CN111518941B - 一种用于检测玉米植物an1的核酸序列及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测玉米植物AN1的核酸序列及其检测方法，所述玉米植物的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示序列或其互补序列、或者SEQ ID NO:2所示序列或其互补序列。本发明玉米植物AN1对干旱和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件AN1的DNA分子。

Description

一种用于检测玉米植物AN1的核酸序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，涉及一种用于检测玉米植物AN1的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种耐受干旱和草铵膦除草剂施用的转基因玉米事件AN1和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件AN1的核酸序列及其检测方法。

背景技术

田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。据联合国粮食与农业组织统计，全球因杂草导致的粮食生产损失每年高达950亿美元，相当于损失了3.8亿吨小麦，约合2009年全球小麦产量的半数以上。在950亿美元的经济损失中，贫困的发展中国家承受了大约700亿美元(FAO.The lurking menace of weeds[J/OL].(http://www.fao.org/news/story/en/item/29402/icode/)，2009-08-11.)。因此，有效地控制田间杂草是促进粮食增产的重要措施之一。在我国，危害玉米的杂草种类有40多种，其中危害较大的杂草有10多种。在一般年份杂草可使玉米减产10-20％，严重时更高达30-50％。另外，随着我国农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐该类灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题。在玉米生长期喷施1-2次就能有效解决杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。因此，耐除草剂转基因玉米具有非常广阔的应用价值和市场潜力。

在当今世界，水资源短期是全球可持续发展面临的重要挑战，在世界总耕地面积中，干旱及半干旱地区占了43.9％(张木清，陈如凯.作物抗旱分子生理与遗传改良[M].2005，北京：科学出版社.)。尽管玉米是旱地作物，但其生长过程中的需水量较大，约至少2500mm的降水量，而且玉米对水分胁迫非常敏感，特别是花期干旱直接影响玉米产量(王士谦.玉米抗旱性的研究进展[J].河北科技师范学院学报，2005，19(3)：76-80.)，因此，在引起干旱及半干旱地区玉米减产的诸多因素中，干旱是最主要的非生物逆境胁迫因子(郝转芳，李新海，张世煌.玉米耐旱QTL定位研究进展[J].玉米科学，2007，15(2)：49-52.)。我国每年种植的玉米中，受到干旱影响的面积占了大约60％，造成减产20％～30％。因此培育抗旱玉米品种是减少产量损失、保障稳产的有效措施。

AnVP1是旱生植物矮沙冬青中的液泡膜氢离子焦磷酸酶基因，之前的研究资料已证实，AnVP1基因在玉米中异源表达后会提升玉米的耐旱性(周夏玉.矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因转化玉米[D].四川：四川农业大学，2017.)。通过将包含AnVP1基因的表达载体转化到玉米中能够获得具有耐旱性状的玉米转化事件。然而，所获得的最优转化事件A31、A33和A37在处理前其株高显著低于对照，生长受到抑制，耐旱性状也并不突出(张晓芳.矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因(AnVP1)的异源表达提高玉米耐旱性[D].四川：四川农业大学，2018.)，这样的性状表现无法进行商业化应用。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致，从而导致了转化事件在性状表现上存在差异。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化事件的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。因此，需要对更多的转化事件进行性状鉴定和筛选，以获得综合性状表现优异，具有商业化前景的优异转化事件。

能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的DNA构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐旱耐除草剂性状表现优异的玉米转化事件以及用于检测玉米植物AN1的核酸序列及其检测方法。转基因玉米事件AN1对干旱和草铵膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件AN1的DNA分子。

为实现上述目的，本发明使用pZZ00026-Ubi-AnVP1-T-nos表达载体，通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系Zh-1，获得了51株阳性转化苗。通过耐旱性和综合农艺性状鉴定获得了一个表现最好的转化事件AN1，该事件比同批次转化事件以及包含同样载体的A31、A33和A37转化事件具有更佳的耐旱性和综合农艺性状，同时AN1也具有对除草剂草铵膦的耐受性，因此AN1能够用来增强玉米的耐旱和耐除草剂性状。

为了表征AN1的身份特征，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列，或其互补序列。

进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其互补序列。

更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其互补序列。

更进一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:5所示序列或其互补序列。

另一方面，本发明提供了用于检测玉米转化事件的探针，其特征在于，包括SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其片段或其变体或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含上述用作探针的序列。

在一些实施方案中，上述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含上述的探针和/或上述的引物对。

本发明还提供了检测玉米转化事件的方法，其特征在于，包括利用上述的探针或上述的引物对或上述的探针和引物对或上述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述转化事件。

本发明还提供了对玉米进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含上述核酸分子的玉米；

2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，

3)对步骤2)所获得的后代植物进行除草剂和/或干旱的抗性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

进一步的，本发明还提供了利用上述方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。

所述SEQ ID NO:1或其互补序列为转基因玉米事件AN1中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:1或其互补序列跨越了玉米插入位点的左侧翼基因组DNA序列和插入序列的左边界5’末端的DNA序列，包含所述SEQ ID NO:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件AN1的存在。所述SEQ ID NO:2或其互补序列为转基因玉米事件AN1中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:2或其互补序列跨越了插入序列的右边界3’末端的DNA序列和玉米插入位点的右侧翼基因组DNA序列，包含所述SEQ ID NO:2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件AN1的存在。

本发明中，所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:3或其互补序列中5’左侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:6的所述SEQ ID NO:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物对。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件AN1或其后代的存在。

所述SEQ ID NO:3或其互补序列为转基因玉米事件AN1中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为920个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:3或其互补序列由501个核苷酸的玉米左侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸1-501)、79个核苷酸的PZZ00026-UBI-ANVP1-T-NOS构建体左边界DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸502-580)和340个核苷酸的耐草铵膦基因的第一表达盒的5’末端DNA序列(SEQ ID NO:3的核苷酸581-920)组成，包含所述SEQ ID NO:3或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件AN1的存在。

所述核酸序列可以为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸序列)，或者为所述SEQ ID NO:4或其互补序列中3’右侧翼玉米基因组DNA区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的所述SEQ ID NO:4的一部分。当第三核酸序列和第四核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的DNA扩增方法中包括DNA引物组。使用DNA引物对在DNA扩增方法中产生的扩增产物是包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件AN1或其后代的存在。

所述SEQ ID NO:4或其互补序列为转基因玉米事件AN1中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1110个核苷酸的序列，所述SEQ ID NO:4或其互补序列由406个核苷酸的耐旱基因的第二表达盒的3’末端DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸1-406)、224个核苷酸的PZZ00026-UBI-ANVP1-T-NOS构建体右边界DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸407-630)和480个核苷酸的玉米整合位点右侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO:4的核苷酸631-1110)组成，包含所述SEQ ID NO:4或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件AN1的存在。

所述SEQ ID NO:5或其互补序列为表征转基因玉米事件AN1的长度为7626个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述SEQ ID NO:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件AN1的存在。

表1 SEQ ID NO:5包含的基因组及遗传元件

1：单位bp。

本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸序列或第三和第四核酸序列不必仅仅由DNA组成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所述的核苷酸。当选自SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。

本发明还提供了一种保护玉米植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草铵膦除草剂施加到种植至少一种转基因玉米植物的大田中，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第581-6922位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对草铵膦除草剂的耐受性。

本发明还提供了一种保护玉米植物免受由干旱引起的损伤的方法，其特征在于，包括在缺水土壤中种植至少一种转基因玉米植物，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第581-6922位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对干旱的耐受性。

在本发明用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

所述“玉米”是指玉蜀黍(Zea mays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组DNA已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

“侧翼DNA”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组侧翼区”或“基因组5’侧翼序列”等。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组侧翼区”或“基因组3’侧翼序列”等。

引起外源DNA的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化事件，所述不同侧翼区是每个转化事件所特异性含有的。当重组DNA通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化事件也会含有异源插入物DNA和基因组DNA的段之间或两段基因组DNA之间或两段异源DNA之间的独特的接合。“接合”是两个具体的DNA片段连接的点。例如，接合存在于插入物DNA连接侧翼DNA的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个DNA片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合DNA”是指包含接合点的DNA。

本发明提供了称为AN1的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件AN1即为玉米植物AN1，其包括转基因玉米事件AN1的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件AN1的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物AN1的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

本发明转基因玉米事件AN1包含了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件AN1获得对干旱和/或草铵膦除草剂的耐受性。所述DNA构建体包含一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码矮沙冬青中的液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AnVP1，所述AnVP1蛋白的核酸序列对干旱具有耐受性。所述DNA构建体包含另一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的基因bar，所述PAT蛋白的核酸序列对草铵膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异型启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、泛素蛋白(Ubiquitin)启动子、肌动蛋白(Actin)启动子、土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)启动子、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(Patatin)启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(GST)启动子、E9启动子、GOS启动子、alcA/alcR启动子、毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)RolD启动子和拟南芥属(Arabidopsis thaliana)Suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(PINⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(TEV)翻译激活因子、CaMV35S增强子和FMV35S增强子。所述信号肽/转运肽可以引导EPSPS蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网。

所述“草铵膦”是指能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶的膦酸类除草剂，用“草铵膦除草剂”处理是指使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草铵膦制剂使用率的选择不超过普通农艺技术人员的技能。使用任何一种含有草铵膦的除草剂制剂处理包含了来源于转基因玉米事件AN1的植物材料的田地，将控制所述田地中的杂草生长，并且不影响来源于转基因玉米事件AN1的植物材料的生长或产量。

所述DNA构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。

转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。

DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达盒包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

转基因“事件”是通过用异源DNA构建体转化植物细胞而得到的，即包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”指包括异源DNA的原始转化事件和该转化事件的后代。术语“事件”还指转化事件和含有异源DNA的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于转化事件亲本的插入DNA和侧翼基因组DNA也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化事件的DNA序列，该DNA序列包含插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该DNA序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入DNA的亲本系(例如原始转化事件和其自交产生的子代)与不含有插入DNA的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入DNA。

本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的DNA和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。所述“重组DNA分子”是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

培养对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的转基因玉米事件AN1，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件AN1及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件AN1及其后代是通过利用本发明的对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏对干旱或草铵膦除草剂具有耐受性；然后选择对草铵膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使干旱和草铵膦耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过用草铵膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件AN1中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的DNA分子)的鉴定来选择子代，从而产生对干旱和草铵膦除草剂具有耐受性的玉米植物。

还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件AN1基因组的一条DNA链互补，不论该基因组DNA是来自转基因玉米事件AN1或种子还是来源于转基因玉米事件AN1的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

基于本发明的侧翼基因组DNA和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件AN1的植物材料中分离相应的DNA分子，并确定该DNA分子的核酸序列。所述DNA分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述DNA分子的片段可以用作引物或探针。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件AN1的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×SSC和约65℃下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。

本发明另一优选的标记物核酸分子与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”指的是在DNA热扩增反应中仅允许引物对目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标核酸序列相应的野生型序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸序列结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件AN1通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件AN1，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件AN1，从玉米植物组织样品或提取物提取的DNA可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件AN1的DNA的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源DNA的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件AN1也是诊断性的。

扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

可选的，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入DNA序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。PCR扩增方法已经发展到可扩增22kb的基因组DNA和42kb的噬菌体DNA。这些方法以及本领域的其他DNA扩增方法可以用于本发明。插入的外源DNA序列和来自转基因玉米事件AN1的侧翼DNA序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件AN1的基因组进行扩增，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。

基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒含有DNA引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标DNA上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的玉米基因组区的任何部分同源或互补的以及与SEQ ID NO:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，其扩增与转基因玉米事件AN1的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:1。鉴别在DNA扩增方法中有用的引物对还包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，其扩增与转基因玉米事件AN1的3’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括SEQ ID NO:2。用作DNA引物的其它DNA分子可选自SEQ ID NO:5。

这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是GeneticBit Analysis，该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的侧翼基因组DNA序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行PCR扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

另一种方法是Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dNTPs，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。

荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法(Chen X,Levine L,and Kwok P Y.Fluorescence polarization in homogeneous nucleic acid analysis[J].Genome Res,1999,9(5):492-8.)。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组DNA结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

Taqman被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件AN1的植物材料的适合技术还可以包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过X光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

也可应用分子标记对序列进行检测(Tyagi S and Kramer F R.Molecularbeacons:probes that fluoresce upon hybridization[J].Nat Biotechnol,1996,14(3):303-8.)。设计一个跨越插入DNA序列和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的DNA分子。包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的DNA分子是有用的。

可以使用本发明所述的组合物和DNA检测领域描述的或已知的方法来开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件AN1的DNA，还可以用于培育含有转基因玉米事件AN1的DNA的玉米植物。所述试剂盒可以含有DNA引物或探针，其同源于或互补于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的至少一部分，或含有其它DNA引物或探针，其同源于或互补于DNA的转基因遗传元件中所含的DNA，这些DNA序列可以用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在图1和表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的DNA结构包含：位于转基因插入序列5’末端的玉米AN1左侧翼基因组区域，来自农杆菌的左侧边界区域(LB)的一部分插入序列，第一个表达盒由花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S promoter)，可操作地连接到草丁膦(草铵膦)抗性基因序列(bar)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒的35S终止子胭脂碱合成酶基因终止子(CaMV 35S terminator)上而组成；第二个表达盒由玉米ubiquitin基因启动子(ubiquitinpromoter)，可操作地连接到矮沙冬青中的液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AnVP1上，并可操作地连接到胭脂碱合成酶基因终止子(nos terminator)上而组成，来自农杆菌的右侧边界区域(RB)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的玉米植物AN1右侧翼基因组区域(SEQ ID NO:5)。在DNA扩增方法中，作为引物的DNA分子可以是来源于转基因玉米事件AN1中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件AN1中侧翼玉米基因组的DNA区域的任何部分。

转基因玉米事件AN1可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草甘膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件AN1一起育种，可以提供抗抗虫并抗多种除草剂的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。

本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸序列及其检测方法，转基因玉米事件AN1具有耐受含草铵膦的农业除草剂或耐受干旱的生长条件的作用。该性状的玉米植株表达焦磷酸酶AnVP1和膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)蛋白，其赋予植物对干旱和草铵膦的耐受性。同时本发明检测方法中SEQ ID NO:1或其互补序列、SEQ ID NO:2或其互补序列、SEQ IDNO:3或其互补序列、SEQ ID NO:4或其互补序列、SEQ ID NO:6或其互补序列、或者SEQ IDNO:7或其互补序列可以作为DNA引物或探针以产生诊断为转基因玉米事件AN1或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件AN1的植物材料的存在。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1转基因插入序列与玉米基因组结合部位的结构示意图。

图2重组表达载体PZZ00026-UBI-ANVP1-T-NOS的物理图谱。各元件英文及缩写含义列举如下：

T-Border(left) 农杆菌C58的T-DNA左边界序列。

CaMV 35S花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S终止子。

terminator

bar 编码PAT蛋白，解除草铵膦毒性。

CaMV 35S promoter 花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。

ubiquitin promoter 玉米ubiquitin基因的启动子。

AnVP1 AnVP1基因CDS。

nos terminator 胭脂碱合成酶基因的终止子。

T-Border(right) 农杆菌C58的T-DNA右边界序列。

PVS1 sta pVS1质粒的质粒稳定位点。

PVS1 rep pVS1质粒的复制起始位点。

PBR322 bom pBR322质粒的bom位点。

PBR322 ori pBR322质粒的复制起始位点。

kanamycin(R) 编码氨基糖苷磷酸转移酶蛋白，赋予细菌卡那霉素抗性。

图3 AN1事件与A31、A33、A37事件的耐旱性状表现。CK：非转基因受体对照玉米植株；A31、A33、A37、AN1：分别表示A31、A33、A37、AN1转化事件玉米植株。第一行照片拍摄于干旱处理前；第二行照片拍摄于干旱处理20d；第三行照片拍摄于复水2d。

图4 AN1事件种子在干旱处理和正常情况下的发芽情况。CK：非转基因受体对照玉米种子；AN1：AN1转化事件玉米种子。使用16％PEG进行模拟干旱处理。

图5盆栽干旱胁迫试验中AN1植株表现。CK：非转基因受体对照玉米植株；AN1：AN1转化事件玉米植株。

图6盆栽干旱胁迫试验中AN1根系表现。CK：非转基因受体对照玉米根系；AN1：AN1转化事件玉米根系。

图7转化事件特异性PCR验证结果。M：Marker，大小标注在旁；AN1：含有AN1转化事件的玉米材料。左边界PCR片段预期大小378bp；右边界PCR片段预期大小265bp。

具体实施方式

本申请涉及的转化事件AN1是指以玉米自交系Zh-1为受体经过遗传转化后得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的玉米植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有图1所示的物理图谱，所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:5的第502-7146位核苷酸所示序列。转化事件AN1可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体转化其他受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件AN1还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

实施例1转化事件的获得和筛选

使用已经构建好的pZZ00026-Ubi-AnVP1-T-nos表达载体，通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系Zh-1。获得了51株阳性转化苗。其中pZZ00026-Ubi-AnVP1-T-nos载体大小为13145bp，载体物理图谱见图1。载体的构建方法、玉米遗传转化方法以及bar和AnVP1目的基因分子检测方法参照——周夏玉.矮沙冬青液泡膜氢离子焦磷酸酶基因转化玉米[D].四川：四川农业大学，2017.

由于本发明的目的是获得综合性状和耐旱性状表现比之前的转化事件A31、A33和A37更好的转化事件，因此本发明首先对获得的阳性转化植株进行了耐旱性的鉴定和筛选，同时以A31、A33和A37三个事件作为参照。

本发明通过盆栽实验鉴定各株系的耐旱性，具体步骤为：取qRT-PCR检测AnVP1基因表达正常的12个T2代转基因事件(AN1-AN12)株系种子，并以未转化自交系Zh-1为对照(受体对照)，75％乙醇消毒清洗后催芽，播种于塑料花盆内，每株系2盆，5叶期每盆选留长势一致的幼苗3株；每株系及对照随机选一盆浇灌16％的PEG(聚乙二醇，Polyethyleneglycol 6000)模拟干旱胁迫，2d后观察记录萎焉状况；每株系及对照另一盆停止浇水自然干旱，2周后，观察记录萎焉状况。

结果显示，各株系在干旱胁迫20天后均表现出萎蔫，但转基因株系枯萎程度较低，与对照的差异较明显。复水2d后，转基因株系基本恢复正常生长，但非转基因受体对照不能恢复。进一步统计干旱胁迫后各株系地上部分的生物量，结果显示，AN1事件的生物量极显著高于其他同批次转基因事件，处理前后生物量的降低值也显著高于之前创制的A31、A33、A37事件，同时在未做干旱胁迫的处理中，AN1的株高和生物量与受体对照相比没有显著差异(表2)。这表明AN1事件不仅耐旱性状突出，而且综合性状没有明显的负面表现，可以应用于耐旱商业化育种。AN1事件与A31、A33、A37事件的耐旱性状表现见图3。

表2各转化事件的耐旱性状表现

数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示。

实施例2转化事件AN1对除草剂和干旱耐受性的进一步鉴定

通过田间喷施除草剂进一步鉴定AN1的除草剂耐受性，通过发芽试验、盆栽干旱胁迫和田间试验等方法进一步鉴定转基因玉米株系的耐旱性。

1、除草剂耐受性鉴定

于2019年春季开展除草剂耐受性鉴定，将AN1转化事件种子播种于四川雅安转基因圃，5叶期时喷施50mg/mL浓度的草铵膦，7d后，受体对照玉米植株开始枯黄死亡，而AN1转化事件则能够正常生长(表3)。这表明AN1具有对草铵膦除草剂的耐受性。

表3转化事件的除草剂耐性表现

2、发芽试验

发芽试验严格挑选均匀饱满、大小一致的种子，然后用75％酒精溶液消毒3min，再用灭菌水冲洗3次，用滤纸吸干表面的水。种子放在直径为9cm的灭菌培养皿中，铺一层滤纸，每皿20粒。每个发芽皿每天定量加水10mL，置于28℃(14h)/22℃(10h)昼夜循环的光照培养箱中。第3d分别用0％、20％的PEG溶液进行处理。各株系每个处理设三次重复。以胚芽长到种子长度一半时作为种子已发芽的统计标准。第8d统计每个培养皿中种子的发芽率，并计算平均值。

结果显示，在非干旱胁迫条件下，AN1与A31、A33、A37事件及受体对照Zh-1之间的发芽率差异不显著，均在75％以上。然而，在16％PEG模拟干旱胁迫条件下，各材料的发芽率均降低，A31、A33、A37事件及对照Zh-1发芽率降低到30％以下，特别是受体对照Zh-1发芽率不足20％，而AN1材料的发芽率还能保持在30％以上，显著高于对照Zh-1和其他转化事件，结果见表4。AN1与受体对照的发芽情况见图4。

表4转化事件的发芽率性状表现

数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验同样处理下各材料间数据的差异显著性(α＝0.05)。

3、盆栽干旱胁迫

进一步使用盆栽干旱胁迫对转化事件和对照材料进行处理，并测定3个耐旱指标——相对含水量、相对导电率和丙二醛含量数据，以评估植株耐旱性状表现。盆栽干旱胁迫和耐旱指标的测定方法如下：

选取AN1纯合株系和受体对照Zh-1均匀饱满的种子，用10％H₂O₂消毒20min后清水漂洗，在30℃温水中浸泡2～4h。将浸泡过的种子用滤纸卷起，竖放在水中，放置在28℃(14h)/22℃(10h)昼夜循环的光照培养箱中发芽；待种子发芽后，选发芽一致的萌发种子胚根向下小心移栽至装有营养土的塑料花盆中，每盆4粒，每个株系重复3盆，在28℃(14h)/22℃(10h)、200μmoL/m²·s(12h)光照和正常浇水条件下培养；长至三叶期时，停止浇水进行干旱胁迫，待受体对照植株芯叶枯萎时复水，处理前后拍照观察记录表型，并各选取3株处理后的AN1植株和Zh-1植株，记录观察根系的生长状况，测量根长。

将AN1、其他转化事件和受体对照Zh-1各取三株干旱胁迫处理后的玉米植株进行生物量测定，材料的鲜重可在擦试干净植株表面后直接测定。运用烘干法材料干重的测定，首先将植株材料放在的烘箱内，在105℃下杀青30min，然后转至80℃烘干至称重，最后用电子天平进行干重的测定。测定完之后，进行根冠比的计算，即根系干重与茎叶干重的比值。

相对含水量测定取干旱前后各处理中高度一致的叶片0.5g，将其用去离子水将其表面冲洗干净，用滤纸吸干表面水分后称取其鲜重(FW)，然后放入去离子水中，4℃下浸泡过夜，再用滤纸吸干表面水分，称取其湿重(TW)，最后放在85℃烘箱中干燥(0.5～1h)，称取干重(DW)，按照以下公式计算叶片中的相对含水量(RWC)：RWC(％)＝(FW-DW)/(TW-DW)×100。每三株作为一个生物学重复，设置三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。

相对导电率测定方法为：每个株系在干旱前后处理中选生长一致的幼苗，取下叶片，经去离子水冲洗干净，用滤纸吸净表面的水分，去掉主脉，称取0.5g后将叶片切割成大小一致的小块，放入试管中，加入20mL去离子水将叶片完全浸没，浸泡10h后用电导仪测得电导率R1，再将试管放入沸水浴中煮沸20min，冷却至室温，测得导电率R2。每三株作为一个生物学重复，设置三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复，计算相对导电率。

相对导电率(％)＝R1/R2×100％。

丙二醛含量测定方法为：称取处理前后各植株叶片0.5g放于研钵中，加入2mL10％的三氯乙酸和少量石英砂，研磨至匀浆，再加入3mL 10％的三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000r/min离心10min。取上清液2ml，加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸(TBA，用10％的三氯乙酸配制)溶液，混合后在沸水浴中煮沸15min，迅速在冰上冷却，7000r/min离心5min，取上清分别在测定450、532和600nm处的吸光度(OD₅₃₂、OD₆₀₀和OD₄₅₀)，各株系每个处理取三株作为一个生物学重复，设置三个生物学重复，每个生物学重复进行三次技术重复。根据下列公式计算叶片中丙二醛的含量：

C(μmol/L)＝6.45(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.56×OD₄₅₀

丙二醛含量(μmol/g)＝C×2V/G

式中，V为上清液的总体积(mL)，G为称取叶片材料的鲜重(g)。

盆栽干旱胁迫试验的结果显示，受体对照植株的芯叶在干旱胁迫10d开始萎蔫，在处理20d后，对照植株基本完全枯萎，而AN1枯萎程度极低，显著比对照弱。复水3d后，AN1植株恢复生长，叶片变绿，而受体对照Zh-1植株完全没有明显的表型恢复(图5)。这说明AN1玉米植株具有较强的耐旱性。进一步通过测定相对含水量、相对导电率和丙二醛含量3个耐旱指标，发现干旱处理后AN1比A31、A33、A37以及受体对照相对水含量更高，相对导电率更低，丙二醛含量更低(表5)，这些都显示AN1具有更佳的耐旱性表现。

表5盆栽干旱胁迫和耐旱指标测定结果

数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料数据的差异显著性(α＝0.05)。

进一步观察和测量干旱处理后的植株株系发育情况。如图6所示，AN1植株的根系比对照植株更发达且主根更长。此外，AN1植株的根冠比和鲜重也显著高于A31、A33、A37及受体对照植株(表6)。

表6转化事件的植株株系根冠比和鲜重

数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料数据的差异显著性(α＝0.05)。

4、田间试验

田间试验于2019年夏季新疆维吾尔自治区农业科学院安宁渠试验农场转基因玉米耐旱性公共鉴定平台(东经87°28′，北纬44°08′，海拔654m)，按裂区设计种植。主区分灌溉和干旱两种处理，重复3次，中间设3.5m隔离带。根据气象站的观测数据，按降雨量折算扣除灌溉水量。灌溉处理全生育期经滴灌系统灌溉8次，每次含降雨量600m³/hm²，全生育期含降雨量总共灌溉4800m³/hm²。干旱处理全生育期经滴灌系统灌溉5次，每次含600m³/hm²的降雨量，全生育期含降雨量总共灌溉3000m³/hm²，抽雄期以后不再灌溉。副区设AN1和受体对照Zh-1共2个株系，双行种植，行长3m，株距0.3m，每行11株，行距0.55m，密度60298.5株/hm²。

播种前统一机施磷酸二铵300kg/hm²、尿素75kg/hm²。播种后覆膜，用滴灌系统按主区设计灌溉，整个生育期期间不揭膜。播后施用1次锈去津+硝磺草酮除草剂，苗期施用1次嗅氢菊酯防控红蜘蛛，施用3次嗅氢菊酯防控地老虎。在玉米全生育期进行中耕3次，除草2次，待长到拔节期时再施尿素224kg/hm²。各项田间管理操作需在同一天内完成。

待成熟后，调查测量各小区中各株系的百粒重和单株粒重，按下列公式计算株系的耐旱系数：

AN1和A31、A33、A37及受体对照的耐旱系数计算结果见表7。数据显示，AN1耐旱系数指标比A31、A33、A37及受体对照显著要高，表明AN1的田间耐旱性表现好于A31、A33、A37及受体对照。

表7转化事件AN1的田间耐旱表现

数值以3次生物学重复的“平均值±标准差”表示，采用LSD法检验各材料数据的差异显著性(α＝0.05)。

以上结果进一步验证了AN1的耐旱性和综合农艺性状比转化事件A31、A33和A37更好，可以用于进一步的商业化开发。

实施例3转化事件AN1外源序列的侧翼序列及玉米基因组插入位置

为了明确转化事件AN1的身份特征，本发明进一步鉴定了AN1外源序列在玉米基因组上的插入位点。取100mg AN1植株叶片，液氮快速研磨后采用CTAB法提取总DNA。将检测合格的样品基因组DNA用超声波片段化，然后对片段化的DNA进行纯化、末端修复、3'端加A、连接测序接头。再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库。质检合格的文库利用Illumina nova测序平台对材料进行测序，测序深度为10×。将测序获得的Raw data进行质量评估，获得过滤序列Clean data，自主编写Perl脚本将Clean data的fq文件转换为fa格式，然后将过滤序列与玉米B73RefGen_v4参考基因组序列(http://blast.maizegdb.org/home.php？home.php？a＝BLAST_UI)进行比对。定位过滤序列在参考基因组上的位置，统计样品的测序深度、基因组覆盖度等信息。

将AN1测序数据分别与参考基因组和外源T-DNA序列进行比对，根据比对结果分为两类，第1类为一端序列(Reads)比对上参考基因组序列，另一端序列(Reads)比对上插入序列；第2类为两端中任何一端的一部分比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。用Blast比对参考基因组，组装能比对上外源插入序列的全部Reads。根据组装的Contig使用Blast分别比对外源插入序列和参考基因组，选取Contig序列比对到染色体的区域，获得外源插入片段插入位置信息。分析结果显示AN1中的外源T-DNA序列反向插入玉米基因组Chr 8:77526519-77526550bp位置处。

在插入位点的左边界，截取基因组上插入位点的上游500bp及T-DNA序列上500bp，右边界则取基因组插入位点下游500bp及T-DNA序列上500bp，利用NCBI网站的Primerblast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对截取的序列进行引物设计，扩增产物融合一部分玉米基因组序列和一部分T-DNA序列。

以转基因玉米株系基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应在20μL体系中进行。扩增循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，T_m退火30s，72℃延伸一定时间(按产物片段大小设置)，35个循环；72℃延伸5min。

根据侧翼序列和插入位置的结果利用基因组上游引物(SEQ ID NO:8)与载体左边界引物(SEQ ID NO:9)扩增以及载体右边界引物(SEQ ID NO:10)与基因组下游引物(SEQID NO:11)对AN1转化事件进行PCR扩增，以验证外源片段插入位置。结果见图7。结果证明AN1外源片段稳定插入到玉米基因组Chr 8:77526519-77526550bp位置处，插入序列大小为6645bp。

实施例4转化事件AN1的检测方法

可由转基因玉米事件AN1进行育种，并用育成的新品种生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因玉米事件AN1材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的转基因玉米事件AN1核苷酸序列，其中探针序列或引物扩增序列选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所示的序列，以诊断转基因玉米事件AN1的存在。

其中一个检测方法为：利用PCR方法对两个AN1植株中的特异性边界序列进行检测，所用的PCR引物对分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11，PCR反应体系：

反应程序为：

94℃，5min；(94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec)×35循环；72℃，5min；4℃，5min。

取PCR产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，结果见图7。AN1转化事件中可以扩增得到预期的目标条带(分别为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7)。而且该PCR方法能够追踪转化事件的存在，从而应用于育种工作。

综上所述，本发明转基因玉米事件AN1对干旱和草铵膦除草剂具有较高的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件AN1的DNA分子。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种用于检测玉米植物AN1的核酸序列及其检测方法

<130> 1

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 1

cgtatgagcc ctgtggtgta aa 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 2

taaactatca gtgaccgcca cg 22

<210> 3

<211> 920

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 3

atggtacccg tgagtgccgg tcactgcgtg tggggccggc agtgtcccgc gcccacacgg 60

cagtggggga tctggttaca ccaacaccag gatgtgcaat gctgatcggt ctcaccattt 120

cacggacgta aaaataattc tcttgcaatg gctgctggta aaaatagatt atcctctgcc 180

aacagcagaa ttcaacagtg acagctgaat cgcagaagag tttgccaaag aaacaaaggg 240

ccctgtaggt gatgaacaaa atggagaaat gctgacgtct ttattgctgc tataggaggc 300

ggaaaaactg attcaggtac agaaacctgt cccggacgta ctagccagct ccgcacatgg 360

cgacggttgc acgtcgagtg cgctgccact gacggctcgg catctccacg gcccgatgga 420

gtcgctgcca atgccataga gcttcacgtt ggagaggcaa atgttactga agaccgagtc 480

cctgatgccc cgtatgagcc ctgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac 540

acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctggatt 600

ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat 660

acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc 720

ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga gtcaaatctc 780

ggtgacgggc aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc 840

cacgtcatgc cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata 900

tccgagcgcc tcgtgcatgc 920

<210> 4

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 4

cagctgttat tggtgacacc attggggacc ctctcaagga tacatctgga ccttcactta 60

acatcctgat caagctgatg gccgtggagt ctcttgtgtt tgctcctttc tttgctacac 120

atggtggctt actcttcaag atctaaagga tccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt 180

ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 240

tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 300

atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 360

aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcaagc ttggcactgg 420

ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 480

cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 540

cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg 600

tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgaccgccac gccgtcgacg acggggagca 660

ggctcgcgtt gtaggacgcg ccggggtggc ccccgacgtc gccggcgatc ctcaggccgt 720

agcgggcgcc gtccagggtc acctgggaga cggtgacgtt ccggatgaag ccgcccctgc 780

ccgagtttgt cttcacgtga accccgacgc ccacgccgga gaagctcagg tgctcggcca 840

cgacgtcctc cacgccgccc gaggtctcgc tcccgaccgc gaagccggcg aacgggcccg 900

acccggttat cctccggacc gtgatgccgg agcttgggcg gccgaaggcc acgccgtact 960

cgtcccaccc gctcttgatg gagatcaggt cgtcgccggc ggagatgtag cagtcctcga 1020

cgcacacgtt gctgcttgaa tctgcagggc ggagatgttg tttgtcagca cagcagagca 1080

ggaaggaatg ctcagctcag gtggtattgt 1110

<210> 5

<211> 7626

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 5

atggtacccg tgagtgccgg tcactgcgtg tggggccggc agtgtcccgc gcccacacgg 60

cagtggggga tctggttaca ccaacaccag gatgtgcaat gctgatcggt ctcaccattt 120

cacggacgta aaaataattc tcttgcaatg gctgctggta aaaatagatt atcctctgcc 180

aacagcagaa ttcaacagtg acagctgaat cgcagaagag tttgccaaag aaacaaaggg 240

ccctgtaggt gatgaacaaa atggagaaat gctgacgtct ttattgctgc tataggaggc 300

ggaaaaactg attcaggtac agaaacctgt cccggacgta ctagccagct ccgcacatgg 360

cgacggttgc acgtcgagtg cgctgccact gacggctcgg catctccacg gcccgatgga 420

gtcgctgcca atgccataga gcttcacgtt ggagaggcaa atgttactga agaccgagtc 480

cctgatgccc cgtatgagcc ctgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac 540

acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat taattcgggg gatctggatt 600

ttagtactgg attttggttt taggaattag aaattttatt gatagaagta ttttacaaat 660

acaaatacat actaagggtt tcttatatgc tcaacacatg agcgaaaccc tataggaacc 720

ctaattccct tatctgggaa ctactcacac attattatgg agaaactcga gtcaaatctc 780

ggtgacgggc aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc 840

cacgtcatgc cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata 900

tccgagcgcc tcgtgcatgc gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga cagcgaccac 960

gctcttgaag ccctgtgcct ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg tggagcccag 1020

tcccgtccgc tggtggcggg gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc agtcgtaggc 1080

gttgcgtgcc ttccaggggc ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt ccacctcggc 1140

gacgagccag ggatagcgct cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact cctgcggttc 1200

ctgcggctcg gtacggaagt tgaccgtgct tgtctcgatg tagtggttga cgatggtgca 1260

gaccgccggc atgtccgcct cggtggcacg gcggatgtcg gccgggcgtc gttctgggct 1320

catggtagac tcgagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc 1380

tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag gaagggtctt gcgaaggata gtgggattgt 1440

gcgtcatccc ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt 1500

ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg 1560

tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg 1620

ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg 1680

aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag 1740

actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat 1800

caatccactt gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg 1860

ggtgggggtc catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct 1920

ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag 1980

tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa 2040

gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga 2100

gtgtcgtgct ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2160

cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 2220

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 2280

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 2340

acagctatga catgattacg aattcgagct cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 2400

ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 2460

tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 2520

acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 2580

aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 2640

atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 2700

ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 2760

tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 2820

attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 2880

attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 2940

tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 3000

agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 3060

acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 3120

gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 3180

accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 3240

gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 3300

cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc 3360

cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 3420

tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 3480

cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 3540

cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 3600

cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 3660

caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 3720

gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 3780

acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 3840

aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 3900

tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 3960

ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 4020

tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 4080

atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 4140

atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 4200

aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 4260

agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 4320

tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttcc cgggatgggt gcagccattc 4380

tcccagatct cggaaccgag attttgatcc ctgtctgcgc tgtcattgga atcgccttcg 4440

ctctcttcca gtggttgctc gtctccaagg ttaagctttc tgctgcaaga gacgcttctc 4500

ccaacgccgc tggcaagaat ggctacaacg attacctcat cgaagaagag gagggcatca 4560

atgaccacaa cgttgttatg aaatgcgctg aaattcagaa cgccatttcc gaaggagcaa 4620

cctctttcct tttcactgag tataaatatg tgggaatctt catggtggct tttactgtct 4680

tgatattcct tttccttggc tctgtggaag gatttagcac aagccaccag ccttgtacct 4740

atgatcaaac taagatgtgt aagccagctc ttgccactgc tcttttcagc accatatcat 4800

tcctgctggg tggcatcaca tcagttattt ctggtttcct tggaatgaaa attgcaactt 4860

atgctaatgc aagaaccaca ctggaagcta gaaagggcgt cgggaaggct ttcattgttg 4920

catttagatc gggtgcagtt atgggatttc tccttgctgc aaacggtctt ttggttcttt 4980

acattaccat caacctgttc aagatttact atggtgatga ctggggtggt ctttttgagg 5040

ccatcactgg ttatggtctt ggtgggtctt ctatggcact gtttggaaga gttggtggag 5100

gtatctacac taaggctgct gatgtcggtg ctgatcttgt tggcaaggtt gaaaggaaca 5160

ttcctgagga tgatcctaga aatccagctg tgattgctga taatgttggt gataatgttg 5220

gggatatagc tggcatggga tctgatcttt ttggttcgta tgctgagtct tcctgtgccg 5280

ctctcgttgt tgcttccata tcttcttttg gagtgaatca tgagtttact gctatgttat 5340

tccctctcat catcagttct gtgggtatcc ttgtttgctt gcttaccacc ttatttgcaa 5400

ctgacttttt tgagatcaag gctgtaaagg aaattgagcc agcattgaaa aaacagctca 5460

ttatttccac cgtgttcatg actattgggg ttgctattgt cagttggatt gcactcccat 5520

cttccttcac tatcttcaac tttggagtgc agaaagttgt caagaactgg cagctattct 5580

tgtgtgtcgc tgttggtctc tgggcagggc ttattattgg atttgtaacg gagtactata 5640

ccagcaatgc atatagccct gtgcaagatg ttgcagactc ctgcaggacc ggtgctgcta 5700

ctaatgttat atttggcctt gcattgggat acaagtctgt cattattcca atttttgcca 5760

ttgcagttag tatttttgtt agtttcagct ttgctgctat gtatggtatt gctgttgctg 5820

cacttgggat gctgagtacc atagccactg gattggccat tgatgcatat ggtccaatca 5880

gtgacaacgc tggaggtatt gctgagatgg ctggaatgag tcacagaatt cgagagagaa 5940

ctgatgccct tgatgctgca ggaaacacga ctgctgctat tgggaaggga tttgccattg 6000

gttctgccgc ccttgtgtct ttggccctct ttggtgcctt tgtgagccga gctgctattt 6060

caacagttga tgtgctgact ccaaaggttt ttattggttt aatcgtgggt gcaatgcttc 6120

cttactggtt ttctgccatg accatgaaga gtgtaggaag tgctgctctg aagatggttg 6180

aggaagtacg taggcaattc aataccattc caggcttgat ggagggaact gctaagcctg 6240

actatgctac atgtgttaag atttctactg atgcttccat taaggaaatg gtaccacctg 6300

gtgctcttgt catgcttaca cccctcatcg ttgggatctt ttttggtgta gaaacacttt 6360

ctggtgtcct tgctggatct ctggtgtctg gtgtacagat tgctatctct gcatccaaca 6420

ctggtggtgc ttgggataat gccaagaagt acattgaggc tggtgcttct gagcatgcaa 6480

gaagccttgg tcccaaaggg tcagatcctc acaaggcagc tgttattggt gacaccattg 6540

gggaccctct caaggataca tctggacctt cacttaacat cctgatcaag ctgatggccg 6600

tggagtctct tgtgtttgct cctttctttg ctacacatgg tggcttactc ttcaagatct 6660

aaaggatccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 6720

ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 6780

atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 6840

atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 6900

gtgtcatcta tgttactaga tcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 6960

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 7020

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 7080

gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac 7140

tatcagtgac cgccacgccg tcgacgacgg ggagcaggct cgcgttgtag gacgcgccgg 7200

ggtggccccc gacgtcgccg gcgatcctca ggccgtagcg ggcgccgtcc agggtcacct 7260

gggagacggt gacgttccgg atgaagccgc ccctgcccga gtttgtcttc acgtgaaccc 7320

cgacgcccac gccggagaag ctcaggtgct cggccacgac gtcctccacg ccgcccgagg 7380

tctcgctccc gaccgcgaag ccggcgaacg ggcccgaccc ggttatcctc cggaccgtga 7440

tgccggagct tgggcggccg aaggccacgc cgtactcgtc ccacccgctc ttgatggaga 7500

tcaggtcgtc gccggcggag atgtagcagt cctcgacgca cacgttgctg cttgaatctg 7560

cagggcggag atgttgtttg tcagcacagc agagcaggaa ggaatgctca gctcaggtgg 7620

tattgt 7626

<210> 6

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 6

tactagccag ctccgcacat ggcgacggtt gcacgtcgag tgcgctgcca ctgacggctc 60

ggcatctcca cggcccgatg gagtcgctgc caatgccata gagcttcacg ttggagaggc 120

aaatgttact gaagaccgag tccctgatgc cccgtatgag ccctgtggtg taaacaaatt 180

gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga 240

attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta 300

ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca 360

tgagcgaaac cctatagg 378

<210> 7

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 7

atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg 60

atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gaccgccacg ccgtcgacga 120

cggggagcag gctcgcgttg taggacgcgc cggggtggcc cccgacgtcg ccggcgatcc 180

tcaggccgta gcgggcgccg tccagggtca cctgggagac ggtgacgttc cggatgaagc 240

cgcccctgcc cgagtttgtc ttcac 265

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 8

tactagccag ctccgcacat 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 9

cctatagggt ttcgctcatg tg 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 10

atcgcccttc ccaacagtt 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 11

gtgaagacaa actcgggcag 20

Claims (10)

1.一种核酸分子，其特征在于，包括如下任意一种：

i)包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示序列，或其反向互补序列；

ii)包含SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示序列，或其反向互补序列；

iii)包含SEQ ID NO:5所示序列，或其反向互补序列。

2.用于检测玉米转化事件的探针，其特征在于，包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列或其反向互补序列。

3.用于检测玉米转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含权利要求2所述的序列。

4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的序列；或者SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的序列。

5.用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含权利要求2所述的探针和/或权利要求3或权利要求4任一项所述的引物对。

6.检测玉米转化事件的方法，其特征在于，包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：

i)权利要求2所述的探针；

ii)权利要求3或权利要求4任一项所述的引物对；

iii)权利要求2所述的探针和权利要求3或权利要求4任一项所述的引物对；或者

iv)权利要求5所述的试剂盒或微阵列。

7.对玉米进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含权利要求1所述核酸分子的玉米；

2)将步骤1)所获得的玉米通过细胞培养、组织培养、自交或杂交得到种子、植物细胞、后代植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

对权利要求7所述的步骤2)所获得的后代植物进行干旱的抗性鉴定，并利用权利要求6所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

9.由权利要求7或权利要求8任一项所述的方法所获得的植物在制备制品中的应用，所述制品包括食品、饲料或工业原料。

10.一种保护玉米植物免受由干旱引起的损伤的方法，其特征在于，包括在缺水土壤中种植至少一种转基因玉米植物，所述转基因玉米植物在其基因组中依次包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5第581-6922位核酸序列和SEQ ID NO:2，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含SEQ ID NO:5；所述转基因玉米植物具有对干旱的耐受性。

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