KR101758868B1 - ＬｓＲＺＦ1 안티센스 유전자 도입에 의한 건조 내성이 증진된 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조 스트레스 내성 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 건조 스트레스에 대해 내성을 갖는 수박대목용 공대수박이다. 상기 건조 스트레스에 대해 내성을 갖는 공대수박을 수박대목으로 이용하면, 수박 재배시 관수노력 절감, 토지이용 극대화, 및 물 절약을 유도 할 수 있고, 수확 전 단수기간 연장으로 수박 당도 등의 품질을 향상시킬 수 있으며, 내재성 강화 작물에 따른 작물의 수확량 개선 및 종자산업의 활성화를 유도할 수 있다.

Description

ＬｓＲＺＦ1 안티센스 유전자 도입에 의한 건조 내성이 증진된 형질전환체{Transgenic Plants with enhanced Drought-Stress Tolerance by Introducing LsRZF1 antisense gene}

본 발명은 ＬｓＲＺＦ1 안티센스 유전자 도입에 의한 건조 내성이 증진된 형질전환체에 관한 것이다.

수박은 전 세계적으로 재배되고 있는 작물로 현재 중국, 이란, 터키, 미국, 프랑스, 러시아, 오스트리아 등 108개국에서 광범위하게 재배되고 있으며 재배면적과 생산량은 중국이 1위를 차지하고 있다. 우리나라의 수박 재배면적은 1995년 45,207ha(노지, 26,230 ha; 시설, 18,977 ha)를 정점으로 점차 줄어들고 있으며 현재 19,008 ha (노지, 3,271 ha; 시설, 15,757 ha)에 이르렀다. 이와 같은 노지 재배면적의 감소의 결정적 요인은 매년 착과후 과실비대 시기의 수박은 병이나 환경스트레스(특히, 건조)에 매우 약한 시기여서 노지수박의 재배농가들에 막대한 피해를 주기 때문이다. 이러한 피해와 문제점을 해결할 수 있는 대안 중 하나의 방법으로 병저항성 혹은 내재해성 접목(대목) 품종의 개발에 있다.

수박재배 시 대목으로 사용되는 작물은 호박, 박, 안동오이, 동아, 공대수박 등이 있으며, 그 중에서도 공대수박은 수박과의 접목친화력이 강하여 대목으로 사용할 경우 수박의 당도를 높이기에 매우 좋은 특성을 가지고 있다. 그러나 공대수박은 환경재해에 약하기 때문에 반 촉성재배나 조숙재배에서는 사용하기 어려운 실정이다. 따라서 생명공학적 방법에 의하여 수박재배용 대목품종에 생물재해 및 환경재해에 대한 저항성을 높여주면 수박의 품질저하를 막을 수 있으며 대목의 다른 장점들을 계속해서 유지할 수 있을 것이다.

지구온난화 및 이상기후에 따른 극심한 가뭄 혹은 저온 스트레스에 의해 농작물의 피해가 점점 증대할 뿐만 아니라, 수자원(물)의 확보 및 작물재배에 있어서 관수 방법 개발이 세계 모든 국가가 갖고 있는 앞으로의 사회적ㆍ산업적인 문제점으로 대두되어지고 있다. 특정 조건하에서의 세포 내 수분 항상성 유지는 식물 생장 및 대사 작용에 매우 중요하기 때문에 삼투조절물질 조절 기작연구는 식물 발달 최적화 시스템 개발에 매우 중요한 분야이다. 보습효과가 뛰어난 삼투조절물질인 프롤린은 가뭄 및 저온 등 식물 환경스트레스에 대해 농작물이 생장하는데 있어서 매우 중요한 물질이다. 또한, 프롤린은 단백질 합성뿐만 아니라, 광합성 효율, 개화시기 및 배아 발달에 아주 중요한 신호 분자로 최근 알려지고 있다.

단백질 번역 후 변형 과정은 세포 내 단백질의 올바른 기능을 하기 위해서 매우 중요한 세포학적 과정이고, 그러한 세포학적 기능 연구는 스트레스 조건하에서 식물 생장 및 발달 기작 규명에 아주 중요하나 현재 초보적인 수준이라 말할 수 있다. 특히 세포 내 단백질 번역 후 유비퀴틴화(ubiquitination) 과정은 단백질 분해 및 상호결합작용, 효소 활성 등을 통하여 비생물학적 스트레스 반응, 세포 주기 진행, 신호 전달, 식물 발달, 노화 과정, 방어 기작 등을 조절하는 매우 중요한 번역후변형(post-translational modification) 방법 중 하나이다. 단백질 번역 후 유비퀴틴화 과정에 의해 프롤린 대사 조절 네트워크 기작 규명은 현재까지 밝혀지지 않았으며, 이러한 단백질 유비퀴틴화 과정은 식물 생장 및 발달 기작 규명에 필수적인 연구라 할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 수박의 품질 및 수확량을 개선시키기 위하여 수박 재배에 대목으로 이용되는 공대수박의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 내성을 갖는 형질전환체를 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 참박(Lagenaria siceraria) 유래 LsRZF1 단백질이 건조 스트레스에 대한 내성에 관여함을 확인하고, 상기 LsRZF1 안티센스 유전자를 공대수박에서 과발현 시킬 경우에 건조 스트레스 내성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 건조 스트레스 내성 형질전환체을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 LsRZF1 단백질의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명자들은 수박의 품질 및 수확량을 개선시키기 위하여 수박 재배에 대목으로 이용되는 공대수박의 비생물적 스트레스(abiotic stress) 내성을 갖는 형질전환체를 제조하고자 노력하였다. 그 결과, 참박(Lagenaria siceraria) 유래 LsRZF1 단백질이 건조 스트레스에 대한 내성에 관여함을 확인하고, 상기 LsRZF1 안티센스 유전자를 공대수박에서 과발현 시킬 경우에 건조 스트레스 내성을 나타냄을 확인하였다.

비생물적 스트레스는 식물체의 성장 및 발달에 매우 해로운 영향을 미치며, 건조(drought) 스트레스, 저온(cold) 스트레스 및 염(salt) 스트레스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 용어 "건조 스트레스(drought stress)"는 물의 부족/결핍(water deficit)에 의한 스트레스를 의미한다. 상기 건조 스트레스는 정상적인 지질 이중막(lipid bilayer)에 구멍이 뚫리는 현상을 유도하며, 최종적으로 이의 파괴를 초래한다. 보다 상세하게는, 물의 부족/결핍은 지질 이중막 내 막 단백질의 구성의 변화를 유도하여 막 통합성(membrane integrity) 및 선택성(selectivity), 세포 내 구획화(cellular compartmentalization )의 파괴, 그리고 효소 활성의 소실을 야기한다. 이 외에도, 세포질 및 소기관 단백질들은 탈수화의 정도에 따라 활성 감소 또는 분해를 거친다. 또한, 탈수에 따른 세포 내 전해질의 증가는 세포 내 대사과정의 파괴를 초래할 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명자는 건조 스트레스를 유도하고자 유식물체에 3일 마다 물을 주어 정상적으로 생장시켰고, 1주 후 건조 스트레스를 처리하였다. 실험군은 7일 동안 물을 공급하지 않음으로써, 건조 스트레스를 유도하였고, 대조군은 3일마다 물을 주어 정상적으로 생장시켰다.

본 발명의 LsRZF1 단백질의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체는 상기 핵산 분자에 의해 LsRZF1 단백질의 발현이 억제되어 건조 스트레스에 대한 내성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 LsRZF1 단백질은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명에서 핵산 분자에 의해 발현이 억제되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체는 LsRZF1 단백질의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된다.

본 명세서에서 용어, "핵산 분자(nucleic acids)"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme) 또는 PNA(peptide nucleic acids)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 안티센스 뉴클레오타이드이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징을 갖는다. 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드의 길이는 100 내지 2000 bp(base pair)이고, 바람직하게는 100 내 1500 bp, 500 내지 1500 bp 또는 700 내지 1300 bp이다.

상기 안티센스 뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.

본 명세서에서 안티센스 뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 뉴클레오타이드가 LsRZF1 mRNA에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "shRNA"는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.

본 명세서에서 용어 "miRNA(microRNA)"는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포 내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.

본 명세서에서 용어 "리보자임(ribozyme)"은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.

본 명세서에서 용어 "PNA(Peptide nucleic acid)"는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequenceselective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.

본 발명의 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체을 제조하기 위한 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, lac 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 식물발현용 형질전환 벡터로 사용되는 바이너리 벡터(예: 벡터는 pCAMBIA1301, Ti 플라스미드. pBIB, pBin19, pPVP, pRD400, pRD320, pHS737 등)가 이용된다(An, G. et al., “Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al., Biochem. Soc. Trans. 28:958-961(2000)).

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 의미한다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제(하이그로마이신, 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 등) 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 또한, 본 발명의 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 건조 스트레스 내성 형질전환체를 제조하기 위하여 상기 벡터를 도입한다.

본 발명의 형질전환 세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol. Genet. 199:178-182;(1985)).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 건조 스트레스 내성 형질전환체를 제조하기 위하여 상기 벡터를 아그로박테리움에 형질전환 한다.

본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 예를 들어 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404를 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 동결 융해법(freeze-thaw), 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다.

본 발명의 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체는 건조 스트레스 내성을 갖는 다음 세대로 번식한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 LsRZF1 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 유전성(heredity)을 갖는다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, LsRZF1 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체의 T2 및 T3 세대 형질전환 식물체에서 LsRZF1 안티센스 유전자 발현 및 이의 건조스트레스 내성을 확인하였다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 식물체는 수박 대목용 공대수박(Citrullus lanatus cv. gongdae)이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다:

(a) 상기 제 1 항의 벡터로 아그로박테리움(Agcrobacterium)을 형질전환시키는 단계;

(b) 상기 아그로박테리움을 목적하는 식물의 세포 또는 조직과 공동 배양(co-cultivation)하여 상기 세포 또는 식물조직을 형질전환시키는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, LsRZF1 안티센스 유전자가 클로닝된 pCAMBIA1301 벡터는 동결융해법에 의하여 아그로박테리움에 형질전환한다[Hofgen and Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16:9877 (1998)].

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 식물체는 수박 대목용 공대수박(Citrullus lanatus cv. gongdae)이다.

본 발명의 방법은 상기 LsRZF1 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 건조 스트레스 내성 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 건조 스트레스에 대해 내성을 갖는 수박대목용 공대수박이다.

(b) 상기 건조 스트레스에 대해 내성을 갖는 공대수박을 수박대목으로 이용하면, 수박 재배시 관수노력 절감, 토지이용 극대화, 및 물 절약을 유도 할 수 있고,

(c) 수확 전 단수기간 연장으로 수박 당도 등의 품질을 향상시킬 수 있으며,

(d) 내재성 강화 작물에 따른 작물의 수확량 개선 및 종자산업의 활성화를 유도할 수 있다.

도 1a 내지 1c는 참박 LsRZF1 및 애기장대 AtRZF1 상동유전자들의 연관 관계도를 나타낸다. 도 1a는 참박 LsRZF1의 2차 구조 모식도이고, 도 1b는 참박 LsRZF1 및 애기장대 AtRZF1의 아미노산 서열 비교 분석이다. 도 1c는 참박 LsRZF1 및 애기장대 AtRZF1 상동유전자들간의 C3H2C3-타입의 링 징크 모티프의 모식도를 나타낸다.
도 2는 ABA 처리 후, LsRZF1 유전자들의 발현 양상을 나타낸다. 10일된 참박 유식물체로부터 ABA 호르몬 처리 전(대조군, control) 및 처리 후, 총 RNA를 추출한 다음 qPCR을 통한 LsRZF1 전사 발현 양상 분석한 결과를 보여준다.
도 3a 내지 3c는 AtRZF1 프로모터-GUS 형질전환체의 GUS 발현 분석한 결과를 나타낸다. 도 3a는 AtRZF1 프로모터-GUS 형질전환체로부터 기공에서의 GUS 발현을 나타내는 이미지이고, 도 3b 및 3c는 각각 2주된 AtRZF1 프로모터-GUS 형질전환체로부터 H2O 및 ABA 처리 후, GUS 발현을 분석한 이미지를 보여준다.
도 4는 공대수박 종자를 이용한 형질전환 방법을 간략하게 나타낸다.
도 5는 Lsrzf-안티센스 유전자가 도입된 공대 수박 형질전환체 11개체의 이미지를 나타낸다.
도 6은 수박(참박) LsRZF1-안티센스 유전자(Lsrzf1)에 특이적인 프라이머를 이용한 형질전환 공대 수박의 지노믹(genomic) DNA PCR 분석을 나타낸다. M은 사이즈 마커(1kb ladder, bioneer), WT는 야생형(비-형질전환 식물체), 1열 내지 11열은 Lsrzf1 안티센스 형질전환 추정 식물체를 의미한다.
도 7a 내지 7c는 LsRZF1-안티센스 유전자 도입 공대수박의 형질전환체 검정한 결과를 나타낸다. 도 7a는 LsRZF1-안티센스 유전자 도입 공대수박 대목 형질전환 T1-1, T1-2, T1-3, T1-4, T1-5, T1-6, T1-7, T1-8, T1-9, T1-10 및 T1-11 식물체를 나타내고, 도 7b는 상기 형질전환 식물체 및 대조군 공대수박으로부터 총 RNA를 추출한 후, RT-PCR을 통한 식물체의 유전자형(genotype)을 분석한 결과를 나타낸다. GdActin7 유전자는 로딩 대조군이다. 도 7c는 야생형 및 각 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체들로부터 건조 처리 전(대조군, control) 및 처리 후 (Drought), 프롤린의 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 LsRZF1-안티센스 유전자 도입 T2 세대 형질전환체를 검정한 결과를 나타낸다. T2-1 및 T2-3 형질전환체들의 자식세대 유식물체로부터 지노믹 DNA를 추출한 후, PCR을 통한 식물체의 유전자형 분석한 결과를 보여준다.
도 9는 11종의 T3 세대 LsRZF1-안티센스 공대수박 형질전환체들로부터 지노믹 DNA-PCR 및 RT-PCR을 통해 총 7종의 안티센스 우수 순종 라인들을 선발한 결과를 나타낸다.
도 10은 7종의 T3 세대 LsRZF1-안티센스 우수 순종라인으로부터 내건성에 대한 표현형 분석한 결과를 보여준다. 건조 처리 4일 및 6일 후, 내건성 표현형을 분석하였다.
도 11은 2종의 T3 세대 LsRZF1-안티센스 우수 순종라인으로부터 내건성에 대한 표현형을 분석한 결과를 보여준다. 건조 처리 5-9일 후, 내건성 표현형을 분석하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 유비퀴틴 제어 관련 단백질 LsRZF1

LsRZF1 구조 및 AtRZF1 상동 연관 관계

참박(Lagenaria siceraria) LsRZF1 단백질(서열목록 제2서열의 아미노산 서열 및 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩)은 중심 영역(central region)에 RING H2-타입 징크 핑거 도메인(177-217 aa)(도 1a)이 보존되어 있었으며, 아미노산 서열 분석 결과 애기장대(Arabidopsis thaliana) AtRZF1 단백질과 66% 이상의 상동성 연관이 매우 높았다(도 1b). 또한, 참박 LsRZF1 및 AtRZF1은 C3H2C3-타입의 링 징크 모티프가 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다(도 1c).

ABA 처리 후, 참박 LsRZF1 유전자의 전사 발현 양상 분석

ABA(Abscisic acid) 호르몬에 대한 참박 LsRZF1 유전자들의 기능을 알아보기 위하여, 우선 정량적 PCR(qPCR)을 통해 LsRZF1 유전자의 발현 양상을 살펴보았다[LsRZF1 정방향 프라이머, - GCGGATCCATGTCAGCTGGTCGGAACA - 3’ (BamHI site underlined) 및 역방향 프라이머 5’- GCGAGCTCTCATGGTGAATTAGTGTAT - 3’ (SacI site underlined)]. 발아 후, 10일된 참박 유식물체들을 ABA를 처리하여 qPCR한 결과, LsRZF1 유전자들의 발현 양상은 정상 상태에서 키운 참박 대조군 보다 감소됨을 알 수 있었다. qPCR을 통한 정량 분석 결과, LsRZF1 유전자 전사 발현량은 ABA 조건하에서 5배 정도 감소함을 확인 할 수 있었다(도 2).

AtRZF1 프로모터-GUS 형질전환체로부터 ABA 처리 후, GUS 발현 분석

도 2와 같이, LsRZF1 유전자의 전사 발현이 ABA에 의해 감소됨을 알 수 있었다. 애기장대 AtRZF1 프로모터-GUS 형질전환체들을 이용, ABA 처리 후, 형질전환체들로부터 GUS 발현을 살펴 본 결과, GUS 발현 양상은 정상(H2O 처리) 상태 보다 감소됨을 알 수 있었다(도 3). 또한, 기공에서도 GUS가 발현됨을 알 수 있었다(도 3). 이러한 결과들을 토대로 보았을 때, LsRZF1과 AtRZF1 유전자들은 ABA 반응에 관련됨을 알 수 있었다.

실시예 2: 유전자 도입 공대수박 형질전환체 제조

실험 재료 및 실험 방법

식물재료 및 배양조건

기본 식물인 공대수박(Citrullus lanatus cv. gongdae)은 수박시험장(전북 고창)에서 분양 받아 사용하였다. 종자는 배아(embryo)에 상처가 나지 않도록 종피를 제거하고 멸균수에 침지하였다가 70% EtOH에 3분 동안 침지한 다음 Tween 20^TM 2방울을 떨어뜨린 2% NaOCl에 5분 동안 침지하여 표면 살균하였다. 표면 살균된 종자를 멸균 증류수로 5회 세척한 후 멸균한 필터페이퍼(110 ㎜ Dia, Whatman, USA) 위에 10분 동안 방치하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 종자를 발아 배지(germination medium, GM; MS 솔트 4.4 gl^-1, 수크로오스 30 gl^-1, MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid) 0.5 gl^-1, 피타겔(phytagel) 3 gl^-1)에 치상하여 7일 동안 25℃ 암 조건에서 발아를 유도하였다(Murashige and Skoog, 1962). 발아한 후 페트리-디시(SPL, South Korea)를 광조건 상태로 옮겨 7일 정도 자란 유묘의 자엽은 1×0.5 ㎝ 정도로 2등분 횡절단 하였고, 배축은 0.5 ㎝ 간격으로 절단하여 절편체로 재분화에 사용하였다. 절편은 식물생장조절제의 처리에 따라 페트리-디시당 15개씩 각각 치상하였고 26±2℃, 16시간 광주기, 2000 Lux 광도의 배양실에서 배양하였다.

생장조절제 처리 및 식물체 순화

기본 배지는 MS 기본배지[MS 파우더(Duchefa Biochemie) 202 g/L, MES (BioBasic INC) 0.5 g/L]에 30 gl^-1 수크로오스, 3 gl^-1 피타겔을 첨가하였으며 pH는 5.8로 조정하였다. 생장조절제는 조직배양에서 많이 사용되는 옥신 및 사이토키닌을 사용하였다. 옥신으로는 인돌-3-아세트산(Indole-3-Acetic Acid, IAA)을 사용하였으며 사이토키닌으로는 BAP(6-Benzylaminopurine)를 사용하였다. 배양 4주 후에 분화된 신초(shoot)의 수를 조사하였으며 분화된 식물체는 생장조절제로 1 ㎎l^-1 BA(Benzyladenine)를 단용한 배지에 계대 배양하여 신초를 신장시켰으며 배양병(SPL, Korea)에서 증식하였다. 신초가 3 ㎝ 이상 증식된 개체를 생장조절제를 첨가하지 않은 MS 배지에 배양하면서 뿌리생성을 유도하였다. 뿌리가 형성된 개체는 멸균된 인공배양토(perlite: 부토, 3:1 v/v)에 이식하여 토양 순화하였다.

운반체 재조합 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 도입

식물세포 형질전환용 바이너리(binary) 벡터는 CaMV 35S 프로모터와 항생제 히그로마이신(hygromycin)을 포함하고 있는 pCAMBIA1301 벡터를 사용하였다. 공대수박 형질전환에 사용할 아그로박테리움(Agrobacterium)은 디삼드(disarmed) Ti-벡터를 가지고 있는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주를 사용하였다.

유전자 도입 공대수박 형질전환체 생산

공대수박 종자를 소독한 후 실험방법에서 기술 한 것처럼 치상하여 발아 시킨 다음 아그로박테리움과 공조배양 하였으며 각각의 알맞은 항생배지에서 형질전환체를 선발하였다(도 4).

공대수박 종자를 소독한 후 실험방법에서 기술한 것처럼 치상하여 발아 시킨 다음, 동결융해법[Hofgen and Willmitzer. Nucleic Acids Res. 16:9877 (1998)]을 이용하여 LsRZF1-안티센스 유전자가 삽입된 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움과 공조배양과정을 거쳐 250 ㎍/㎖ 카르베니실린(carbenicillin) 및 3 ㎎/L BAP 및 0.1 ㎎/L IAA가 첨가된 MS 기본 배지에서 3-4주 동안 신초를 형성시켰다. 이후 형성된 신초를 250 ㎍/㎖ 카르베니실린 및 1 ㎎/L BAP만 첨가된 MS 기본배지로 길이 신장를 유도하였으며 이를 다시 5-10 ㎍/㎖ 히그로마이신을 첨가하여 가능성 있는 형질전환체 선발을 진행하였다.

gDNA-PCR 방법

LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박식물체로부터 지노믹 DNA(genomic DNA; gDNA)를 추출한 후, 다음과 같은 프라이머를 이용하여 gDNA-PCR를 수행하였다. 35S 프로모터 삽입여부 및 LsRZF1-안티센스 유전자를 증폭하기 위해서 CaMV35S 프라이머(5’-CTGCCGACAGTGGTCCCAAAG-3’) 및 LsRZF1_F 프라이머(5’-GCGGATCCATGTAGCTGGTCGGAACA-3’)를 이용하였으며, HptII 유전자를 증폭하기 위해서 정방향 프라이머 (5’-TTCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’) 및 역방향 프라이머(5’-GATCGTTATGTTTATCGGCACTT-3’)를 이용하였다. 36회 PCR 사이클 증폭 후, 총 20 ㎕ PCR 산물은 1.2%(W/V) 아가로스 젤에서 확인하였다.

RT-PCR

LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체로부터 총 RNA를 추출한 후, cDNA는 퍼스트-스트랜드 cDNA 키트(Thermo Scientific, USA)에 의해 합성되었다. RT-PCR은 다음과 같은 프라이머에 의해 수행되었다. LsRZF1-안티센스 유전자를 증폭하기 위해 정방향 프라이머(5’-GCGGATCCATGTAGCTGGTCGGAACA-3’) 및 역방향 프라이머(5’-GCGAGCTCTCATGGTGAATTAGTGTAT-3’)를 이용하였으며, GdAct7 유전자를 증폭하기 위해 정방향 프라이머(5’-TGCCAATCTACGAGGGTTAT-3’) 및 역방향 프라이머(5’-GTCCATCGGGCAGTTCATAG-3’)를 이용하였다. 28회 PCR 사이클을 수행한 후, 총 20 ㎕ PCR 산물은 1.2%(w/v) 아가로스 젤에서 확인하였다.

프롤린 함량 측정

프롤린 함량은 Bates et al. (1973) 그룹에 의해 보고된 방법으로 측정하였다.

야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체의 종자(T3 세대)들을 섭씨 30℃의 항온기에서 약 5일 동안 발아를 유도한 후, 원예용 상토가 담긴 포트에 정식하였고, 비닐 온실에서 약 10일 동안 물을 공급하여 각 식물체들을 배양하였다. 물 공급 10일 후, 관수를 중단하여 건조 스트레스를 유도하였다. 이 때 정상조건의 대조군은 물을 계속 공급하였다. 건조 처리 6일 후, 야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체들의 3번째 잎(20 ㎎)을 절단하여 3%의 5’-설포살리실산(5’-sulfosalicylic acid)이 함유된 완충용액(500 ㎕)에 넣어 파쇄하였다. 이 샘플들을 10,000 rpm으로 원심분리를 한 후, 150 ㎕의 상층액과 300 ㎕의 닌하이드린(Ninhydrin) 버퍼 시약(80% 빙초산, 6.8% 인산 및 70.17 mM 닌하이드린)을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 100℃의 온도에서 가열시켜 발색반응을 유도하였다. 가열이 끝난 뒤, 얼음용기에 샘플을 이동시켜 반응을 종료하였고, 샘플 간 프롤린의 함량을 비교하기 위해 톨루엔을 처리하여 발색반응을 비교하였다(도 7c).

표현형 분석

야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체의 종자(T3 세대)들을 섭씨 30℃의 항온기에서 약 5일 동안 발아를 유도한 후, 원예용 상토가 담긴 포트에 정식하였고, 비닐 온실에서 약 10일 동안 물을 공급하여 각 식물체들을 배양하였다. 물 공급 10일 후, 관수를 중단하여 건조 스트레스를 유도하였다. 이 때 정상조건의 대조군은 물을 계속 공급하였다. 건조 처리 4일 및 6일 후, 야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체의 표현형을 비교하였다(도 10).

생리적 표현형 분석

야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체의 종자(T3 세대)들을 섭씨 30℃의 항온기에서 약 5일 동안 발아를 유도한 후, 원예용 상토가 담긴 원형포트에 정식하였고, 비닐 온실에서 약 15일 동안 물을 공급하여 각 식물체들을 배양하였다. 물 공급 15일 후, 관수를 중단하여 9일 동안 건조 스트레스를 유도하였다. 9일 동안 건조스트레스를 받은 야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체에 물을 다시 공급하여 9일 동안 표현형을 관찰하였다. 또한 잎의 수분함량을 분석하기 위하여 관수를 중단하고 건조스트레스를 9일 동안 처리된 각 식물체의 잎으로부터 Barrs and Weatherley(1962)에 의해 보고된 방법에 의해 상대 수분함량(Relative water content)을 측정하였다. 야생형(WT)과 LsRZF1-안티센스 형질전환 공대수박 식물체의 잎을 절단하여 무게(FW)를 측정한 뒤, 절단된 잎을 물이 담긴 튜브에 상온에서 약 4시간 동안 적셔주었다. 4시간 뒤, 4번째 잎의 표면에 있는 물기를 제거해주고 무게(TW)를 측정한 후, 섭씨 60℃의 항온기에 하루 동안 잎을 건조시켰다. 건조시킨 잎의 무게(DW)를 측정하여 다음과 같은 공식을 통해 상대 수분함량을 측정하였다(도 11):

[(FW-DW)/(TW-DW)] × 100=상대 수분함량 (%)

연구결과

LsRZF1-안티센스 공대수박 형질전환체들로부터 유전자 도입 확인

재료 및 방법에 기술한 바와 같이 공대수박에 도입하여 히그로마이신 항생제 첨가배지에서 선발된 개체들의 유전자의 도입여부를 확인하고자 이러한 형질전환체들의 지노믹(genomic) DNA를 분리하여 PCR를 수행한 결과 LsRZF1-안티센스 유전자가 도입된 경우 항생제 선발을 거친 59개체 중 11개체가 gDNA-PCR을 통해 최종적으로 확인되었다(도 4, 5 및 6).

LsRZF1-안티센스 유전자 도입 T0 세대 공대수박 대목 형질전환체 검정

상기 실시예에 의해 제조된 공대수박 대목 형질전환체(T0 세대)들로부터 LsRZF1-안티센스 유전자 도입(안티센스 형질전환체) 여부를 분석하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 공대수박 대목 11종의 형질전환체 T1-1, T1-2, T1-3, T1-4, T1-5, T1-6, T1-7, T1-8, T1-9, T1-10 및 T1-11(도 7a) 및 공대수박(대조군, WT)으로부터 T1-10 형질전환체를 제외한 각 형질전환체 총 RNA 추출 및 cDNA 합성 후, RT-PCR을 수행한 결과, 대조군 공대수박에서는 LsRZF1 PCR 산물을 볼 수 없었으며, 반면에 10종의 안티센스 형질전환체들은 LsRZF1 전사체 밴드들을 확인할 수 있었다(도 7b). 또한, 이러한 형질전환 식물체들로부터 건조 처리 후, 프롤린 함량을 측정한 결과, T1-1, -2, -4, -6, -8 및 -9 형질전환체가 WT(공대수박), T1-3, -5, -7 및 -11 식물체 보다 월등히 프롤린 함량이 높다는 것을 확인할 수 있었다(도 7c). 이러한 결과들을 살펴보았을 때, T1-1, -2, -4, -6, -8 및 -9 형질전환체들은 도입된 LsRZF1-안티센스 유전자에 의해 프롤린 대사를 조절하는 것으로 여겨진다.

LsRZF1-안티센스 유전자 도입 T2 세대 공대수박 대목 형질전환체 검정

우선 2종의 T2-1 및 T2-3 형질전환체로부터 T2 세대 종자 수확 후, LsRZF1-안티센스 유전자가 도입이 되었는지를 확인하기 위하여, 각 형질전환체들의 유식물체로부터 지노믹 DNA 추출 및 35S 프로모터에 해당하는 한쪽 프라이머와 LsRZF1 유전자의 한쪽 프라이머를 가지고 PCR을 수행하였다. 도 8과 같이 야생형(WT)에서는 PCR 산물을 볼 수 없었으며, 반면에 T2-1 형질전환체의 자식세대 중 T2-1-4를 제외한 5개체에서 모두 PCR 산물을 볼 수 있었다. T2-3 형질전환체의 자식세대 중 T2-3-2를 제외한 4개체에서 모두 PCR 산물을 확인할 수 있었다(도 8). 이러한 결과들을 살펴보았을 때, LsRZF1-안티센스 유전자가 T2 세대로 진전되었으며, 아마도 이 2 종의 T2-1 및 T2-3 형질전환체들은 단일 카피의 LsRZF1-안티센스 유전자가 존재할 것으로 여겨진다.

11종의 T3세대 LsRZF1-안티센스 공대수박 형질전환체들로부터 우수 순종 라인 선발

11종의 T3세대 LsRZF1-안티센스 공대수박 형질전환체들로부터 RT-PCR을 통해 총 7종의 우수 순종 라인들을 선발하였다(도 9).

7종의 T3세대 LsRZF1-안티센스 우수 순종라인으로부터 내건성에 대한 표현형 분석

7종의 T3세대 LsRZF1-안티센스 우수 순종라인으로부터 내건성에 대한 표현형을 분석한 결과, K1-16-8, K3-3-1 및 K4-1-1 라인들은 대조구인 WT 표현형과 유사한 반면, K5-5-3, K6-1-6, K7-6-75 및 K9-8-11 라인들은 WT 보다 더 강한 내건성 표현형이 나타남을 알 수 있었다(도 10).

2종의 T3세대 LsRZF1-안티센스 우수 순종라인으로부터 건조스트레스에 대한 생리적 표현형 분석

K5-5-3 및 K6-1-6 순종라인으로부터 건조스트레스 처리 9일 후 생리적 표현형 분석한 결과, 도 11에서 나타난 것과 같이, K5-5-3 및 K6-1-6 순종라인들은 대조구인 WT 보다 내건성이 훨씬 좋음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Transgenic Plants with enhanced Drought-Stress Tolerance by Introducing LsRZF1 antisense gene <130> PN150054 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> Nucleotide Sequence for LsRZF1 <400> 1 atgtcagctg gtcggaacac ccattggtgt catagatgca gaaggtcggt acgtcttcgt 60 ggtagagatg cagtttgccc caactgcaat ggaggattta tccaagaact tgatgatatg 120 gtgcctggaa atccatttga tttctttggt ctggatcatg atgaagatcg cgatcatggt 180 ctaggagcat tctctgcttt tatgcgacaa cgtttagccg aaagaaatga tatgagggga 240 agatcagagt cactttttga gcgtagcccg gggtttggtc ctctattaat atttggtggt 300 caaataccgc tgagaaacag caggttagaa gctctcttca atggggctcc tggcattggt 360 attacacgag gcgatagtgg cgattacttc ataggccctg gattggagga gctattcgaa 420 cagctttctg caaatggtca tcgcggccct ccaccagcat ctagatcatc aatcgatgca 480 atgccaacag ttaagatcac gcaacgacat cttcgctcag attcacattg tccagtttgt 540 aaagaaaaat ttgaactggg gtccgaagca aggcagatgc cgtgtaatca catgtaccac 600 tcagattgta tcattccatg gctggtccag cacaactctt gccccgtctg ccgccaggaa 660 ctgccaccac agggaatagg aggcgaaggt ggaggcgggg gtgggggaca tagcaccgat 720 ggtcaaaacc gaagcaacag ctacaacaac aacaacagca atggctcccg ggtcaatcct 780 ggtagacgca atccattctc ttatctgtgg ccatttcgat catctagttc tagctccaac 840 catggcggag cagggagcag tgaaccgacg aaccaccaga tggggtattc gggatatcga 900 tacactaatt caccatga 918 <210> 2 <211> 305 <212> PRT <213> Amino acie Sequence for LsRZF1 <400> 2 Met Ser Ala Gly Arg Asn Thr His Trp Cys His Arg Cys Arg Arg Ser 1 5 10 15 Val Arg Leu Arg Gly Arg Asp Ala Val Cys Pro Asn Cys Asn Gly Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Glu Leu Asp Asp Met Val Pro Gly Asn Pro Phe Asp Phe 35 40 45 Phe Gly Leu Asp His Asp Glu Asp Arg Asp His Gly Leu Gly Ala Phe 50 55 60 Ser Ala Phe Met Arg Gln Arg Leu Ala Glu Arg Asn Asp Met Arg Gly 65 70 75 80 Arg Ser Glu Ser Leu Phe Glu Arg Ser Pro Gly Phe Gly Pro Leu Leu 85 90 95 Ile Phe Gly Gly Gln Ile Pro Leu Arg Asn Ser Arg Leu Glu Ala Leu 100 105 110 Phe Asn Gly Ala Pro Gly Ile Gly Ile Thr Arg Gly Asp Ser Gly Asp 115 120 125 Tyr Phe Ile Gly Pro Gly Leu Glu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Ser Ala 130 135 140 Asn Gly His Arg Gly Pro Pro Pro Ala Ser Arg Ser Ser Ile Asp Ala 145 150 155 160 Met Pro Thr Val Lys Ile Thr Gln Arg His Leu Arg Ser Asp Ser His 165 170 175 Cys Pro Val Cys Lys Glu Lys Phe Glu Leu Gly Ser Glu Ala Arg Gln 180 185 190 Met Pro Cys Asn His Met Tyr His Ser Asp Cys Ile Ile Pro Trp Leu 195 200 205 Val Gln His Asn Ser Cys Pro Val Cys Arg Gln Glu Leu Pro Pro Gln 210 215 220 Gly Ile Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly His Ser Thr Asp 225 230 235 240 Gly Gln Asn Arg Ser Asn Ser Tyr Asn Asn Asn Asn Ser Asn Gly Ser 245 250 255 Arg Val Asn Pro Gly Arg Arg Asn Pro Phe Ser Tyr Leu Trp Pro Phe 260 265 270 Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn His Gly Gly Ala Gly Ser Ser Glu 275 280 285 Pro Thr Asn His Gln Met Gly Tyr Ser Gly Tyr Arg Tyr Thr Asn Ser 290 295 300 Pro 305 <210> 3 <211> 918 <212> DNA <213> Antisense Nucleotide Sequence for LsRZF1 <400> 3 tcatggtgaa ttagtgtatc gatatcccga ataccccatc tggtggttcg tcggttcact 60 gctccctgct ccgccatggt tggagctaga actagatgat cgaaatggcc acagataaga 120 gaatggattg cgtctaccag gattgacccg ggagccattg ctgttgttgt tgttgtagct 180 gttgcttcgg ttttgaccat cggtgctatg tcccccaccc ccgcctccac cttcgcctcc 240 tattccctgt ggtggcagtt cctggcggca gacggggcaa gagttgtgct ggaccagcca 300 tggaatgata caatctgagt ggtacatgtg attacacggc atctgccttg cttcggaccc 360 cagttcaaat ttttctttac aaactggaca atgtgaatct gagcgaagat gtcgttgcgt 420 gatcttaact gttggcattg catcgattga tgatctagat gctggtggag ggccgcgatg 480 accatttgca gaaagctgtt cgaatagctc ctccaatcca gggcctatga agtaatcgcc 540 actatcgcct cgtgtaatac caatgccagg agccccattg aagagagctt ctaacctgct 600 gtttctcagc ggtatttgac caccaaatat taatagagga ccaaaccccg ggctacgctc 660 aaaaagtgac tctgatcttc ccctcatatc atttctttcg gctaaacgtt gtcgcataaa 720 agcagagaat gctcctagac catgatcgcg atcttcatca tgatccagac caaagaaatc 780 aaatggattt ccaggcacca tatcatcaag ttcttggata aatcctccat tgcagttggg 840 gcaaactgca tctctaccac gaagacgtac cgaccttctg catctatgac accaatgggt 900 gttccgacca gctgacat 918

Claims (8)

1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 LsRZF1 단백질의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 건조 스트레스 내성 형질전환 식물체.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 LsRZF1 단백질은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme) 또는 PNA(peptide nucleic acids)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 식물체는 수박 대목용 공대수박(Citrullus lanatus cv. gongdae)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
   
7. 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법:
   (a) 제 1 항의 벡터로 아그로박테리움(Agcrobacterium)을 형질전환시키는 단계;
   (b) 상기 아그로박테리움을 목적하는 식물의 세포 또는 조직과 공동 배양(co-cultivation)하여 상기 세포 또는 식물조직을 형질전환 시키는 단계; 및
   (c) 상기 형질전환된 세포 또는 식물조직으로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 식물은 수박 대목용 공대수박(Citrullus lanatus cv. gongdae)인 것을 특징으로 하는 방법.

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