WO2014172826A1 - 一种小盐芥液泡膜焦磷酸酶vp1及其编码基因与应用 - Google Patents

一种小盐芥液泡膜焦磷酸酶vp1及其编码基因与应用 Download PDF

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WO2014172826A1
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seq
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expression vector
plants
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何云蔚
王建胜
梁远金
陈淼
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创世纪转基因技术有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a tonoplast pyrophosphatase and a gene encoding the same, and particularly to a tonoplast pyrophosphatase VP1 derived from small salt mustard And its coding gene, and its use in the cultivation of transgenic plants with improved salt tolerance.
  • Salt stress is one of the most important abiotic stress hazards in agricultural production in the world. Salted soil is usually dominated by sodium salt, calcium salt or magnesium salt, and is a major factor affecting plant growth and causing food and economic crop yield reduction. The world's saline-alkali soil covers an area of about 400 million hectares, accounting for one-third of the irrigated farmland.
  • Saline-alkali land is widely distributed in China, and the existing saline-alkali land area is about 0.4 billion hectares. With the increase of population in China and the reduction of cultivated land, the development and utilization of saline-alkali resources has extremely important practical significance.
  • the selection of plant resistance to salt and alkali, drought-tolerant ability and plant species or strains suitable for growth on saline-alkali land with high economic and ecological value is an economical and effective measure to utilize saline-alkali land. For most crops, most plants are poorly tolerant to saline and alkali, and can only grow on soil with a sodium chloride content of 0.3% or less. Excess Na + in the soil will be normal to the plant. Growth metabolism produces toxic effects. Therefore, how to increase crop yield in a salted environment has become a very important issue in agricultural production worldwide.
  • the salt tolerance of plants is a very complex quantitative trait, and its salt tolerance mechanism involves various levels from plants to organs, tissues, physiology and biochemistry to molecules.
  • scientists from various countries have also done a lot of work for this purpose, and have made a lot of new progress, especially in the use of the higher model plant Arabidopsis to study the salt-tolerant molecular mechanism of plants, making breakthroughs in research in this field ( Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 2011.
  • Higher plant cells can have multiple ways to sense changes in the physical and chemical parameters in the external environment, thereby transforming extracellular signals into intracellular signals, and finally transmitting stress signals to the nucleus through a series of signal transductions, activating transcription factors, and activating transcription.
  • the factor acts on the functional gene and initiates the expression of the stress response gene to increase the tolerance of the plant.
  • the present inventors cloned a tonoplast pyrophosphatase (designated herein as VP1) encoding a small salt mustard using SSH (suppression subtractive hybridization) and RACE (rapid amplification of cDNA ends), and determined Its DNA sequence. Moreover, it was found that the transgenic plants can significantly improve the salt tolerance of the transgenic plants after they are introduced into the plants by transgenic technology, and these traits can be stably inherited.
  • SSH suppression subtractive hybridization
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • the first aspect of the present invention provides a gene encoding a tonoplast pyrophosphatase VP1 of small salt mustard (herein named ThVP1) having the sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a second aspect of the present invention provides a recombinant expression vector comprising the gene of the first aspect of the present invention, which is obtained by inserting the gene into an expression vector, preferably, the expression vector is PCAMBIA2300; And the nucleotide sequence of the gene is operably linked to the expression control sequence of the recombinant expression vector; preferably, the recombinant expression vector is the 35S-ThVP1-2300 vector shown in Figure 2.
  • a third aspect of the invention provides a recombinant cell comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention; preferably, the recombinant cell is a recombinant Agrobacterium cell.
  • a fourth aspect of the invention provides a method for improving salt tolerance of a plant, comprising: introducing the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention into a plant or plant tissue and expressing the gene
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a fifth aspect of the present invention provides a method for producing a transgenic plant, comprising: cultivating a plant or plant tissue comprising the gene of the first aspect of the invention or the recombinant expression vector of the second aspect of the invention under conditions effective to produce a plant;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a sixth aspect of the present invention provides the gene according to the first aspect of the present invention, the recombinant expression vector of the second aspect of the present invention or the recombinant cell of the third aspect of the present invention for improving salt tolerance of a plant and for use in plant breeding Use;
  • the plant is Arabidopsis thaliana.
  • a seventh aspect of the invention provides a protein encoded by the gene of the first aspect of the invention, the amino acid sequence of which is set forth in SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 shows the construction of the plant expression vector (35S-ThVPl-2300) of the 73 ⁇ 4 P gene (Fig. la-lb).
  • Figure 2 is a plasmid map of the plant expression vector C35S-ThVPl-2300) of the 73 ⁇ 4 P gene.
  • Figure 3 is a cultured test plant Arabidopsis thaliana.
  • Figure 4 is a salt tolerance test result of T1 generation plants of ThVP1 transgenic Arabidopsis thaliana, Tlb7 exhibits significant salt tolerance, and the results of TlblO, Tlbl 5 are similar thereto, and are not shown here.
  • Figure 5 shows the results of molecular level detection of the transcription level of TWP1 gene in 1 ⁇ generation transgenic tobacco plants and non-transgenic control plants by reverse transcription 1 ⁇ 1.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000)
  • 1-4 is a salt-tolerant control Arabidopsis plant
  • 13 is a plasmid PCR positive control (35S-ThVPl-2300 plasmid)
  • 5-12 is a salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis thaliana Plant.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The following examples are provided to facilitate a better understanding of the present invention by those skilled in the art. The examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.
  • Small salt mustard (TheUungieUa halophila, purchased from the Yanlan Plant Breeding Center of Ulan Buh and Desert Green Botanical Garden, Bayannao, Inner Mongolia, China) Seeded onto sterilized vermiculite, at 22 ° C, photoperiod 12 hours light / 12 hours dark (Light intensity 3000-4000 Lx) culture, 1/2MS medium per week (containing 9.39 mM KN0 3 , 0.625 mM KH 2 P0 4 , 10.3 mM NH4NO3 , 0.75 mM MgS0 4 , 1.5 mM CaCl 2 , 50 ⁇ KI, 100 ⁇ H 3 B0 3 , 100 ⁇ MnS0 4 , 30 ⁇ ZnS0 4 , 1 ⁇ Na 2 Mo0 4 , 0.1 ⁇ CoCl 2 , 100 ⁇ Na 2 EDTA, 100 ⁇ FeS0 4 ) once. It was used for experiments when the seedlings reached a diameter of 5-6 cm.
  • the test plants were divided into 2 groups, 4 pots per group and 3 plants per pot.
  • the first group was the control group, which was normally watered with 1/2MS;
  • the second group was the salt treatment group, which was irrigated with 1/2MS solution containing 300 mM NaCl, and the two groups of plants were exposed to light at 12 °C for 12 hours/12 hours.
  • the cells were cultured for 10 days in the dark (light intensity 3000-4000 Lx), and then the two groups of plants were washed in time (the roots were washed with steamed water), rapidly frozen with liquid nitrogen, and stored in a -70 °C refrigerator.
  • the absorbance of total RNA at 260 nm and 280 nm, OD 26 was determined using a HITACHI UV spectrophotometer U-2001. /OD 28 .
  • the ratio of 1.8-2.0 indicates that the total RNA purity is high.
  • the integrity of total RNA is detected by 1.0% agarose gel electrophoresis.
  • the brightness of the 28S band is about twice that of the 18S band, indicating that the RNA integrity is good.
  • the products of the two first forward subtractive hybridizations were mixed, and a second forward subtractive hybridization was performed with the newly denatured Driver cDNA, and the differentially expressed genes were amplified by two inhibitory PCR amplifications (PCR). Before, the second forward subtraction hybridization product was end-filled).
  • the second inhibitory PCR amplification product of the second forward subtractive hybridization cDNA fragment (purified using QIAquick PCR Purification Kit, purchased from Qiagen) according to the instructions of the pGEM-T Easy kit (purchased from Promega)
  • the specific steps are as follows: The following components are sequentially added to a 200 ⁇ PCR tube: The second inhibitory PCR product of the purified forward subtractive hybridization cDNA fragment 3 ⁇ 1 , 2 ⁇ ⁇ 4 ligase buffer Liquid 5 ⁇ 1, pGEM-T Easy vector 1 ⁇ 1, ⁇ 4 DNA ligase 1 ⁇ 1, and ligated overnight at 4 °C. Then 10 ⁇ of the ligation reaction product was added to 100 ⁇ of competent E.
  • coli JM109 (purchased from TAKARA), ice bath for 30 min, heat shock at 42 ° C for 60 seconds, ice bath for 2 min, and 250 ⁇ L LB liquid medium. (containing 1% tryptone (purchased from OXOID), 0.5% yeast extract (Yeast Extract, purchased from OXOID) and 1% NaCl (purchased from Sinopharm)) and placed in a 37 ° C shaker at 225 rpm Incubate for 30 min, then inoculate 200 ⁇ M from the inoculum containing 50 g/ml ampicillin, 40 g/mL X-gaK 24 g/mL IPTG (X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indole) - 3 -0-galactoside) and IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) were purchased from LB solid plates on TAKARA) and incubated at 37 ° C for 18 hours.
  • tryptone purchased from O
  • ThVPl GSP1 SEQ ID NO: 4:
  • ThVPl GSP2 SEQ ID NO: 5:
  • the experimental procedure was performed according to the kit instructions (3 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends kit purchased from Invitrogen).
  • the first round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 4 and the universal primer AUAP (provided with the kit), and the cDNA reverse-transcribed from the salt-treated group of the salt-treated mustard as a template. Specific steps are as follows: 50 ⁇ PCR reaction system: 5 ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 ⁇ Ex Taq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 4 and AUAP each 2.0 ⁇ 1 , and 35 ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 58 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min), extension at 72 °C for 10 min.
  • the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water and 2.0 ⁇ L was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 5 and the universal primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 58 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min), extension at 72 °C for 10 min.
  • a fragment of about 1100 bp in the second PCR product (Gel Extraction Kit from OMEGA) was recovered and ligated into the pGEM-T Easy vector, and then transformed into E. coli JM109 (specific method as above).
  • Ten white colonies were randomly picked and inoculated into LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C, glycerol was added to a final concentration of glycerol of 20% by volume, and stored at -80 ° C until use.
  • the following three specific primers were designed as the 3'-end specific primer of 5' RACE.
  • ThVPl GSP3 SEQ ID NO: 6:
  • ThVPl GSP4 SEQ ID NO: 7:
  • ThVPl GSP5 SEQ ID NO: 8:
  • the Ends kit was purchased from Invitrogen).
  • the first round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 7 and the universal primer AAP (provided with the kit), and the mRNA reverse transcription cDNA (reverse transcription primer SEQ ID NO: 6) extracted from the salt-treated group of small salt mustard was used as a template.
  • SEQ ID NO: 7 and the universal primer AAP (provided with the kit)
  • mRNA reverse transcription cDNA reverse transcription primer SEQ ID NO: 6
  • PCR reaction system 5 ⁇ ⁇ Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ mRNA reverse transcribed cDNA, 1.0 lExTaq (purchased from TAKARA), 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 7 and P AAP 2.0 ⁇ l each And 35 ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 min, 33 cycles (94 ° C Denaturation for 30 s, annealing at 55 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min), extension at 72 °C for 10 min.
  • the obtained PCR product was diluted 50-fold with double distilled water and 2.0 ⁇ L was used as a template, and the second round of PCR amplification was carried out using SEQ ID NO: 8 and primer AUAP.
  • the specific steps are as follows:
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 58 °C for 30 s, extension at 72 °C for 1 min), extension at 72 °C for 10 min.
  • a fragment of about 1 l OObp in the second PCR product (Golecular Extraction from OMEGA) was recovered and ligated into the pGEM-T Easy vector, which was then transformed into JM109 (see the same method as above).
  • Ten white colonies were randomly picked and inoculated into LB liquid medium containing 50 g/ml ampicillin. After incubation at 37 ° C overnight, glycerol was added to a final concentration of 20% glycerol (volume ratio), and stored at -80 ° C until use.
  • a pair of primers were designed according to the sequence of SEQ ID NO: 9 as follows:
  • the 73 ⁇ 4 P full-length coding gene was cloned by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • PCR was performed using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase and cDNA from the reverse-transcribed mRNA extracted from the salt-treated group.
  • 50 ⁇ PCR reaction system 10 ⁇ 5 X PS Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ cDNA, 1.0 ⁇ PrimeSTAR, 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 each 2.0 ⁇ 1, and 30 ⁇ Double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 58 °C for 30 s, extension at 72 °C for 2 min), extension at 72 °C for 10 min.
  • PCR amplification product plus A tail Add 2.5 volumes of absolute ethanol to the PCR product, place at -20 ° C for 10 minutes, centrifuge, remove the supernatant, dry, then dissolve with 21 ⁇ l of double distilled water, then add to it. 2.5 ⁇ ⁇
  • amino acid sequence of the encoded protein is SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence of VP1 protein SEQ ID NO: 1
  • the plant binary expression vector pCAMBIA2300 (purchased from Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.) was selected as a plant expression vector, and the 35S promoter containing the double enhancer of the ⁇ gene was replaced with the Pnos promoter to reduce the expression of prion protein in plants. .
  • the 35S promoter and the Tnos terminator were selected as promoters and terminators of the ThVP1 gene, respectively.
  • the specific construction route is shown in Figure 1.
  • Pnos was amplified using the plant expression vector pBI121 (purchased from Beijing Huaxia Ocean Technology Co., Ltd.) using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase. 50 ⁇ PCR reaction system: 10 ⁇ 5 xPS Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ ⁇ 121, 1.0 ⁇ PrimeSTAR 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 each 2.0 ⁇ 1, and 31 ⁇ double Steamed water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 56 °C for 30 s, extension at 72 °C for 30 s), extension at 72 °C for 10 min.
  • the resulting PCR product was digested with EcoRI, Bglll, and ligated into pCAMBIA2300 according to the kit instructions (Promega, T4 ligase kit) to obtain pCAMBIA2300-1.
  • Tnos was amplified using primers SEQ ID NO: 14 and P SEQ ID NO: 15 with pBI121 as a template, using PrimeSTAR HS DNA polymerase of TaKaRa. 50 ⁇ 1 ⁇ Reaction system: 10 ⁇ 5 > ⁇ PS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ pBI121 1.0 ⁇ Prime STAR, 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 each 2.0 ⁇ l, and 31 ⁇ of double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 ° C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 ° C for 30 s, annealing at 58 ° C for 30 s, extension at 72 ° C for 30 s), extension at 72 ° C for 10 min.
  • the resulting PCR product was ligated by Kpnl, EcoRI digestion (Promega T4 ligase kit) to pCAMBIA2300-1 to obtain pCAMBIA2300-2.
  • the 35S promoter was amplified using primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 with pCAMBIA2300 as a template.
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase from TaKaRa was used. 50 ⁇ PCR reaction system: 10 ⁇ 5 > ⁇ PS Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ pCAMBIA2300 1.0 ⁇ PrimeSTAR, 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 each 2.0 ⁇ 1, and 31 ⁇ double Steamed water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (denaturation at 94 °C for 30 s, annealing at 58 °C for 30 s, extension at 72 °C for 30 s), extension at 72 °C for 10 min.
  • the resulting PCR product was ligated by HindIII and Sail (connection method as above) to pCAMBIA2300-2 to obtain pCAMBIA2300-3.
  • ThVPI-encoding gene was amplified using primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 (the template was the positive ThVP1-pGEM plasmid obtained in Example 2), using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase. 50 ⁇ PCR reaction system: 10 ⁇ 5 xPS Buffer 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 1.0 ⁇ ThVPl-pGEM 1.0 ⁇ Prime STAR, 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 2.0 ⁇ 1, and 31 ⁇ ⁇ double distilled water.
  • PCR reaction conditions pre-denaturation at 94 °C for 5 min, 33 cycles (94 °C for 30 s, 58 °C for 30 s, 72 °C for 2 min) and 72 °C for 10 min.
  • the obtained PCR product was ligated by Sall and Kpnl (connection method as above) to pCAMBIA2300-3 to obtain a plant expression vector 35S-ThVPl-2300 (Fig. 2).
  • Agrobacterium LBA4404 was drawn on LB solid medium containing 50 g/ml rifampicin and 50 g/ml streptomycin 1-2 days in advance Single spot inoculation, culture at 28 °C for 1 to 2 days. Pick a single colony and inoculate 5 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 rifampicin and 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 streptomycin, and incubate overnight (about 12-16 hours) to OD 6QQ at 28 °C. At 0.4, a seed bacterial liquid was formed.
  • Transformation of Agrobacterium The competent cells were thawed on ice, and 1 ⁇ M of the plasmid of 35S-ThVP1-2300 obtained in Example 3 was added to 40 ⁇ of competent cells, and the mixture was mixed and ice-cooled for about 10 minutes. A mixture of competent cells and 35S-ThVP1-2300 plasmid DNA was transferred to an ice-cold electric shock cup (purchased from bio-rad) using a pipette, and tapped to bring the suspension to the bottom of the electric shock cup, taking care not to have air bubbles. Place the electric shock cup on the slide of the electric shock chamber, and push the slide to place the electric shock cup to the base electrode of the electric shock chamber.
  • an ice-cold electric shock cup purchased from bio-rad
  • the MicroPulser purchased from bio-rad
  • the MicroPulser is set to "Agr” and the electric shock is applied once.
  • the suspension was transferred to a 1.5 ml centrifuge tube and incubated at 28 ° C for 1 hour at 225 rpm.
  • 100-200 ⁇ L of bacterial solution was applied to the corresponding resistant selection medium plate (LB solid medium containing 50 g/ml rifampicin, 50 g/ml streptomycin, 50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 Kana) Phytomycin), cultured at 28 °C.
  • Positive transformed clones were screened and their bacterial stocks were stored at -70 °C until use.
  • the Agrobacterium liquid of the transformed expression vector obtained in Example 4 was inoculated to an LB medium containing 10-50 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 kanamycin (kan), and incubated overnight at 1:50 in the morning.
  • kan ⁇ ⁇ / ⁇ 1 kanamycin
  • the Agrobacterium liquid OD600 should be between 1.0 and 1.2. Centrifuge at 5000 rpm for 5 minutes at room temperature, discard the supernatant, and suspend the Agrobacterium pellet in a volume of osmotic medium (1/2MS, 5% sucrose; adjust to pH 5.7 with KOH; 0.02% Silwet L-77), make OD600 At around 0.8.
  • Example 7 Screening of Arabidopsis Positive Transformants:
  • Seed disinfection first soak for 10 minutes with 70% ethanol, and suspend the seeds from time to time during the above treatment; then wash with sterile water four times, and it is best to suspend the seeds from time to time.
  • the treated seeds were uniformly coated on the surface of 1/2MS solid screening medium containing 50 ⁇ g/ml kanamycin for 2 days (up to 1500 plants in a 150 mm diameter plate), constant temperature 22 ° C, illumination The intensity is 3500-4000k, the photoperiod is 12 hours dark, 12 hours light culture, and cultured for 7-10 days. Whether it is a transgenic seed is judged according to the growth condition. Seeds successfully transferred to the recombinant plasmid were able to grow normally more than 4 true leaves on the resistant medium.
  • Non-transgenic seeds can not grow normally, only two cotyledons can grow, and the growth of the roots is also severely inhibited. It usually dies 10 days later. After 2 weeks of germination of the transgenic seeds on the MS+kan plate, the positive plants were transferred to the soil for further cultivation, and the transgenic Arabidopsis was subjected to PCR detection with SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 to remove the negative plants and collect the positive plant seeds. , label:
  • T0bl-T0b20 was seeded with 2 pots per transformant, 2 pots were seeded against Arabidopsis thaliana, and 20-30 seeds were seeded per pot. After sowing, the film is covered with a film to provide a moist environment for plant growth. Constant temperature 22 ° C, light intensity 3500-40001x, photoperiod is 12 hours dark, 12 hours light culture, 1/2MS is watered every 7 days, after 25 days of culture, transgenic Arabidopsis is detected by PCR with SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 Negative plants, 12-14 positive seedlings were retained.
  • transgenic Arabidopsis thaliana and control Arabidopsis thaliana were selected for salt tolerance experiments, and 7-9 seedlings of uniform size were retained in each pot.
  • Example 9 Salt tolerance test of transgenic Arabidopsis thaliana T1 plants overexpressing ThVP1
  • Transgenic Arabidopsis thaliana and control Arabidopsis thaliana were treated without treatment, normal watering 1/2MS, transgenic Arabidopsis thaliana, control Arabidopsis thaliana each potted with 1/2MS containing 150Mm NaCl, constant temperature 22 V, light intensity
  • Example 9 T1 transgenic plants with good salt tolerance in Example 9, 8 were randomly selected (respectively belong to the above three salt-tolerant strains), and the control plants in Example 9 were randomly selected from 4 plants, and the leaves were treated with salt for 14 days.
  • Total RNA was extracted using a plant RNA extraction kit (Invitrogen). The absorbance values of total RNA at 260 nm and 280 nm were determined by ultraviolet spectrophotometry to calculate individual RNA concentrations. Reverse transcription was carried out according to the method shown by Invitrogen Reverse Transcription Kit Superscript III Reverse Transcriptase (1 ⁇ g of total RNA as a template, reverse transcription primer SEQ ID NO: 11).
  • ThVP1 was amplified by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 20 (SEQ ID NO: 20: AGCACCAAGA GACCGTTTGC TG), and its transcription was examined. PCR reaction was carried out using TaKaRa's PrimeSTAR HS DNA polymerase using the above reverse transcribed cDNA as a template. 50 ⁇ l ⁇ Reaction system: 10 ⁇ 5 xPS Buffer, 3 ⁇ 2.5 mM dNTP, 2.0 ⁇ cDNA 1.0 ⁇ PrimeSTAR 10 ⁇ primers SEQ ID NO: 10 and P SEQ ID NO: 20 each 2.0 ⁇ and 30 ⁇ double steamed water.
  • M is DNA Ladder Marker (DL2000, purchased from Shenzhen Ruizhen Biotechnology Co., Ltd.), 1-4 is a salt-tolerant control Arabidopsis plant, and 13 is a plasmid PCR positive control (35S). -ThVPl-2300 plasmid), 5-12 is a salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plant.
  • the size of the band shown is the same as the size of the positive control (approximately 600 bp).
  • the results showed that the salt-tolerant T1 transgenic Arabidopsis plants had stronger transcription in 73 ⁇ 4 ⁇ , and the salt-tolerant control Arabidopsis plants did not have the transcription of ThVP1.

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Abstract

本发明公开了一种植物蛋白及其编码基因和应用，尤其公开了来源于小盐芥的液泡膜焦磷酸酶及其编码基因，以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。

Description

一种小盐芥液泡膜焦磷酸酶 VP1及其编码基因与应用 技术领域 本发明涉及液泡膜焦磷酸酶及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于小盐芥的 液泡膜焦磷酸酶 VP1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应用。 背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、 钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0.4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重要 的现实意义。 而植物抗盐碱、 耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具有较高经 济和生态价值的植物种或品系的选育， 则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大多 数农作物来说， 大多数植物对盐碱、 干旱的耐受性差， 只能生长在氯化钠含量为 0.3% 以下的土壤上， 土壤中过量的 Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。 因此 如何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农业生产中十分重要的问题。
植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。 各国的科学家也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展， 特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的耐盐分子机理方面， 使该领域 的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247-1273; Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-411 ) 。 高等植物细胞可有多种途径感受外界环境中物化参数的变 化， 从而将胞外的信号变为胞内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递至细 胞核内， 激活转录因子， 而激活转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答基因的表 达从而提高植物的耐逆性。 尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究， 但由于其机制 十分复杂， 植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。 例如， 植物抗盐的关键因子仍未 找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清楚。 虽然许多研究机构通过现代生物技术， 获 得了各类具有一定耐盐、 抗旱等抗逆能力的转基因植物， 但还未达到产业化的标准。 因此在提高植物抗逆性方面， 还有许多工作需要做。 发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆了小盐芥的一个液泡膜焦磷酸酶（本文命名为 VP1 ) 的编码基因， 并测定了 其 DNA序列。 并且发现通过转基因技术将其导入植株后， 可明显改善转基因植株的 耐盐性， 而且这些性状可稳定遗传。
本发明第一方面提供小盐芥的一个液泡膜焦磷酸酶 VP1的编码基因（本文命名为 ThVPl ) ， 其序列为 SEQ ID NO: 2。
本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其 是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的， 优选地， 所述表达载体是 PCAMBIA2300 ; 并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可 操作地连接； 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35S-ThVPl-2300载体。
本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将本发明第一方面所 述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条 件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述重组表达载体的植 物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、 本发明第二方面所述的重组 表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育 种的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。
本发明第七方面提供由本发明第一方面所述基因编码的蛋白质， 其氨基酸序列 如 SEQ ID NO: 1所示。 附图说明
图 1是 7¾ P 基因的植物表达载体 （35S-ThVPl-2300 ) 构建流程 （图 la-lb) 。 图 2是 7¾ P 基因的植物表达载体 C35S-ThVPl-2300)的质粒图。
图 3是培养的供试植物拟南芥。 图 4是 ThVPl转基因拟南芥的 T1代植株的耐盐实验结果， Tlb7表现出明显的耐 盐性， TlblO、 Tlbl 5的结果与其类似， 在此未示出。
图 5为利用反转录 1^1 对1\代转基因烟草植株和非转基因对照植株中 TWP1基因 的转录水平进行分子水平检测的结果。 M为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-4为不 耐盐的对照拟南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照（35S-ThVPl-2300质粒） ， 5-12为 耐盐 T1代转基因拟南芥植株。 具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出 于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。
下面实施例中提到的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司 实施例 1. 盐胁迫下小盐芥 SSH文库构建：
具体方法为：
按照 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit 试剂盒说明书所示的方 法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。 实验中以生长过程中盐处理的小盐芥组织 中提取的 mRNA作为样本 （tester) ， 以未处理的小盐芥组织中提取的 mRNA作为对 照 （driver) 。 具体步骤如下：
( 1 ) 供试材料：
小盐芥 （ TheUungieUa halophila, 购自中国内蒙古巴彦淖尔市乌兰布和沙漠绿色 植物园盐生植物繁育中心） 播种到灭菌的蛭石上， 在 22°C、 光周期 12 小时光照 /12 小时黑暗 （光强 3000— 4000 Lx) 条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 （含有 9.39 mM KN03 , 0.625 mM KH2P04， 10.3 mM NH4NO3 , 0.75 mM MgS04， 1.5 mM CaCl2， 50 μΜ KI， 100 μΜ H3B03， 100 μΜ MnS04， 30 μΜ ZnS04， 1 μΜ Na2Mo04， 0.1 μΜ CoCl2， 100 μΜ Na2EDTA, 100 μΜ FeS04) 一次。 当苗株直径达到 5-6cm时用于实 验。
( 2 ) 材料处理：
将供试植株分为 2组， 每组 4盆， 每盆 3株。 第一组为对照组， 正常地用 1/2MS 浇灌； 第二组为盐处理组， 浇灌含有 300mM NaCl 的 1/2MS 溶液， 将两组植物在 22°C、 光周期 12小时光照 /12小时黑暗（光强 3000— 4000 Lx)条件下培养 10天， 然 后及时收集两组植株 （用蒸熘水洗净根部） ， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保 存。 ( 3 ) 总 RNA提取：
分别取对照组和盐处理组的小盐芥 3.0 g， 用植物 RNA 提取试剂盒 （购自 Invitrogen)提取总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD26。/OD28。比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较高， 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2 倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。
( 4 ) 抑制差减杂交：
按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进 行抑制差减杂交。 先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再以 2 Tester cDNA和 2 g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水浴 下分别将 Tester cDNA禾 P Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5 h， 然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同 接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将 两种第一次正向差减杂交的产物混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向差 减杂交， 通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段 （PCR进行前， 第二次 正向差减杂交产物进行末端补平） 。
( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定
依照 pGEM-T Easy 试剂盒 (购自 Promega)的说明， 将所述第二次正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物（使用 QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 在 200 μΐ PCR管中依次 加入下列成分： 纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR产物 3 μ1、 2 Χ Τ4连接酶缓冲液 5 μ1、 pGEM-T Easy载体 1 μ1、 Τ4 DNA连接酶 1 μ1、 于 4°C连接过 夜。 然后取 10 μΐ连接反应产物， 加入到 100 μΐ感受态大肠杆菌 JM109(购自 TAKARA) 中， 冰浴 30 min， 42°C热休克 60秒， 冰浴 2 min， 另加 250 μΐ LB液体培养基 （含有 1%胰蛋白胨 （Tryptone , 购自 OXOID ) 、 0.5% 酵母提取物 （Yeast Extract , 购自 OXOID )和 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C摇床中， 以 225 rpm振荡培养 30 min， 然后从中取 200 μΐ菌液接种于含 50 g/ml氨苄青霉素、 40 g/mL X-gaK 24 g/mL IPTG (X-gal ( 5-溴-4氯-3-吲哚- 3 -0-半乳糖苷）和 IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖 苷)购自 TAKARA)的 LB固体培养板上， 37°C培育 18小时。 计数培养板中直径 > 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落， 随机挑取 450个白色菌落 (编号： Th-S001至 Th-S450)。 将所 挑取的白色菌落接种于 96孔细胞培养板 (CORNING)中的含 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， 于 - 80°C保存 备用。 对所培养的菌落克隆以巢式 PCR 引物 Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech公 司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒） 进行菌液 PCR 扩增验证， 得到 342 个阳性克隆， 然后将所有阳性克隆送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。
( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：
将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 301个有效 表达序列标签 ( Expressed sequence tag, EST ) (unigene) 实施例 2小盐芥液泡膜焦磷酸酶基因 ThVPl的克隆
将实施例 1获得的有效克隆子之一 Th-S351的测序结果去掉冗余 DNA后， 序列 为 SEQ ID NO : 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白属于液泡膜焦磷酸酶。 本文将 SEQ ID NO: 3序列对应的全长编码基因命名为 7¾ i¾， 其对应的蛋白命名为 VP1。
SEQ ID NO: 3：
1 ACGCTGAATC ATCTTGTGCT GCACTCGTTG TTGCTTCTAT CTCGTCTTTT GGAATCAACC
61 ATGATTTCAC AGGCATGTTG TTCCCGTTGC TCATCAGTTC AATGGGGATC TTGGTTTGTT
121 TGATCACCAC TCTCTTTGCC ACCGACATCT CTGAGATCAA GGCAGTGAAA GAGATCGAGC
181 CGGCCCTCAA AAACCAGCTT ATTATCTCGA CGGTTATCAT GACTGTTGGA ATCGCTTTAG
241 TGTCGTGGAC TGGGTTGCCA TCTTCCTTCA CAATCTACAA CTTCGGGACA CAGAAAGTTG
301 TGAAAAGCTG GGAGCTATTC CTCTGTGTTG CTGTTGGTCT CTGGGCTGGA CTCAGCATCG
361 GCTTTGTTAC TGAATACTAT ACCAGCAATG CATACAGCCC TGTGCAAGAC GTGGCGGATT
421 CATGCAGAAC AGGAGCAGCA ACCAACGTAA TATTCGGACT TGCTCTTGGT TACAAATCCG
481 TGATAATTCC AATATTTGCG ATTGGTGTCA GTATATTTGT TAGCTTCAGC TTTGCTGCCA
541 TGT 7¾ i¾全长编码基因的克隆
根据已经获得的 SEQ ID NO: 3序列， 设计如下两条特异性引物， 作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。
ThVPl GSP1 : SEQ ID NO: 4：
CATGCAGAAC AGGAGCAGCA AC
ThVPl GSP2: SEQ ID NO: 5：
AATATTTGCG ATTGGTGTCA GTA
实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 4与通用引物 AUAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA反转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下： 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟΧΕχ Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反 转录的 cDNA、 1.0 μΐ Ex Taq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP 各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ 双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环 （94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin) ， 72 °C 延伸 10 min。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 μ1ΡΟ 反应体系： 5 μΐ 10XExBuffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第 一轮 PCR产物、 1.0 ^Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ1、 以 及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin) ， 72 °C 延伸 10 min。 回收第二次 PCR产物中片段 约为 1100 bp的条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA)， 并将其连接于 pGEM-T Easy 载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109(具体方法同上)。 随机挑取 10 个白色菌落接种于 含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓 度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行菌 液 PCR 扩增， 得到 6个阳性克隆， 将 4个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易有限 公司测序， 获得该基因的 cDNA的 3' 端。
根据已经获得的 ThVPl基因的部分片段 （SEQIDNO: 3) ， 设计如下三条特异 性引物， 作为 5' RACE的 3' 端特异性引物。
ThVPl GSP3: SEQ ID NO: 6:
GATGGCAACC CAGTCCACGA CA
ThVPl GSP4: SEQ ID NO: 7:
ATAAGCTGGT TTTTGAGGGC CG
ThVPl GSP5: SEQ ID NO: 8:
GTGGCAAAGA GAGTGGTGAT CA 实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。
用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA反转录的 cDNA (反转录引物 SEQIDNO: 6) 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟΧΕχ Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ mRNA反 转录的 cDNA、 1.0 lExTaq (购自 TAKARA)、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7禾 P AAP 各 2.0 μ1、 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变性 30 s， 55 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin) ， 72 °C 延伸 10 min。
所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8与 引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：
50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ 10 X Ex Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ稀释的第 一轮 PCR产物、 1.0 ^ Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ1、 以 及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 1 min)， 72 °C 延伸 10 min。 回收第二次 PCR产物中片段 约为 l lOObp的条带 （ Gel Extraction Kit购自 OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy 载体， 然后转化到 JM109(具体方法同上）。 随机挑取 10 个白色菌落接种于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反 应体系及反应条件同上）， 得到 7个阳性克隆， 选取其中 4个克隆送至英潍捷基（上 海）贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA的 5 ' 端。 所得的 5'RACE产物克隆测序 后， 将其与 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID NO: 3序列进行拼接。 获得 全长 cDNA序列 SEQ ID NO: 9：
1 TTTTGTTGTT GATAATTTCG TTTAATTAAG AGAGAGAGAT GATGGCGAAG GCGTTGTTAC
61 CGGAATTTTG GACGGAGATT TTGGTGCCGG TGTGCGCCGT GGTGGGAATC GTGTTCTCGC
121 TTTTCCAGTG GTATGTTGTG TCTTGCGTGA AACTCACGGC CGACCGTGGC GGAGAGCACG
181 AAGGAGATGG GAAGAATGGA CACGACGATT ATCTGATCGA GGAAGAGGAA GGAGTTCACG
241 ATCAGAGCGT CGTGGCCAAG TGCGCTGAGA TTCAGACCGC TATATCGGAA GGTGCAACCT
301 CATTTCTGTT CACCGAGTAC AAATATGTTG GTGTCTTCAT GGTTTTCTTT GCTGCCGTTA
361 TCTTTCTCTT CCTGGGATCA GTCCAAGGGT TCAGCACCAA GAGCCAGCCT TGCACTTACG
421 ACAAGACAAG AACATGCAAG CCAGCTCTCG CAACTGCTGT CTTCAGTACC ATCTCCTTCG
481 TGCTCGGCGC AGTGACGTCA GTCCTCTCTG GCTTTCTCGG GATGAAGATT GCCACTTATG
541 CCAACGCTAG AACCACACTT GAAGCAAGGA GAGGTGTTGG GAAGGCTTTC ATCGTTGCAT
601 TCAGGTCTGG TGCTGTAATG GGTTTCCTTC TCGCAGCAAA CGGTCTCTTG GTGCTTTACA
661 TTACCATCAA CCTCTTCAAG ATTTATTACG GCGATGACTG GGAAGGCCTT TTTGAGTCCA
721 TCACTGGTTA TGGTCTTGGT GGATCCTCCA TGGCGCTCTT TGGTAGAGTT GGTGGTGGAA
781 TCTACACCAA GGCTGCTGAT GTTGGTGCTG ACCTTGTGGG AAAAGTAGAA AGGAATATCC
841 CTGAAGACGA TCCCAGGAAT CCAGCTGTTA TTGCTGATAA TGTTGGTGAC AATGTTGGTG
901 ATATTGCTGG GATGGGCTCT GATCTCTTTG GCTCGTACGC TGAATCATCT TGTGCTGCAC
961 TCGTTGTTGC TTCTATCTCG TCTTTTGGAA TCAACCATGA TTTCACAGGC ATGTTGTTCC
1021 CGTTGCTCAT CAGTTCAATG GGGATCTTGG TTTGTTTGAT CACCACTCTC TTTGCCACCG
1081 ACATCTCTGA GATCAAGGCA GTGAAAGAGA TCGAGCCGGC CCTCAAAAAC CAGCTTATTA
1141 TCTCGACGGT TATCATGACT GTTGGAATCG CTTTAGTGTC GTGGACTGGG TTGCCATCTT 1201 CCTTCACAAT CTACAACTTC GGGACACAGA AAGTTGTGAA AAGCTGGGAG CTATTCCTCT
1261 GTGTTGCTGT TGGTCTCTGG GCTGGACTCA GCATCGGCTT TGTTACTGAA TACTATACCA
1321 GCAATGCATA CAGCCCTGTG CAAGACGTGG CGGATTCATG CAGAACAGGA GCAGCAACCA
1381 ACGTAATATT CGGACTTGCT CTTGGTTACA AATCCGTGAT AATTCCAATA TTTGCGATTG
1441 GTGTCAGTAT ATTTGTTAGC TTCAGCTTTG CTGCCATGTA CGGTGTAGCA GTTGCTGCAC
1501 TAGGGATGCT AAGTACCATC GCAACTGGTT TGGCAATTGA TGCTTATGGT CCAATCAGTG
1561 ACAATGCTGG TGGTATTGCT GAGATGGCTG GAATGAGCCA CCGCATCCGA GAAAGAACCG
1621 ACGCTCTTGA CGCCGCTGGA AACACCACTG CTGCTATCGG AAAGGGATTT GCGATAGGTT
1681 CTGCTGCGCT AGTGTCGCTG GCTCTGTTTG GTGCATTTGT GAGCCGAGCA GGAATAGAGA
1741 GAGTGGATGT GTTGACACCA AAGGTAGTGA TAGGGTTGCT TGTAGGGGCA ATGCTTCCAT
1801 ATTGGTTCTC TGCAATGACG ATGAAGAGCG TGGGAAGTGC AGCTCTGAAG ATGGTGGAAG
1861 AAGTGAGGAG GCAGTTCAAC ACCATCCCTG GACTCATGGA AGGTACAGCA AAACCAGACT
1921 ATGCTACATG CGTCAAGATC TCCACTGATG CTTCCATCAA GGAAATGATT CCTCCCGGTT
1981 GCCTTGTCAT GCTTACTCCT CTTATAGTCG GTTTCTTCTT CGGTGTTGAG ACCCTCTCTG
2041 GTGTGCTCGC TGGCTCCCTC ATCTCCGGTG TTCAGATTGC GATATCTGCA TCCAACACTG
2101 GTGGAGCCTG GGACAATGCC AAGAAGTACA TTGAGGCGGG AGCATCAGAG CACGCGAGGA
2161 GCTTAGGGCC AAAAGGGTCA GAGCCACACA AGGCAGCAGT GATAGGTGAC ACAATAGGAG
2221 ACCCCTTGAA GGATACATCA GGACCGTCCC TTAACATATT GATCAAGCTT ATGGCCGTTG
2281 AGTCTCTTGT CTTTGCTCCT TCTTTGCGAC TCACGGTGGT TTCCTCTTCA ACATCTTCTC
2341 GTGAAATAAG CTTTTTAACT CTATACAGTA TATATTTAGC CTACCGAAAG AAATAAAACA
2401 GAAGAAGATA GAATTTTCTC ATCTTATTAA AGGCGGTGGC TGGTTGTATA GAAATATTAG
2461 AAGGTTTTCT CGATAATGAT TAGGGTCCAT ACAAGTAGAA TAACCGTATT ATACTAGTAG
2521 AAGATAATTG TTTTTTGATG ATTGAAACCA AAAGAAAACA AATAAGAAGA TGATTGATTG
2581 ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA
根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下：
SEQ ID NO: 10:
ATGATGGCGAAGGCGTTGTTACC SEQ ID NO: 11:
TCACGAGAAGATGTTGAAGAGG
通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 7¾ P 全长编码基因。
采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以盐处理组小盐芥提取的 mRNA反 转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 X PS Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA、 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ1、 以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min) ， 72 °C 延伸 10 min。 PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟， 离心， 去上清， 晾干， 然后用 21 μΐ双蒸水溶解， 然后向其中加入 2.5 μΐ ΙΟΧΕχ
Buffer 0.5 μΐ 5 mM的 dATP、 1.0 lExTaq。 反应条件： 70°C反应 30分钟。 将得到的 约 2300bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体 上 （得到 ThVPl-pGEM重组载体） ， 然后转化 JM109(方法同上）。 随机挑取 10个白 色菌落接种于含有 50 μ§/ιη1氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘 油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID
NO: 11进行菌液 PCR 扩增 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 7个阳性克隆， 选 取其中 4个阳性克隆送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序， 序列为 SEQIDNO:
2， 其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
VP1蛋白的氨基酸序列： SEQIDNO: 1
1 AKALLPEF WTEILVPVCA
21 VVGIVFSLFQ WYVVSCVKLT
41 ADRGGEHEGD GKNGHDDYLI
61 EEEEGVHDQS VVAKCAEIQT
81 AISEGATSFL FTEYKYVGVF
101 VFFAAVIFL FLGSVQGFST
121 KSQPCTYDKT RTCKPALATA
141 VFSTISFVLG AVTSVLSGFL
161 G KIATYANA RTTLEARRGV
181 GKAFIVAFRS GAV GFLLAA
201 NGLLVLYITI NLFKIYYGDD
221 WEGLFESITG YGLGGSS AL
241 FGRVGGGIYT KAADVGADLV
261 GKVERNIPED DPRNPAVIAD
281 NVGDNVGDIA G GSDLFGSY
301 AESSCAALVV ASISSFGINH
321 DFTG LFPLL ISS GILVCL
341 ITTLFATDIS EIKAVKEIEP
361 ALKNQLIIST VI TVGIALV
381 SWTGLPSSFT IYNFGTQKVV
401 KSWELFLCVA VGLWAGLSIG
421 FVTEYYTSNA YSPVQDVADS
441 CRTGAATNVI FGLALGYKSV
461 IIPIFAIGVS IFVSFSFAA
481 YGVAVAALG LSTIATGLAI
501 DAYGPISDNA GGIAE AG S 52 1 HRIRERTDAL DAAGNTTAAI
54 1 GKGFAIGSAA LVSLALFGAF
561 VSRAGI ERVD VLTPKVVIGL
581 LVGAMLPYWF SAMTMKSVGS
601 AALKMVEEVR RQFNTI PGLM
62 1 EGTAKPDYAT CVKI STDAS I
64 1 KEMI PPGCLV MLTPLIVGFF
661 FGVETLSGVL AGSLI SGVQI
681 AI SASNTGGA WDNAKKYI EA
701 GASEHARSLG PKGSEPHKAA
72 1 VIGDTIGDPL KDTSGPSLNI
74 1 LI KLMAVESL VFAPSLRLTV
761 VSSSTSSR
ThVPl基因的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2
1 ATGATGGCGA AGGCGTTGTT ACCGGAATTT TGGACGGAGA TTTTGGTGCC GGTGTGCGCC
61 GTGGTGGGAA TCGTGTTCTC GCTTTTCCAG TGGTATGTTG TGTCTTGCGT GAAACTCACG
121 GCCGACCGTG GCGGAGAGCA CGAAGGAGAT GGGAAGAATG GACACGACGA TTATCTGATC
181 GAGGAAGAGG AAGGAGTTCA CGATCAGAGC GTCGTGGCCA AGTGCGCTGA GATTCAGACC
241 GCTATATCGG AAGGTGCAAC CTCATTTCTG TTCACCGAGT ACAAATATGT TGGTGTCTTC
301 ATGGTTTTCT TTGCTGCCGT TATCTTTCTC TTCCTGGGAT CAGTCCAAGG GTTCAGCACC
361 AAGAGCCAGC CTTGCACTTA CGACAAGACA AGAACATGCA AGCCAGCTCT CGCAACTGCT
421 GTCTTCAGTA CCATCTCCTT CGTGCTCGGC GCAGTGACGT CAGTCCTCTC TGGCTTTCTC
481 GGGATGAAGA TTGCCACTTA TGCCAACGCT AGAACCACAC TTGAAGCAAG GAGAGGTGTT
541 GGGAAGGCTT TCATCGTTGC ATTCAGGTCT GGTGCTGTAA TGGGTTTCCT TCTCGCAGCA
601 AACGGTCTCT TGGTGCTTTA CATTACCATC AACCTCTTCA AGATTTATTA CGGCGATGAC
661 TGGGAAGGCC TTTTTGAGTC CATCACTGGT TATGGTCTTG GTGGATCCTC CATGGCGCTC
721 TTTGGTAGAG TTGGTGGTGG AATCTACACC AAGGCTGCTG ATGTTGGTGC TGACCTTGTG
781 GGAAAAGTAG AAAGGAATAT CCCTGAAGAC GATCCCAGGA ATCCAGCTGT TATTGCTGAT
841 AATGTTGGTG ACAATGTTGG TGATATTGCT GGGATGGGCT CTGATCTCTT TGGCTCGTAC
901 GCTGAATCAT CTTGTGCTGC ACTCGTTGTT GCTTCTATCT CGTCTTTTGG AATCAACCAT
961 GATTTCACAG GCATGTTGTT CCCGTTGCTC ATCAGTTCAA TGGGGATCTT GGTTTGTTTG
1021 ATCACCACTC TCTTTGCCAC CGACATCTCT GAGATCAAGG CAGTGAAAGA GATCGAGCCG
1081 GCCCTCAAAA ACCAGCTTAT TATCTCGACG GTTATCATGA CTGTTGGAAT CGCTTTAGTG
1141 TCGTGGACTG GGTTGCCATC TTCCTTCACA ATCTACAACT TCGGGACACA GAAAGTTGTG
1201 AAAAGCTGGG AGCTATTCCT CTGTGTTGCT GTTGGTCTCT GGGCTGGACT CAGCATCGGC
1261 TTTGTTACTG AATACTATAC CAGCAATGCA TACAGCCCTG TGCAAGACGT GGCGGATTCA
1321 TGCAGAACAG GAGCAGCAAC CAACGTAATA TTCGGACTTG CTCTTGGTTA CAAATCCGTG
1381 ATAATTCCAA TATTTGCGAT TGGTGTCAGT ATATTTGTTA GCTTCAGCTT TGCTGCCATG 1441 TACGGTGTAG CAGTTGCTGC ACTAGGGATG CTAAGTACCA TCGCAACTGG TTTGGCAATT
1501 GATGCTTATG GTCCAATCAG TGACAATGCT GGTGGTATTG CTGAGATGGC TGGAATGAGC
1561 CACCGCATCC GAGAAAGAAC CGACGCTCTT GACGCCGCTG GAAACACCAC TGCTGCTATC
1621 GGAAAGGGAT TTGCGATAGG TTCTGCTGCG CTAGTGTCGC TGGCTCTGTT TGGTGCATTT
1681 GTGAGCCGAG CAGGAATAGA GAGAGTGGAT GTGTTGACAC CAAAGGTAGT GATAGGGTTG
1741 CTTGTAGGGG CAATGCTTCC ATATTGGTTC TCTGCAATGA CGATGAAGAG CGTGGGAAGT
1801 GCAGCTCTGA AGATGGTGGA AGAAGTGAGG AGGCAGTTCA ACACCATCCC TGGACTCATG
1861 GAAGGTACAG CAAAACCAGA CTATGCTACA TGCGTCAAGA TCTCCACTGA TGCTTCCATC
1921 AAGGAAATGA TTCCTCCCGG TTGCCTTGTC ATGCTTACTC CTCTTATAGT CGGTTTCTTC
1981 TTCGGTGTTG AGACCCTCTC TGGTGTGCTC GCTGGCTCCC TCATCTCCGG TGTTCAGATT
2041 GCGATATCTG CATCCAACAC TGGTGGAGCC TGGGACAATG CCAAGAAGTA CATTGAGGCG
2101 GGAGCATCAG AGCACGCGAG GAGCTTAGGG CCAAAAGGGT CAGAGCCACA CAAGGCAGCA
2161 GTGATAGGTG ACACAATAGG AGACCCCTTG AAGGATACAT CAGGACCGTC CCTTAACATA
2221 TTGATCAAGC TTATGGCCGT TGAGTCTCTT GTCTTTGCTC CTTCTTTGCG ACTCACGGTG
2281 GTTTCCTCTT CAACATCTTC TCGTGA 实施例 3 ThVPl基因的植物表达载体构建
选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。 选择 35S启动子及 Tnos终止子分别作为 ThVPl 基因的启动子和终止子， 具体构建路线见图 1。
使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13， 以植物表达载体 pBI121 (购自北 京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚 合酶。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μΐ ρΒΙ121、 1.0 μΐ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 12禾口 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ1、 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s) ， 72°C延伸 10 min。 通过 EcoRI、 Bglll酶切 将所得的 PCR产物按试剂盒说明 (Promega, T4连接酶试剂盒)连接到 pCAMBIA2300 获得 pCAMBIA2300-l。
SEQ ID NO: 12：
GCACGAATTCGGCGGGAAACGACAATCTGA SEQ ID NO: 13：
ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
用引物 SEQ ID NO: 14禾 P SEQ ID NO: 15 以 pBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μΐ pBI121 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 14 禾口 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ1、 以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 33个循环（94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72°C延伸 30 s)， 72°C延伸 10 min。 通过 Kpnl、 EcoRI 酶切将所得的 PCR 产物连接 (Promega T4 连接酶试剂盒）到 pCAMBIA2300-1获得 pCAMBIA2300-2。
SEQ ID NO: 14：
AAGGGTAACGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：
TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA
用引物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17以 pCAMBIA2300 为模板扩增 35S启 动子。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 ><PS Buffer 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μΐ pCAMBIA2300 1.0 μΐ PrimeSTAR、 10 μΜ的引 物 SEQ ID NO: 16和 SEQ ID NO: 17各 2.0 μ1、 以及 31 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s) ， 72 °C 延伸 10 min。 通过 HindIII、 Sail酶切将所得的 PCR产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。
SEQ ID NO: 16：
ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG SEQ ID NO: 17：
TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 ThVPI编码基因的全长序列（模 板是实施例 2所获得阳性 ThVPl-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μΐ PCR 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μΐ ThVPl-pGEM 1.0 μΐ Prime STAR、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 18禾口 SEQ ID NO: 19 各 2.0 μ1、 以及 31 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 33个循环（94°C 变 性 30 s, 58 °C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min) ， 72 °C 延伸 10 min。 通过 Sall、 Kpnl酶 切将所得的 PCR产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-3， 获得植物表达载体 35S-ThVPl-2300 (图 2 ) 。 SEQ ID NO: 18
ACTGTCGAC ATGATGGCGA AGGCGTTGTT AC SEQ ID NO: 19
ACTGGTACCTCACGAGAAG ATGTTGAAGA GG 实施例 4 35S-ThVPl-2300表达载体转化农杆菌
农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc)感受态细胞的制备： 提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划 单斑接种， 28 °C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ§/ιη1利福平和 50 μ§/ιη1 链霉素的 LB液体培养基中， 28 °C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD6QQ值为 0.4， 形成种子菌液。 取 5 ml培养活化后的菌液 （1 :20的比例） 接种于 100 ml含 50 μ§/ιη1 利福平和 50 μ§/ιη1 链霉素的 LB 液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 小时至 OD6。。=0.8。 冰浴菌液 10 min， 每隔 3 min摇匀一次， 令所述细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000 g离心 10 min， 弃上清液； 加入一定量冰预冷的 10%甘油 （体积比） 重 悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min， 收集沉淀； 用冰预冷的 10%甘油 （体积比） 重 复洗 3-4次； 然后加入适量冰预冷的 10%甘油 （体积比） 重新悬浮细菌沉淀， 即制得 LBA4404感受态细胞， 以 40 μΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。
转化农杆菌： 在冰上融化所述的感受态细胞， 向 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ 实施例 3 获得的 35S-ThVPl-2300 的质粒， 混匀后冰浴约 10 min。 将感受态细胞和 35S-ThVPl-2300质粒 DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯 （购自 bio-rad) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部， 注意不要有气泡。 将所述电击杯放到电击室的 滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。 使用 0.1cm 规格的电击杯的时 候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"， 电击一次。 立即取出电击杯， 加入 28 °C预热的 LB培养基。 快速而轻柔的用移液枪将感受态细胞打匀。 将悬浮液转 入 1.5 ml的离心管， 在 28 °C 以 225 rpm摇动培养 1小时。 取 100-200 μΐ的菌液涂布 于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 g/ml利福平、 50 g/ml链 霉素、 50 μ§/ιη1卡那霉素）， 28 °C培养。 筛选阳性转化克隆， 并将其菌液于 -70°C保存 备用。 实施例 5 受体材料拟南芥培养
选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土（1 : 1 )作为拟南芥种植土壤。 直径 9cm 的花盆， 每盆播种 20-30颗。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一个湿润 的环境。 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000k， 光照周期为 12小时黑暗、 12 小时光照培 养， 每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 30天后， 保留 4-5棵植株， 光照周期调整为 8小时黑 暗、 16小时光照培养， 待大部分植株都抽薹之后， 在花序基部剪掉整个主苔， 去其顶端 优势， 约 1周后在腋芽部位长出 4-6个新生侧苔， 待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形 成 1-2个角果时， 便可用于转化 （图 3 ) 。 实施例 6 拟南芥花浸转化：
将实施例 4 获得的已转化表达载体的农杆菌菌液接种至含有 10-50μ§/ιη1卡那霉素 (kan)的 LB培养基中培养过夜， 第二天早上按 1 :50接种至含有抗生素的新的 LB培养基 中 （1L) ， 培养约 8个小时， 农杆菌液 OD600应当在 1.0到 1.2之间。 室温 5000rpm离 心 5分钟， 弃上清， 将农杆菌沉淀悬浮于一定体积的渗透培养基里（1/2MS, 5%蔗糖； 用 KOH调至 pH5.7; 0.02%Silwet L-77), 使 OD600在 0.8左右。 将实施例 5所述用于转 化的拟南芥的上部缓缓、 螺旋式浸入接种培养基内， 轻轻顺时针晃荡， 约 2分钟， 用透 明塑料罩盖严以保持湿度， 放入温室过夜。 24小时后移去塑料透明罩， 用水浇透。 之后 2-3 周， 保证植株水分充足。 当植株停止开花， 第一个果荚成熟变黄时， 用纸袋套住， 当纸袋内的所有果荚变黄后， 停止浇水， 1-2 周干燥后取回实验室， 进行转化子选择， 同时取未经转化处理的拟南芥果荚作为对照。 实施例 7 拟南芥阳性转化子的筛选：
种子消毒： 先用 70%乙醇浸泡 10分钟， 在上述处理时要不时地使种子悬浮； 然后用 无菌水洗四次， 在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。 处理后的种子均匀涂布在含 50 μ g/ml 卡那霉素的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天 （一块 150mm直径的平皿 最多播种 1500棵） ， 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000k， 光照周期为 12小时黑暗、 12 小时光照培养， 培养 7-10天。 根据生长状况判断是否为转基因种子。 成功转入重组质粒 的种子能够在抗性培养基上正常生长出 4片以上真叶。 非转基因种子不能正常生长， 仅 能长出 2片子叶， 根的生长也受到严重抑制， 一般萌发 10天以后死亡。 转基因种子在 MS+kan平板上萌发 2周以后， 将阳性植株转入土壤继续培养， 转基因拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测， 去除阴性植株， 收集阳性植株种子， 标号：
实施例 8 过表达 ThVPl的转基因拟南芥 T1代植株的种植
选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。
T0bl-T0b20每个转化子播种 2盆， 对照拟南芥播种 2盆， 每盆播种 20-30颗种子。 播种 以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提供一个湿润的环境。 恒温 22°C， 光照强度 3500-40001x, 光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS, 培养 25天后， 转基因拟南芥用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19做 PCR检测， 去除阴性 植株， 保留 12-14阳性棵苗， 继续培养 10天后， 选取大小一致的转基因拟南芥、 对 照拟南芥做耐盐实验， 每盆保留大小较一致的 7-9棵苗。 实施例 9 过表达 ThVPl的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验
转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆不作处理， 正常浇灌 1/2MS, 转基因拟南芥、 对照拟南芥各一盆浇灌含有 150Mm NaCl 的 1/2MS， 恒温 22 V， 光照强度
3500-40001x, 12小时光培养 /12小时暗培养循环。 10天后观察实验结果： T1代转基因 植株（TO代转基因植株的种子长成的植株）的耐盐性鉴定表明， Tlb7、 Tlbl0、 Tlbl 5 三个株系表现出明显的耐盐性 （见图 4， 以 Tlb7 例， Tlbl0、 Tlbl 5 的结果与其类 似， 在此未示出） 。 实施例 10 在转录水平上验证 ThVPl基因的表达
实施例 9中耐盐好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵 （分别属于上述三个耐盐 株系）， 实施例 9中对照植株随机选取 4棵， 各剪取盐处理 14天的叶片 0.05 g， 用植 物 RNA提取试剂盒 （Invitrogen) 提取总 RNA。 紫外分光光度测定总 RNA在 260 nm 和 280 nm 的吸光度值， 计算各个 RNA 浓度。 依照 Invitrogen 反转录试剂盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 ( 1 μg总 RNA作为模板， 反 转录引物 SEQ ID NO: 11 )。 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO: 20： AGCACCAAGA GACCGTTTGC TG ) 扩增 ThVPl， 检测其转录情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以上述反转录的 cDNA为模板进行 PCR反 应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer、 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μΐ cDNA 1.0 μΐ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 10禾 P SEQ ID NO: 20各 2.0 μΐ以及 30 μΐ 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 32个循环 （94°C 变性 30 s， 58 °C退 火 30 s， 72 °C 延伸 lmin)， 72 °C 延伸 10 min。 产物电泳结果如图 5所示： M为 DNA Ladder Marker ( DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司） ， 1-4为不耐盐的对照拟 南芥植株， 13为质粒 PCR阳性对照 （35S-ThVPl-2300质粒） ， 5-12为耐盐 T1代转 基因拟南芥植株。 图中所示条带大小与阳性对照的大小一致 （约为 600bp ) 。 结果表 明， 耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 7¾^ 的转录较强， 不耐盐对照拟南芥植株中没 有 ThVPl的转录。

Claims

权 利 要 求 书
1. 小盐芥的一个液泡膜焦磷酸酶， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示。
2. 编码权利要求 1所述液泡膜焦磷酸酶的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2 所示。
3. 一种重组表达载体， 其是通过将权利要求 2 所述的基因插入到一种表达载体 而获得的， 并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连 接， 优选地， 所述表达载体是 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3所述的重组表达载体， 其为附图 2所示的 35S-ThVPl-2300载体。
5. 一种重组细胞， 其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组 表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐盐性的方法， 包括： 将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3 或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达； 优选地， 所述植物 是拟南芥。
7. 一种制备转基因植物的方法， 包括： 在有效产生植物的条件下培养含有权利 要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法， 其中所述植物是拟南芥。
9. 权利要求 2所述的基因、 权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5 所述的重组细胞用于改善植物耐盐性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途， 其中所述植物是拟南芥。
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