 AtAIRP2-sGFP 단백질이 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다 . 도 5b 는 AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체와 야생형 애기장대의 건조 스트레스에 대한 저항성을 비교한 그림 이다. 2 주 동안 키운 각각의 식물체에 14 일 동안 물을 주지 않고 건조 스트레스를 처리 한 후 , 다시 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 과다발현 형질전환체가 야생형에 비해 건조 스트레스에 대해 저항성 이 높은 것을 알 수 있었다. 도 6 은 AtAIRP2 유전자의 돌연변이체 및 과다발현 형질전환체의
ABA 호르몬에 관한 종자의 발아 분석결과를 나타낸 그림이다. 도 6a 는 ABA 호르몬을 각각 0. 1， 0.5 uM 의 농도로 처리된 배지에 야생형， atairp2-l 및 atairp2-2 돌연변이체를 심은 후 7 일 후에 찍은 사진이다 . 돌연변이 식물체의 경우 야생형에 비해 ABA 가 포함된 배지에서 발아가 잘 되는 것을 알 수 있었다. 도 6b 는 ABA 호르몬을 각각 0.2， 0.4 μ Μ 의 농도로 처리된 배지에 야생형， atairp2-2 및 AtAIRP2sGFP 과다발현 형 질전환 식물체를 심고 7 일 후에 사진을 찍은 것이다. ^ / 유전자의 과다발현 형질전환 식물체의 경우 ABA 호르몬이 들어간 배지에서 발아가 현저히 저해되는 것을 알 수 있었고 , 또한 atairp2-2 돌연변이체는 같은 조건에서 저항성을 보임을 알 수 있었다 . 따라서 ABA 호르몬에 의해 과다발현 형 질전환체는 발아율이 떨어지며， 돌연변이체는 발아율이 증가된 것을 알 수 있었다.
【발명을 실시하기 위한 구체적 인 내용】
이하 , 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업 계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시 예
실험방법
유전자의 분리 획득
본 발명자들은 ABA 호르몬 및 비생물학적 스트레스에 의해서 유도되는 AIRP2 유전자를 애기장대의 cDNA 로부터 분리 획득하였다. 10 일된 야생형 애기장대의 유묘를 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 분말로 만든 다음 1 g 당 2 ml 의 추출 완충액 (4 M 구아니딘 -HC1 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA(USB) , 0.5% 사르코실 (SIGMA, pH 9)과 β - 머갑토에탄을 (SIGMA-ALDRICH)을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI (페놀 ： 클로로포름 ： 이소아밀알콜 = 25 ： 24 ： 1)와 흔합하여 5 분간 흔들어 준 다음 3 , 500 rpm 에서 25 분간 원심분리 (한일 원심분리기， HA-1000-3)하였다 . 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고 , 동량의 PCI 를 흔합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2 회 반복하여 수행하고， 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2 회 에탄을 침 전 및 1 회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA 를 분리하였다. 정량을 통해 2 의 RNA 를 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역 전사효소 (Fermentas)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR수행을 위해 주형으로 20 ng 의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완층용액 (Takara) 5 ≠, dNTP 흔합액 (각 1.25 mM) 8 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제 (Takara)를 넣어 총 부피를 50 로 만들었다. Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR 을 수행하였다. 사용한 프라이머는 5 ' -ATGCGAAAATCGTTCAAGGA-3 ' (At AIRP2 ORF F¥: 서열목록 게 3 서열) 및 5'- TCACCGAGGAAGAGGAGCATAA-3 ' (AtAIRP2 ORF RV: 서열목록 제 4서열)이다. 먼저 94°C에서 2 분간 변성시킨 후, 94°C에서 30 초， 52°C에서 30 초, 721C에서
1 분을 반복하는 것을 30 회 수행하였고, 30 회 반복이 끝난 후 72°C에서 5 분간 추가로 중합반웅을 수행한 다음 전기영동 방법을 이용하여 AtAIRP2 유전자의 증폭을 확인하였으며， 상기 DNA 를 시퀀싱하여 다시 한번 확인하였다. 식물성장조건 및시료 채취
AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭션을 하였다. 먼저 pENTR SD Topo 백터 (Invitrogen, USA)에 AtAIRPl-sGFP 를 넣어준 후, LR clonase 효소 (Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pEarlygate 100 백터 (Arabidopsis research center, USA)에 치환시켰다. AtAIRP2 발현억제 돌연변이 식물체는 AtAIRP2 의 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이 애기장대의 종자 (종자번호: SAIL_686_G08(atairp2-l), Salk_005082(atairp2-2))를 SIGNAL Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (http://signal .salk.edu/)에서 구입하였다.
이러한 AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체， AtAIRP2 유전자가 파괴된 돌연변이체 및 야생형 애기장대 종자를 30% 락스 (유한 -크로락스)와 0.025%의 트리톤 X-100 에 10 분간 살균 처리한 후 물로 10 번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스， B5 비타민 (12 mg/L) , 0.8% 아가로 구성되어있는 MS 배지 (Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약
2주간 생장 챔버 (16시간 광조건 / 8시간 암조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. 빛 조건의 전체 식물체 (Green whole plant)를 재료로 사용한 경우는 종자를 Sunshine MIX #5 (Sun GroHorti culture) 홁을 넣어 준 화분에 심어서 약 3 주간 생장 챔버 (16 시간 광 조건 /8 시간 암 조건)에서 성장시킨 식물을 재료로 하여 수행하였다. 스트레스 (염, 저은, 건조， ABA 호르몬) 처리
스트레스에 대한 AIRP2 유전자의 발현을 확인하기 위해， 건조 스트레스는 배지에서 2 주간 키운 야생형 애기장대 유묘를 공기 중에 노출한 후 1 시간 및 2 시간 후에 샘플링하였다 . 염 스트레스는 2 주간 키운 애기장대에 300 mM 의 염화나트륨을 처리한 후 1.5 시간, 3 시간이 경과한 후 샘플링하였다. 저은 스트레스는 배지에서 2 주간 키운 애기장대 유묘를 4°C가 유지되는 인큐베이터에서 12 시간 및 24 시간 동안 배양하고 조직을 샘플링하였다. ABA 호르몬 처리는 2 주간 키운 애기장대 유묘를 100 μ Μ 의 ABA(SIGMA)를 처 리한 후 1.5 시간 및 3 시간이 경과한 후 샘플링 하였다 . 샘플링 된 조직을 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 가루로 만든 다음 1 g 당 2 ml 의 추출 완충액 (4 M 구아니딘 -HC1 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA(USB) , 0.5% 사르코실 (SIGMA) , PH 9)과 β -머갑토에탄을 (SIGMA- ALDRICH)을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI (페놀 ： 클로로포름 ： 이소아밀알콜 = 25 ： 24 ： 1)와 흔합하여 5 분간 흔들어 준 다음 3 ,500 rpm 에서 25 분간 원심분리 (한일 원심분리기， HA- 1000-3)하였다. 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고， 동량의 PCI 를 흔합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2 회 반복하여 수행하고 , 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2 회 에탄을 침전 및 1 회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA 를 분리하였다. 정량적 역전사효소 (RT)-PCR
발현억제 돌연변이 식물체 및 과발현 형질전환 식물체와 야생종의 잎으로부터 전체 RNA 를 추출하여 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소 (Ferment as)를 이용하여 단일가닥 cDNA 를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng 의 cDNA 를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩， 10 x Taq 폴리머라제 완충용액 ( Intron) 5 ≠, dNTP 흔합액 (각 1.25 mM) 8 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제 ( intron)를 넣어 총 부피를 50 로 만들었다 . Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR 을 수행하였다. 먼저 94°C에서 2 분간 변성시 킨 후 , 94°C에서 30 초， 52°C에서 30 초 , 72°C에서 1 분을 반복하는 것을 25 회 수행하였고， 25 회 반복이 끝난 후 72°C에서 5 분간 추가로 중합반웅을 수행한 다음 -20°C에 넁동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1 과 같다. 【표 1】
RT-PCR 에 사용된 유전자의 프라이머
Figure imgf000019_0001
T-DNA 7} 삽입된 돌연변이체의 지놈 DNA 추출 및 동형접합 돌연변이체 획득 야생형 및 발현억제 돌연변이 애기장대의 종자를 흙에 심어 2 주 동안 키운 뒤 각각의 잎을 샘플링한 후 액체질소를 이용하여 간 후 CTAB 완충액 (2 % CTAB, 100 mM Tr i s pH 8， 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl , 2 % PVP) 700 ml 를 넣고 흔합하고 65°C에서 10 분 동안 가열하였다. 클로로포름 200 ml 를 넣고 흔합한 후 원심분리를 통해 상층액을 얻어내고 이소프로판을을 섞어 DNA 를 침전시켰다. 원심분리 후 얻어진 침전물을 70% 에탄을로 세척한 뒤 말려서 얻어진 지놈 DNA 를 물로 녹여서 사용하였다. 이후 T-DNA 보더 프라이머 (boder pr imer ) (LB_6313R)와 T-DNA 가 삽입된 부위의 앞 , 뒤 부분의 프라이머를 이용하여 지노타이핑 PCR 을 진행하였다.
【표 2]
지노타이핑 PCR 및 RT-PCR 에 사용된 프라이머
Figure imgf000019_0002
AtAIRP2 유전자의 발현억제 돌연변이체에 있어서 T-DNA 가 두 번째 엑손 및 첫번째 인트론에 삽입된 것을 알 수 있었고， T-DNA 가 삽입된 지역의 앞， 뒤 부분 및 T-DNA의 보더 프라이머를 이용하여 PCR의 방법으로 T-DNA 가 삽입됨을 보여준다 (도 4b). 또한 발현억제 돌연변이체의 RNA 를 추출하여 RT-PCR 의 방법으로 AtAIRP2 FW1 및 AtAIRP2 RV1 프라이머를 이용하여 유전자의 발현이 억제된 것을 알수 있었다 (도 4c).
AtAIRP2유전자의 백터 구축물의제조
말토오즈에 결합하는 단백질과 AtAIRP2 를 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해 AtAIRP2 의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 각각 Xbal 과 Pstl 제한효소에 해당하는 서열을 연결한프라이머 세트를 이용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X 백터 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 Xbal 및 Pstl 제한효소로 자른 다음 T4 DNA 라이가제 (New England Bio Lab) 효소를 이용하여 라이게이션 (ligation) 하였다. 재조합된 MBP-AtAIRP2 을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3) RIL (스트라테이진)에 발현시킨 후， 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. 단백질은 표준 단백질로 BSA 를 이용해 정량하였다. 또한, 본 발명에서는 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭션을 하였다. 먼저 pENTR SD topo 백터 (Invitrogen, USA)에 AtAIRP2-sGFP 를 넣어준 후， LR clonase 효소 (Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pEarlygate 100 백터 (Arabidopsis research center, USA)에 치환시켰다. 아그로박테리움으로 AtAIR2 형질전환및 형질전환 애기장대식물체의제조 제작된 구축물은 아그로박테리움 (GV3101)에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다. 약 4 주된 애기장대 (Columbia [Col-0])의 지상 부위를 0.05 % 실웨트가 포함된 MS 배지 (Duchefa Biochemie)에 1 분 30 초간 담구는 방법으로 형질전환 시켰다 (clough and Bent, 1998, Plant J 16； 735-743). 약 3 주간 23°C의 생장 챔버에서 배양하고， 종자를 받은 후 (T1), 25 ug/mi 의 바스타 (Glufosinate ammonium)와 250 /g/mJi의 카르베니실린이 포함된 배지에서 살아남는 개체들을 골라 형질전환 유전자의 존재 여부를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다. 과다발현은 항 -GFP (clontech) 항체를 이용해 관찰하였다.
AtAIRP2 단백질의효소활성 분석
본 발명에서는 AtAIRP2 단백질의 효소활성 분석을 위해, pMAL-X 백터에 AtAIRP2 유전자의 0RF 를 MBPOnaltose binding protein) 프레임에 맞게 서브클로닝을 수행하였다. 40 mM Tris-HCl, H 7.5, 5 mM MgC12,2mMATP,2mM디티오트레이를 (DTT) , 300 ng/ μί 유비퀴틴 (Sigma), 25 μΜ MG132CA.G. Scientific Inc.), 500 ng UBAKABRC, http://www.arabidopsis.org)， 500 ng UBC8(ABRC, http://www.arabidopsis.org), MBP-AtAIRP2 500 ng을 각각의 튜브에 넣어준 후 30°C 배양기에서 배양하였다. 샘플 완층용액을 넣어준 다음 100°C에서 5 분간 끓이고 항 -MBP(New England Bio Labs), 항-유비퀴틴 (Santa Cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 식물체생장 비교
ABA 호르몬에 대한 표현형을 비교하기 위해서 야생형, AtAIRP2 발현억제 돌연변이 식물체， AtAIRP2 과다발현 식물체에서 얻어진 종자를 ABA 호르몬이 0, 0.1， 0.2， 0.4 및 0.5 μΜ 로 첨가된 배지에서 7 일 동안 키운 후 발아된 정도를 비교하였다. 염분에 대한 표현형을 비교하기 위해서 야생형, AtAIRP2 발현억제 돌연변이 식물체, AtAIRP2 과다발현 식물체에서 얻어진 종자를 염화나트륨이 0, 75, 100 및 125 mM로 첨가된 배지에서 7일 동안 키운 후 발아된 정도를 비교하였다. 성체식물의건조스트레스에 대한 민감도 측정
야생형 및 AtAIRP2 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 종자를 홁에서 2 주 동안 키운 뒤， 각각 13 일 또는 14 일 동안 물을 주지 않다가 다시 물을 준 후 건조스트레스에 내성을 갖는 정도를 측정하였다. 조직 염색화학 GUS분석 (Histochemical GUS assay)
10 일 동안 배지에서 키운 야생형 애기장대를 lOOmM ABA 및 가뭄 스트레스를 각각 3 시간또는 2 시간동안 처리한 뒤 90% 아세톤으로 5분간 고정시켰다. 아세톤을 제거한후, 50mM NaP04,lmM K3Fe(CN)6,lmM K4Fe(CN)6가 첨가된 Rincing solution 으로 3 회 워싱하였다. 워싱이 끝나면 행굼액 (Rincing solution)에 2mM X-Gluc ( 5-br omo-4-ch 1 or o~3- i ndo 1 y 1 glucuronide, sigma)이 포함된 용액으로 교환해주고 1 분간 버큼을 처리하였다. 371C에서 암상태로 색이 변할 때까지 염색한 후, 90% 에탄을로 클로로필을 제거해주었다. 실험결과
스트레스 (염， 저은, 건조)처리시 MAIRP2의 발현양상
다양한 비생물학적 스트레스에서 AtAIRP2 유전자의 발현을 RT-PCR 로 확인하였다. 저온 (12시간, 24시간) 및 건조스트레스 (1시간, 2시간), 300 mM 농도의 소금물을 1.5 시간 및 3 시간 처리한 후, 100 μΜ ABA 호르몬을 1.5 시간 및 3 시간 처리한 후 각각의 RNA 를 뽑아서 그 유전자의 발현 패턴을 확인한 결과 각각의 스트레스 및 호르몬을 처리하지 않았을 때보다 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며， 이에 AtAIRP2 유전자는 저은, 건조, 염분 스트레스 및 ABA 호르몬에 의해서 발현이 유도됨을 확인하였다 (도 1). 또한조직염색 화학 GUS 분석을 수행하여 ABA호르몬 및 건조 스트레스를 각각 3 시간 2 시간 처리한 후 염색이 된 정도를 확인한 결과 스트레스를 처리하기 전 보다 잎과 뿌리 조직에서 염색 정도가 진해진 것을 알수 있었다 (도 2).
AtAIRP2 단백질의효소활성 분석
AtAIRP2 단백질들에 MBPOnaltose binding protein)를 붙인 다음 샐프 -유비퀴티네이션을 수행하기 위하여 UBAl, UBC8, 유비퀴틴， AtAIRP2 를 1 시간 동안 30°C에서 배양 후 단백질 변화를 확인하기 위해서 MBP 및 유비퀴틴의 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. MBP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 AtAIRP2 단백질의 분자량이 증가한다는 사실을 확인하였고, 유비퀴틴 항체를 이용하여 이들의 증가가 유비퀴틴에 의한 것임을 확인하였다 (도 3). 이 결과를 토대로 AtAIRP2 단백질은 유비퀴틴 단백질을 붙여주는 리가아제의 효소활성 능력을 가짐을 알수 있었다. atairp2 돌연변이체 확보
도 4a 에서 보는 바와 같이 , 돌연변이체의 제작을 위하여 T-DNA 가 두 번째 액손 및 첫 번째 인트론에 삽입된 구조의 유전자를 이용하였다. 삽입 여부 및 위치를 확인하기 위하여 T-DNA 의 보더 프라이머와 T-DNA 가 삽입된 부분의 좌우의 프라이머를 이용하여 지노타이핑 PCR 을 수행한 결과 T- DNA 가 유전자 진행방향과 동일한 방향으로 삽입된 것을 확인하였다 (도 4b) . 또한 돌연변이체에서 전체 길이의 AtAIRP2 유전자의 mRNA 의 발현 유무를 알아보기 위해서 지노타이핑 PCR 에서 사용한 동일한 유전자 프라이머를 이용하였고， 그 결과 AtAIRP2 유전자가 발현되지 않는다는 사실을 확인하였다 (도 4c) . 성체 식물의 건조 스트레스에 대한 민감도 측정
AtAIRP2 유전자의 발현억제 돌연변이체와 야생형 애기장대의 건조 스트레스에 대한 저항성을 측정하기 위하여 2 주 동안 키운 각각의 식물체에 13 일 동안 물을 주지 않고 건조 스트레스를 가한 후， 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 야생형 식물체의 경우 85%가 생존해 있는 반면 발현억제 돌연변이 체는 각각 25¾>， 35% 만이 생존해 있어 돌연변이 식물체가 야생형에 비해 건조스트레스에 대한 저항성 이 낮은 것을 알 수 있었다 (도 4d) . AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 알아보기 위해 바스타 선별 (Basta select ion)을 통해 얻어진 각각의 형질전환체의 동형접합 (homozygous) 식물체를 확보하였다. 여기서 얻어진 종자를 배지에 심어 GFP 항체를 이용하여 #10 및 #19 형질전환체에서 단백질이 잘 만들어짐을 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 5a) . AtAIRP2 유전자의 과다발현 형질전환체와 야생형 애기장대 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교하기 위하여 2 주 동안 키운 각각의 식물체에 41 일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후， 물을 층분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 야생형의 경우 10%, AtAIRP2 과다발현 식물체인 #10 은 87. , #19 은 84.2% 살아난 것을 알 수 있었다. 따라서 과다발현 형 질전환체가 야생형 식물체들에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 저항성 이 높다는 것을 알 수 있었다 (도 5b) . 식물체 발아율 비교 ABA 호르몬을 각각 0.1, 0.5 μΜ 의 농도로 처리된 배지에 야생형， 돌연변이체를 심은 후 7 일 동안 키운 후 발아된 정도를 비교해 본 결과， 해당 유전자의 돌연변이체는 같은 조건에서 저항성을 보임을 알 수 있었다 (도 6a). 야생형 애기장대와 AtAIRP2 유전자의 발현억제 돌연변이 및 과다발현 형질전환 식물체를 ABA 호르몬이 각각 0， 0.2， 0.4 μΜ 의 농도로 처리된 배지에서 발아 테스트를 한 결과, ABA 호르몬에 의해 AtAIRP2-sGFP 과다발현 형질전환 식물체는 발아율이 떨어지며， 발현억제 돌연변이체는 발아율이 증가된 것을 알 수 있었다 (도 6b).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
【청구항 3]
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스, 저온 스트레스 및 염 스트레스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
【청구항 4】
제 3 항에 있어서， 상기 비생물학적 스트레스는 건조 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
【청구항 5】
(a) 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합 (operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 백터를 포함하는 식물체의 비생물학적 스트레스 내성 증진용 조성물.
【청구항 6】
제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물세포.
【청구항 7] 제 1 항 또는 제 2 항의 조성물로 형질전환된 비생물학적 스트레스 내성이 증진된 식물체.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 식물체는 벼， 밀， 보리， 옥수수， 콩， 감자， 밀， 팔， 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대， 배추， 무， 고추， 딸기, 토마토， 수박， 오이， 양배추, 참외, 호박， 파， 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배， 목화， 참깨， 사탕수수， 사탕무우， 들깨， 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무， 배나무， 대추나무， 복숭아， 양다래, 포도, 감귤， 감， 자두， 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스， 거베라， 카네이션， 국화， 백합 및 틀립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스， 레드클로버， 오차드그라스， 알파알파， 를페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9】
서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
【청구항 10】
제 9항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 계 1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
【청구항 111
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서， 상기 핵산 분자는 T-DNA, siR A, shRNA, miRNA, 리보자임 (ribozyme)， PNA( peptide nucleic acids) 또는 안티센스 을리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12] 제 11항에 있어서， 상기 핵산 분자는 T-DNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13]
(a) 제 9 항 또는 제 10 항의 핵산분자; (b) 상기 핵산분자에 작동적으로 결합 (operatively linked)되어있고 식물세포에서 R A 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 백터를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.
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