CN108018369B - 玉米转化事件zm2-104的创制、检测与应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于植物生物技术领域，提供了命名为ZM2‑104的玉米转基因事件、及其检测和应用。提供了用于检测该转基因事件的引物对、引物对组合及方法。还提供了以包含该转基因事件的植物为供体而得到各种转基因新材料的方法及产生的后代及其制品。

Description

玉米转化事件ZM2-104的创制、检测与应用

技术领域

本申请涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种抗螟虫耐除草剂草铵膦转基因玉米转化事件的研制与检测方法。

背景技术

玉米螟俗称玉米钻心虫，其危害是造成玉米常年减产的重要生物灾害之一，严重影响玉米的产量和质量，包括亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。中国是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的多发区和重发区，几乎每两年就大规模发生一次。一般年份玉米受玉米螟危害减产10％-15％，大发生年减产可达30％以上，甚至绝收。因玉米螟的危害，每年损失的玉米就达600-900万吨。玉米螟不仅直接造成玉米产量损失，而且还诱发和加重玉米穗腐病的发生，使玉米的品质下降。

目前防治玉米螟的主要方式仍然以农药防治为主。农药的大量使用，既增加种植成本，又破坏生态环境。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)的杀虫晶体蛋白对包括玉米螟在内的不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目等)和无脊椎动物有特异毒杀作用。通过培育转基因Bt抗虫玉米，能够有效的防治玉米虫害，减少农药杀虫剂的使用，挽回产量损失，增加农业收入，减轻环境危害。

田间杂草与作物竞争水、肥、光能及生长空间，同时又是危害作物病菌及害虫的中间寄主，是作物增产重要的生物限制因子之一。我国常年受杂草严重危害的农作物面积高达12亿亩，其中玉米1.9亿亩。随着农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。当前，广泛采用的选择性除草剂施用量大，且残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点，但它们除草没有选择性，不能直接用于作物的生长期。通过转基因技术培育耐灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题，即在玉米生育期喷施1-2次就能解决所有杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。Méndez等(2011)研究发现，耐除草剂转基因玉米每公顷可节约除草成本102美元，而产量则提高了22％(抗虫和耐除草剂双价转基因)。通过转基因技术不但能够提高玉米对一些虫害的抗性和某种除草剂的耐性，同时还可以挽回产量损失，增加玉米单产并且降低生产成本。

植物转基因育种技术具有目的性强、周期短、效率高，能够实现不同物种间优良基因的转移等优点。自1996年第一个转基因作物商业化以来，这项技术已经为全球农业带来了巨大的改变。2014年全球转基因作物种植面积达到1.815亿公顷，是1996年种植面积的100多倍。在转化技术方面，基因枪和农杆菌介导法是转基因抗虫玉米研发应用的主要转化方法。农杆菌介导法操作简单，转化率较高，费用低，是目前应用最为广泛的转化方法。在基因选择方面，仍以防治鳞翅目玉米螟虫的cry1Ac、cry1F等基因为主，但已有多个具有鞘翅目抗性的品系如MON88017等，以及利用cry3类基因获得抗玉米根线虫品系如MON863等投入商业化生产。这说明抗虫基因选择逐渐拓宽了靶标昆虫的范围，加大了对基因抗虫谱的选择。随着基因改造技术的应用，利用密码子优化的转Bt基因抗虫玉米也进入了商业生产，如美国孟山都公司的MON810、MON89034等。世界范围内，1996年至今已有40余种转Bt基因抗虫玉米被26个国家批准投入商业化生产或饲料食品加工。

本技术领域人员公知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入的染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色体的结构或整合位点附近的转录调节元件的影响造成的。因此，通常需要生产数百个不同的转化事件，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优异转化事件，以达到商业化生产应用的目的。优异的转化事件通过常规育种方法即有性杂交的方式将外源基因转育到其它遗传背景的种质中，其后代保持了原始转化体的转基因表达特性。这种策略已广泛应用于具有一定生态适应性的优良品种中以达到增加优良性状的目的。

发明内容

本申请将苏云金杆菌(BT)抗玉米螟基因(cry1Ab/cry1AcZM)与除草剂草铵膦耐性基因(bar)通过农杆菌介导法转入到玉米优良自交系的基因组中，获得了一个抗虫耐除草剂玉米转化事件ZM2-104。

此外，建立对该转化事件进行特异性检测的方法十分重要。一方面，检测特定转化事件的存在是确定有性杂交的子代中是否含有目的基因的有效手段；另一方面，用于测定特定事件的方法将有助于遵守转基因安全管理条例，如要求源于转基因作物的商业化种植，加工品的销售等的许可和标识条例。通过本技术领域熟知的核酸检测方法，包括但不限于使用多核苷酸引物进行PCR扩增或使用核酸探针的DNA杂交来检测转基因的存在是可能的。一般而言，检测转基因植物的DNA引物序列和方法简单并且一致，检测目标序列常集中在频繁使用的基因表达元件，如启动子、终止子和标记基因。因此，用于区分相同的转化载体产生的不同转化事件需要获得独特的“侧翼DNA”的序列信息。对玉米转化事件进行特异性检测，能够更好的对转基因玉米事件、亲本、子代其制品进行监督管理。

在一方面，本申请提供了玉米转化事件ZM2-104的核酸分子，其选自：包含SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的核酸分子或其片段或其变体或其互补序列。

在另一方面，本申请提供了检测玉米转化事件ZM2-104的核酸分子的引物对、或引物对的组合，其选自：

引物对，其包括特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含其第1-255位核苷酸的序列的一条引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含其第256至7008位核苷酸的序列或者互补序列的另一条引物；和/或

引物对，其包括特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含其第256至7008位核苷酸的序列的一条引物和特异性识别SEQ ID NO:2所示序列中包含其7009-7272位核苷酸的序列或者互补序列的另一条引物。

在一实施方案中，上述引物对选自：

引物对(1)

SEQ ID NO:3(FW-csp2267):5’-TGCGTCCTAAATTGTCAGTT-3’，

SEQ ID NO:4(RV-csp2526):5’-ACTTAGACATGCAATGCTCA-3’；

引物对(2)

SEQ ID NO:3(FW-csp2267):5’-TGCGTCCTAAATTGTCAGTT-3’，

SEQ ID NO:14(RV-csp2344):5’-TATAGGGTTTCGCTCATGTG-3’；

引物对(3)

SEQ ID NO:7(FW-csp2529):5’-ACTGTTTCTTTTGTCGATGC-3’，

SEQ ID NO:10(RV-csp2424):5’-TCCCAAAAGCAACCAGTATT-3’；

和引物对(4)

SEQ ID NO:9(FW-csp2423):5’-GGCTAGTATCTACGACACAC-3’，

SEQ ID NO:10(RV-csp2424):5’-TCCCAAAAGCAACCAGTATT-3’。

在另一方面，本申请提供了用于鉴定生物样品中转化事件ZM2-104的方法，其包括使用上述的引物对、或引物对的组合。

在另一方面，本申请提供了用于检测玉米转化事件ZM2-104的试剂盒或微阵列，其包含上述的引物对、或引物对的组合。

在另一方面，本申请提供了上述的引物对、或引物对的组合或者上述的试剂盒或微阵列在检测玉米转化事件ZM2-104中的应用。

在另一方面，本申请提供了检测生物样品中转化事件ZM2-104或其后代的存在的方法，其包括：

提供生物样品，并从所述生物样品提取DNA；

提供前述的引物对、或引物对的组合；

利用上述引物对进行DNA扩增反应；和

检测所述DNA扩增反应产生的DNA扩增子分子，其中所述DNA扩增子分子的存在表明转化事件ZM2-104的存在，

其中所述转化事件ZM2-104是向植物中引入外源DNA从而在植物中产生SEQ IDNO:2序列的DNA。

在另一方面，本申请提供了分离的DNA分子，其包括通过上述方法产生的任一扩增子。

在另一方面，本申请提供了含有SEQ ID NO:2的转基因玉米在育种中的用途，任选地所述育种包括通过花粉培养、单倍体胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物。在另一方面，本申请提供了由上述用途产生的植物制成的制品，任选地所述制品为食品、饲料或工业原料。

在另一方面，本申请提供了转基因植物，其包含转化事件ZM2-104。

在另一方面，本申请提供了用含有转化事件ZM2-104的转基因玉米植株通过花粉培养、单倍体胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到的后代植物。

本申请所述的转化事件ZM2-104是指向植物中引入外源DNA从而在植物中产生SEQID NO:2序列的DNA。在SEQ ID NO:2序列中，第1-255位核苷酸和第7009-7272位核苷酸为玉米基因组序列中固有序列，第256-7008位核苷酸为外源插入物序列。

此外，本申请还提供了利用上述玉米转化事件进行害虫防治和杂草控制的方法。

附图说明

图1A为载体pZZ01194的结构示意图；图1B为载体pZZ01206的结构示意图；图1C为载体pZZ00015的结构示意图；图1D为载体pZHZH25018的结构示意图；其中

图2为草铵膦涂抹后耐性型(T)和敏感型(S)玉米叶片表现。

图3A为转化植株叶片抗亚洲玉米螟虫鉴定。R为抗虫；S为感虫；图3B为转化植株茎杆抗亚洲玉米螟虫鉴定。R为抗虫；S为感虫。

图4为Southern杂交图。第1和5泳道为阴性对照祥249；第9泳道为阳性对照；第2、3、4为与HindIII酶切DNA杂交结果；第6、7、8泳道为与NcoI酶切DNA杂交结果；M为分子量标记泳道，有碱基对数标出(kb)。333bp探针来自cry1Ab/cry1AcZM部分序列，阳性带分别为6kb(HindIII)和12.5kb(NcoI)，表明外源基因单位点单拷贝插入。

图5为pZHZH25018载体T-DNA插入玉米基因组示意图。左侧插入点位于第2号染色体15342865bp；右侧插入点位于第2号染色体15342925bp；通过4对引物扩增、克隆DNA片段和测序，验证了左侧翼引物对应区，插入序列区和右侧翼引物对应区。

图6A显示了左侧翼引物PCR阳性反应专一性。泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZM2-104DNA、其他相同载体不同转化事件DNA，只有ZM2-104基因组DNA泳道3有带清晰可见。

图6B显示了左侧翼引物PCR反应时模版DNA加样量，泳道1-6分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15ng；泳道2显示0.5ng模版时扩增子条带清晰可见。

图7A显示了右侧翼引物PCR阳性反应专一性。泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZM2-104DNA、其他相同载体转化事件DNA，只有ZM2-104基因组DNA泳道3有带清晰可见。

图7B显示了右侧翼引物PCR反应时模版DNA加样量，泳道1-6分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ng；泳道2显示0.1ng模版时扩增子条带清晰可见。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

本申请涉及的转化事件ZM2-104是指以玉米自交系祥249为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的玉米植株。在具体实例中，转基因所用表达载体具有SEQ ID NO:1所示序列，转基因后所得到的T-DNA插入物具有SEQ IDNO:2的第256-7008位核苷酸所示序列。转化事件ZM2-104可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体(SEQ ID NO:1)转化其他受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件ZM2-104还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

在本申请中，申请人获得了以SEQ ID NO:2的第1-255位核苷酸和第7009-7272位核苷酸为侧翼序列的T-DNA插入物(SEQ ID NO:2的第256-7008位核苷酸)。侧翼序列并非仅限于SEQ ID NO:2的第1-255位核苷酸和第7009-7272位核苷酸，因为列出的侧翼序列仅是用于表示T-DNA插入物在基因组中的位置，即左侧插入点位于第2号染色体15342865bp；右侧插入点位于第2号染色体15342925bp。因此本申请的侧翼序列可以根据基因组序列而向两侧延伸。

由于转化事件ZM2-104产生向基因组中特定位点插入的T-DNA插入物，因此其插入位点是特异性的，可以用于检测生物样品中是否包含转化事件ZM2-104。因此，能够特异性检测转化事件ZM2-104的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的引物对、探针、以及引物对和探针的组合均可用于检测本申请的转化事件ZM2-104。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写。

在一些实施方案中，可以对本申请的核酸片段进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本申请还涉及核酸片段的变体。一般来讲，特定核酸片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

如本文所用，“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸，其与靶多核苷酸的链是互补的。

如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件ZM2-104的鉴定和/或检测的目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件ZM2-104的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1.转基因玉米ZM2-104的获得与鉴定

转基因事件ZM2-104的获得与鉴定包括以下步骤：

(1)人工合成抗鳞翅目玉米螟虫基因DNA序列cry1Ab/cry1AcZM，构建含有抗虫基因和耐草铵膦筛选基因bar的转化载体pZHZH25018；

(2)将步骤(1)中的转化载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入到玉米自交系祥249中，获得转化苗并栽培到温室；

(3)将步骤(2)中的转化苗进行分子鉴定，选取低拷贝数(1-2)且不含有或含有较少载体DNA的T0代植株自交或测交并收获种子(T1代)；

(4)将步骤(3)中选定的转化苗，利用叶片局部涂抹法进行抗性鉴定，验证耐除草剂水平；

(5)将步骤(4)中的转化苗利用部分叶片进行抗玉米螟虫离体叶片鉴定，评估抗性表现和农艺性状表现；

(6)将步骤(3)中的T1代种子萌发，出苗20天后喷施除草剂选取抗性植株取样进行PCR分析，获得纯合的单拷贝插入转基因玉米株系，自交收获种子(T2代)；

(7)将步骤(6)中的T2代种子萌发，苗期再次进行耐除草剂草铵膦鉴定，系统地进行离体叶片、离体花丝抗玉米螟虫鉴定和大棚温室的活体抗螟虫鉴定，同时进行农艺性状评估；

(8)将步骤(7)中选定的T2代苗，抽提叶片基因组DNA进行southern杂交分析插入基因的拷贝数；

(9)将步骤(8)中选定的T2代苗，利用叶片DNA进行插入基因的侧翼序列分析，获得插入基因左边界和右边界侧翼序列的资料，设计合成引物，扩增插入序列与侧翼边界序列，确定转化事件发生的染色体位置。

下文将详述各步骤。

1-1.抗虫基因的设计与合成

本申请的基因以经过融合与改造的Cry1Ab和Cry1AcN端608个氨基酸序列为基础，并用植物偏爱的密码子置换编码序列。排除了DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点，然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在3’端加上终止密码子TAA，获得一个改造的DNA序列；确定并化学合成改造的Bt基因如序列SEQID NO:1。改造后的DNA序列编码的蛋白质含有3个功能区段，其中N端两个功能区高度同源于Cry1Ab对应部分，C端的功能区高度同源于Cry1Ac，因此本申请基因定名为cry1Ab/cry1AcZM。将该序列与郭三堆等人的序列(CN1037913C，1996)及孟山都转基因玉米事件Mon810的Cry1Ab进行了同源性比对(结果见表1)，并计算了GC含量(结果见表2)。

表1.Bt基因DNA序列同源性比较

序列名称	与cry1Ab/cry1AcZM的同源性
		CN1037913C	74.9％
Mon810	71.4％

表2.cry1Ab/cry1AcZM及近缘序列GC含量百分比

序列名称	GC比例％
		cry1Ab/cry1AcZM	58
CN1037913C	48
		Mon810	61

1-2.载体构建

根据在植物中表达基因功能的需要，进一步对cry1Ab/cry1AcZM基因编码区上下游进行了表达优化设计，以此提高基因在转录水平上的强度和蛋白质翻译的效率，包括在5’端增加了一段67个核苷酸的欧米茄(Ω)序列和3个核苷酸(acc)的Kozak序列用来增强真核基因的翻译效率，以及一段在3’端真核生物mRNA的poly(A)尾巴序列，以增加由胞核向胞质的运输及mRNA的稳定性和翻译效率。

在合成的cry1Ab/cry1AcZM的5’端添加HindIII和PstI酶切位点，3’端添加PmeI酶切位点，并将合成的序列克隆在Puc57simple载体上，命名为pZZ01194(图1A)。

pZHZH25018的构建：

利用限制内切酶HindIII+BamHI处理含有ubi启动子的载体pzz00002获得Ubi启动子片段，用T₄DNA聚合酶补平末端。利用限制内切酶PstI处理pZZ01194，用T₄DNA聚合酶补平末端，将Ubi启动子通过平末端连接方式连入，获得含有Ubi-cry1Ab/cry1AcZM片段的载体，命名为pZZ01201。

已有含有Tocs终止子(5’端有EcoRI酶切位点，3’端有PmeI，EcoRI位点)的载体，命名为pZZ01131，Tocs终止序列可通过EcoRI单酶切pZZ01131获得。

EcoRI处理pZZ01131获得Tocs终止子片段，用T₄DNA聚合酶补平产生的粘末端。

PmeI处理pZZ01201，将Tocs终止子通过平末端连接方式连入，获得含有Ubi-cry1Ab/cry1AcZM-Tocs片段的载体，命名为pZZ01206(见图1B)。

以载体pCambia3300(带有35s-BAR-T35spolyA元件)为骨架,通过HindIII+PmeI双酶切加入Ubi-EGFP-T35spolyA元件，获得载体pZZ00015(图1C)。

HindIII+PmeI处理pZZ01206载体，获得Ubi-cry1Ab/cry1AcZM-Tocs片段。

HindIII+PmeI处理pZZ00015载体，切口处连入Ubi-Cry1Ab/Cry1AcZM-Tocs，获得含有Ubi-cry1Ab/cry1AcZM-Tocs和35s-BAR-T35spolyA两个表达元件的表达载体命名为pZHZH25018(图1D)，其序列如SEQ ID NO:1所示。

1-3.玉米的遗传转化

将载体pZHZH25018的质粒DNA通过电击法转化到农杆菌EHA105中，鉴定后备用。玉米自交系祥249自交后取长度1.5mm左右的幼胚用于转化。收集约200个果穗的幼胚为一批次，置于EP管中把悬浮液吸出，加入含有200μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液，共培养5分钟，然后把幼胚转移到共培养基上，暗培养三天。将暗培养后的幼胚放置愈伤诱导培养基上，待有愈伤组织长出后，放置含5mg/L双丙氨膦的筛选培养基上，筛选培养，每两周继代一次。当抗性愈伤长出时，挑选出状态良好的胚性愈伤转到分化培养基上，培养条件为26℃，每日3000Lux光强，光照16小时，两周后出现再生小苗。将再生的小植株移到生根培养基中，待小苗长出二级次根后，移栽于混有营养土和蛭石(1：3)的小盆中。同时取叶片样品提取DNA，PCR测定确定阳性株，然后移栽至大花盆中，得到T0代植株。对T0代植株进行自交或者杂交获得T1代种子。

1-4.T0及后代的分析与鉴定

将T1代种子播种于温室大棚中，得到T1代植株。对其进行抗虫鉴定，耐除草剂分析，农艺性状分析，自交授粉后获得T2代种子。将T2代种子播种于温室大棚中，得到T2代植株。对其进行抗虫鉴定，耐除草剂分析，农艺性状分析和分子特征分析，自交授粉后获得T3代种子。将T3代种子播种于温室大棚中，得到T3代植株。对其进行抗虫鉴定，耐除草剂分析，农艺性状分析和分子特征分析，自交授粉后获得T4代种子。

根据转化事件的抗虫和耐除草剂特性及农艺性状表现优异程度逐代升级，由T1升级到T3，之后进入中间试验。

(A)耐除草剂性状鉴定

除草剂耐性鉴定：将T0代阳性植株经过自交或者测交得到的种子播种于大棚温室，对6-8叶片期T1代植株进行除草剂抗性鉴定，去除不含抗性基因的植株。由于cry1Ab/cry1AcZM基因与耐草铵膦基因同在T-DNA左右边界序列内，同时被转化到受体玉米中。T0代和T1代自交的情况下，T2代株系植株群体除草剂抗性分离比例是判断基因纯合的依据之一。

喷施所用除草剂保试达为拜耳作物科学(中国)有限公司生产，有效成分为18％草铵膦可溶液剂。草铵膦耐受性鉴定浓度的确定：该除草剂的推荐用量为150-300ml/亩(兑水30-40公斤)，即稀释100-267倍，因此本申请采用100倍稀释的保试达溶液涂抹具有转化事件玉米的心叶期(6～8片完全展开叶)的倒二叶(剪去叶尖作为考察标记)。4-5天后观察并记录除草剂耐性表现(图2)。结果表明，本实验得到了一批叶片高耐草铵磷的T0代玉米及其后代。

(B)转基因玉米植株抗螟虫生测

采用心叶期活体接虫法利用亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)对T1、T2和T3植株抗螟虫性在田间进行了生测实验。

在玉米植株生长发育至心叶中期(7叶片期)进行接虫，每个植株接虫10-20只。将黑头期卵约60粒放入离心管中，用脱脂棉塞住管口。将离心管放入28℃、湿度80％的培养箱中，或置于室温条件下盖上湿毛巾保湿，待卵块孵化后将脱脂棉拔掉，投放入心叶丛中。接虫2-3周后逐株调查植株心叶的被害程度，根据被害叶片上的虫孔大小和多少划分受害等级，称为食叶级别。目前国际上大多采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准(表3)。逐株调查食叶级别，以各株平均值作为供鉴定品系的食叶级别，在收获前调查蛀孔，并根据表3的评价标准确定其抗螟性级别。

表3.玉米抗螟虫性田间鉴定评价标准

注：*。直径超过2.5cm的蛀茎隧道数与茎杆上的可见孔数之和计为每株孔数。

**HR：高抗；R：抗；MR：中抗；S：感；HS：高感

本申请选定的转化事件对亚洲玉米螟虫叶片平均食叶级别达到1.1-1.4，为高抗级别，见图3A、图3B和表4。

表4.转化体不同世代螟虫食叶级别生测结果

转化事件号	世代	平均食叶级别	标准差
				ZM2-104	T1	1.4*	0.5
ZM2-104	T2	1.1*	0.4
				ZM2-104	T3	1.2*	0.3
Cry1Ab-11	阳性对照	1.2*	0.15
				祥249	阴性对照	6.1	1.1

备注：1、调查株数n＝10；“*”代表与阴性对照相比差异显著。

2、本事件转化体系统编号(T3：M1433T300122；T2：M1423T200104；T0：M00896A018b)。

1-5.转基因事件的DNA分子鉴定

(A)PCR检测

采用天根生化技术公司的DNA提取试剂盒抽提T0代转基因玉米基因组DNA。

将下列试剂从-20度冰箱中取出解冻：10倍PCR缓冲液(Takara)、脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)、包扩正向引物SEQ ID NO:12(CSP759)：5’-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’；和反向引物SEQ ID NO:13(CSP760)：5’-GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’)以及玉米叶片DNA模板。所有试剂解冻完毕后，简短离心数秒，置于冰上待用。配制PCR反应体系的混合液，混匀，简短离心数秒。PCR反应体系(20μl)：2μl 10倍PCR缓冲液(Takara)，0.5μl脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)，0.8μl正反向引物混合物(5μM)，0.2μl r-Taq(5U，Takara)，1μl玉米叶片DNA模板，其余为dd H₂O。将混合液分装至200μl规格的PCR管中，再加入1μl模板DNA，对于不同样品分别做好标记以便区分。将PCR反应管放入Thermo 9700型PCR扩增仪，选择预设PCR扩增程序，开始运行反应。PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；30个循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分钟。

PCR结束后，取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1.5％的琼脂糖凝胶，150V电泳25分钟后在溴化乙啶(EB)中染色10分钟，在紫外凝胶成像系统中拍照。cry1Ab/cry1AcZM基因为转化载体所特有，因此能扩增出该基因特异条带的转基因植株即为阳性植株，否则即为阴性材料。

(B)Southern印迹鉴定

以pZHZH25018质粒DNA为模板制备探针。以SEQ ID NO:12(CSP759)：CACGCAGATTCCAGCGGTCAA和SEQ ID NO:13(CSP760)：GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA为引物，采用罗氏公司PCR地高辛探针合成试剂盒(货号：11636090910)合成用于cry1Ab/cry1AcZM的探针，探针大小为333bp(探针序列见SEQ ID NO:11)。扩增体系包含：DNA模板5μL(50pg)，CSP759引物0.5μL，CSP760引物0.5μL，PCR DIG混合物5μL，DNA聚合酶0.75μL，PCR缓冲液(10倍)5μL，ddH₂O33.25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；35个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7分钟。待PCR扩增完毕，产物于12℃保存，以1％凝胶检测标记效果。扩增产物即为具有上文所列序列的探针。

提取转基因玉米T1、T2或者T3代材料的叶片基因组总DNA，获得的DNA沉淀干燥后溶于无离子水，测定浓度后备用。

进行样品酶切及酶切片段回收，200μL酶切体系中含有20μg玉米基因组DNA、20μl限制性内切酶(HindIII或NcoI)、20μl 10倍缓冲液，加ddH₂O补齐至200μl。酶切16h后取20μl进行电泳检测，检测酶切效果是否彻底。酶切产物加ddH₂O补齐至400μl，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH5.2)，加入4μl的Dr.GenTLE Precipitation Carrier，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，12,000rpm 4℃离心15分钟。将沉淀用50μl ddH₂O溶解，加5μl 6倍上样缓冲液。

将DNA通过0.8％凝胶，20V电泳16h。切掉多余泳道及点样孔，剩余凝胶用变性溶液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。再用中和缓冲液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。超纯水清洗一次。20倍SSC处理10分钟，用whatman系统进行转膜4小时以上。

转膜结束后，将膜放置在用10倍SSC浸润的Whatman 3MM滤纸上，紫外交联仪交联3-5分钟。用ddH₂O简单洗膜，于空气中干燥。杂交及显影过程均按照罗氏地高辛检测试剂盒I(货号：11745832910)的操作手册进行。

本实验检测外源基因整合到玉米基因组的拷贝数以及转化事件的异同。通过HindIII和NcoI内切酶分别切割基因组DNA，得到了整合到玉米基因组拷贝数的结果(见图4)。图4示出了本转化事件T2代株系玉米基因组DNA分别由HindIII和NcoI酶切与cry1Ab/cry1AcZM特异探针分子杂交结果，探针长度333bp。1和5泳道为阴性对照祥249；9泳道为阳性对照；2、3、4为与HindIII酶切DNA杂交结果；6、7、8泳道为与NcoI酶切DNA杂交结果；M为分子量标记泳道，有碱基对数标出(kb)。两种酶切条件下分别显示一条阳性带，分别为6kb(HindIII)和12.5kb(NcoI)，表明外源基因单拷贝插入，为单拷贝转化事件。

(C)插入序列的大小和结构

本申请外源基因单拷贝插入序列包括左右边界序列的载体大小为6812bp。通过分段PCR扩增外源DNA测序的方法，确定转化事件插入序列实际大小为6753bp(SEQ ID NO:2的256-7008)，T-DNA插入物相对于表达载体SEQ ID NO:1左端缺失15bp，右端缺失44bp(见SEQID NO:1中的核苷酸1-15和6769-6812)。上述59bp核苷酸位于非编码区的边界序列。其缺失不影响抗虫基因cry1Ab/cry1AcZM和筛选标记bar基因的完整性。分段克隆插入DNA，序列分析比对表明，6753bp的核苷酸序列与载体T-DNA序列有一个核苷酸的差别，A突变为G，该碱基位于cry1ab基因编码区间内，所编码的氨基酸由天冬酰胺(AAC)变成丝氨酸(AGC)，但二者都是亲水性氨基酸。

实施例2玉米转化事件的DNA分子检测

2-1左侧翼序列分析

取待测转化事件植株叶片提取总DNA(T2代或者T3代生长健壮的转基因植株)，利用接头PCR方法进行插入玉米基因组的外源基因侧翼序列扩增、克隆、测序，得到序列结果。

(1)人工合成接头PCR所需引物，稀释后备用；引物序列如表5所示。

表5.引物序列

(2)制备高质量玉米基因组DNA，稀释后备用；

(3)用ddH₂O将接头引物AD-L和AD-S分别稀释到100μmol/L，等体积混合，94℃水浴变性4min，自然冷却至室温后即为50μmol/L的接头；

(4)酶切玉米基因组DNA，酶切体系如下：

37℃酶切3h。

(5)连接接头，连接体系如下：

16℃过夜连接。

(6)以步骤(5)中的基因组DNA酶切-接头连接产物作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下表。反应程序为：94℃，5min；7个循环：94℃30sec，72℃3min；32个循环：94℃30sec；67℃3min；67℃7min；25℃10min。

表6.第一轮PCR反应体系

组分	体积(μL)
		10×PCR Buffer	2
dNTP(10mmol/L)	0.4
		Bar-86(10μM)	0.5
SP1(10μM)	0.5
		rTaq(5U/μl)	0.3
基因组DNA	2
		ddH<sub>2</sub>O	至终体积20μL

(7)以第一轮PCR产物(混合液稀释40倍)为模板进行第二轮PCR扩增。

表7.第二轮PCR反应体系

组分	体积(μL)
		10×PCR Buffer	2
dNTP(10mmol/L)	0.4
		Bar-22(10μM)	0.5
SP2(10μM)	0.5
		rTaq(5U/μl)	0.3
上轮PCR产物(稀释40倍)	2
		ddH<sub>2</sub>O	至终体积20μL

反应程序为：94℃，5min；5个循环：94℃30sec，72℃3min；30个循环：94℃30sec，67℃3min；67℃7min；25℃10min。

(8)取第二轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收300bp-2kb之间的DNA片段；

(9)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接；

(10)转化(9)的连接产物；

(11)用M13F和M13R引物扩增(10)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇床培养菌液，利用TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit快速质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒DNA；

(12)用测序引物对(11)中的质粒DNA进行测序，利用

Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit对质粒DNA进行测序PCR。测序引物为M13F和M13R引物；M13-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’；

(13)用NaAc和无水乙醇纯化、甲酰胺变性(12)中的PCR产物

(14)将(13)中纯化变性好的PCR产物利用ABI DNA测序仪3730开机测序并读出测序结果。

(15)测序结果在PlantGDB数据库中用BLASTN工具与玉米基因组序列进行同源搜索，以最好的匹配结果为插入位点的染色体号和碱基对位置号，通常序列一致性为90-100％。

通过本实验检测出插入T-DNA左侧翼序列255bp，见序列SEQ ID NO:2的核苷酸1-255。以玉米B73全基因组序列为参考(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)，分析比较确定本申请转化事件左侧插入点位于第2号染色体15342865bp，参见图5。

2-2右侧翼序列分析

本申请中根据左侧的序列结果，参考玉米B73全基因组序列(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)设计引物再结合插入基因序列引物进行PCR得到了外源基因右侧翼序列扩增片段，克隆后测序，得到右侧翼序列结果。

根据所得到的序列所在玉米基因组染色体位置，利用PCR克隆了DNA片段，验证了序列准确性，见序列SEQ ID NO:2的核苷酸7009-7272。

以玉米B73全基因组序列为参考，分析比较确定本申请转化事件右侧插入点位于第2号染色体15342925bp，参见图5。

经过序列分析表明，外源T-DNA插入到受体基因组后，外源T-DNA左、右边界分别发生了15bp和44bp的缺失，即，SEQ ID NO:2中T-DNA插入物(核苷酸256-7008)与SEQ ID NO:1相比左右末端分别缺少15bp和44bp。进一步的分析表明，该DNA片段的缺失不影响抗虫基因cry1Ab/cry1AcZM和筛选标记bar基因的完整性。

此外，插入位点处的玉米基因组缺失(即，Chr2:15342865-Chr2:15342925)，没有破坏任何已知的玉米内源功能基因。

实施例3.转基因玉米ZM2-104的侧翼DNA序列检测方法

3-1左侧翼DNA序列检测：利用玉米转化事件的左侧翼基因组序列和外源片段中的35S polyA终止子的序列设计了一对引物(FW-csp2267和RV-csp2344)，建立该转化事件产品的定性PCR鉴定方法。依据ZM2-104转化事件外源DNA片段整合位点LBT-DNA 5’端设计的引物为：

SEQ ID NO:3(FW-csp2267):5’-TGCGTCCTAAATTGTCAGTT-3’(玉米基因组区)，

SEQ ID NO:14(RV-csp2344):5’-TATAGGGTTTCGCTCATGTG-3’(35s PolyA区域)；

上述特异引物在55-65℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用61℃为最佳扩增温度；PCR反应程序为95℃5min；35个循环：94℃30s，55-65℃30s，72℃1min；72℃7min。

为测试上述引物(FW-csp2267；RV-csp2344)特异扩增本转化事件特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。PCR反应条件和程序为95℃5min，35个循环：94℃30s，61℃30s，72℃1min；72℃7min。结果表明只有本转化事件DNA能够有阳性结果，其他转化事件或者阴性对照玉米品种均为阴性结果(见图6A)。扩增的DNA片段大小466bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

为测试本转化事件玉米总DNA最低用量，上述特异引物在最佳扩增温度61℃条件下，利用不同模版DNA加样量扩增出目的片段。PCR反应条件与程序为95℃5min；35个循环：94℃30s，61℃30s，72℃1min；72℃7min。结果表明，玉米基因组模版DNA最低用量为0.5ng(见图6B)。扩增的DNA片段大小与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

利用引物SEQ ID NO:3(FW-csp2267)和SEQ ID NO:4(RV-csp2526)也可以扩增出本转化事件外源DNA片段整合位点T-DNA左侧翼玉米基因组序列和载体序列。PCR反应条件与程序为95℃5min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃3min；72℃7min。扩增的DNA片段大小2244bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。可以用来确认本转化事件。

3-2右侧翼DNA序列检测：利用玉米转化事件的外源片段中的T-ocs终止子的序列和右侧翼基因组序列设计了一对引物(FW-csp2423和RV-csp2424)，建立该转化事件的定性PCR鉴定方法。依据ZM2-104转化事件外源DNA片段整合位点RBT-DNA 5’端设计的引物为：

SEQ ID NO:9(FW-csp2423):5’-GGCTAGTATCTACGACACAC-3’(T-ocs区域)；

SEQ ID NO:10(RV-csp2424):5’-TCCCAAAAGCAACCAGTATT-3’(玉米基因组区)。

上述特异引物在55-65℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用59℃为最佳扩增温度(见图)；PCR反应程序为95℃5min；35个循环：94℃30s，55-65℃30s，72℃1min；72℃7min。

为测试上述引物(FW-csp2423；RV-csp2424)特异扩增本转化事件特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。PCR反应条件和程序为95℃5min；35个循环：94℃30s，59℃30s，72℃1min循环；72℃7min。结果表明只有本转化事件DNA能够有阳性结果，其他转化事件或者阴性对照玉米品种均为阴性结果(见图7A)。扩增的DNA片段大小605bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

为测试本转化事件玉米总DNA最低用量，上述特异引物在最佳扩增温度59℃条件下，PCR反应条件与程序为95℃5min；35个循环：94℃30s，59℃30s，72℃1min；72℃7min。扩增出目的片段的玉米基因组模版DNA最低剂量为0.1ng(见图7B)。扩增的DNA片段大小与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

利用引物SEQ ID NO:7(FW-csp2529)和SEQ ID NO:10(RV-csp2424)也可以扩增出本转化事件外源DNA片段整合位点T-DNA右侧翼玉米基因组序列和载体序列。PCR反应条件与程序为95℃5min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃3min；72℃7min。扩增的DNA片段大小3150bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。可以用来确认本转化事件。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修改，这些改进和修改也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 玉米转化事件ZM2-104的创制、检测与应用

<130> 15C11923CN

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6812

<212> DNA

<213> pZHZH25018载体序列

<400> 1

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagtcaaatc tcggtgacgg 300

gcaggaccgg acggggcggt accggcaggc tgaagtccag ctgccagaaa cccacgtcat 360

gccagttccc gtgcttgaag ccggccgccc gcagcatgcc gcggggggca tatccgagcg 420

cctcgtgcat gcgcacgctc gggtcgttgg gcagcccgat gacagcgacc acgctcttga 480

agccctgtgc ctccagggac ttcagcaggt gggtgtagag cgtggagccc agtcccgtcc 540

gctggtggcg gggggagacg tacacggtcg actcggccgt ccagtcgtag gcgttgcgtg 600

ccttccaggg gcccgcgtag gcgatgccgg cgacctcgcc gtccacctcg gcgacgagcc 660

agggatagcg ctcccgcaga cggacgaggt cgtccgtcca ctcctgcggt tcctgcggct 720

cggtacggaa gttgaccgtg cttgtctcga tgtagtggtt gacgatggtg cagaccgccg 780

gcatgtccgc ctcggtggca cggcggatgt cggccgggcg tcgttctggg ctcatggtag 840

actcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg 900

aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 960

ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 1020

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 1080

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 1140

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 1200

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 1260

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt 1320

gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 1380

catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 1440

gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag 1500

ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag 1560

ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 1620

ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 1680

gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 1740

cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 1800

ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 1860

catgattacg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc 1920

aagcttatcc agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 1980

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 2040

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 2100

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 2160

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 2220

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 2280

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 2340

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 2400

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 2460

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 2520

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 2580

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 2640

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 2700

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 2760

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 2820

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 2880

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 2940

cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 3000

gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 3060

gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 3120

tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 3180

tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 3240

tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 3300

tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt 3360

tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga 3420

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata 3480

tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca 3540

ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg 3600

aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg 3660

atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat 3720

gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt 3780

tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg 3840

atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat 3900

gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcg tatttttaca 3960

acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac aattacaacc 4020

atggattgcc ggccctacaa ctgcctgtcg aaccctgagg tggaggtcct gggcggcgag 4080

cggattgaga ctggctacac accgattgac atctcactct ccctgaccca gttcctcctg 4140

tcggagttcg tgccaggcgc tgggttcgtt ctcggcctgg tggatatcat ttggggcatc 4200

ttcgggccaa gccagtggga cgctttcctg gtccagatcg agcagctcat taatcagagg 4260

atcgaggagt tcgcgcggaa ccaggctatt agccgcctcg agggcctgtc gaacctctac 4320

cagatctacg ccgagagctt cagggagtgg gaggctgatc cgacgaaccc cgccctgagg 4380

gaggagatgc ggattcagtt caatgacatg aactccgctc tgaccacggc tatcccactc 4440

ttcgcggtgc agaattacca ggtcccactc ctgagcgtct acgtgcaggc tgcgaacctc 4500

cacctgtctg tgctgcgcga tgtttcagtg ttcggccaga cctgggggtt cgacgctgct 4560

acgattaatt ccaggtacaa cgatctgaca cggctcatcg gcaattacac tgaccatgcc 4620

gttcggtggt acaacaccgg cctcgagagg gtgtgggggc cagactccag ggattggatt 4680

aggtacaacc agttccgcag ggagctcaca ctgactgtcc tggacatcgt ttccctcttc 4740

ccaaactacg atagccggac ctaccctatt cgcacggtgt cccagctgac aagggagatc 4800

tacactaatc cagtcctcga gaacttcgac ggctctttcc gcgggtcagc tcagggcatt 4860

gaggggtcca tcaggagccc tcacctgatg gatatcctca actcaatcac catctacacg 4920

gacgctcacc gcggcgagta ctactggtcc gggcatcaga tcatggcttc cccagtcggc 4980

ttcagcgggc cagagttcac cttcccactg tacggcacga tggggaacgc tgctccacag 5040

cagaggatcg ttgctcagct cggccagggg gtgtaccgca cactgtccag cactctctac 5100

cggcgcccgt tcaacatcgg cattaacaat cagcagctga gcgtgctcga cggcacagag 5160

ttcgcctacg ggacttcgtc taacctgccc tcggcggtct acaggaagtc gggcaccgtt 5220

gactctctcg atgagatccc gccccagaac aataacgtcc cacctcgcca gggcttctcg 5280

cacaggctgt cgcatgtttc tatgttccgg tcaggcttct ccaactcatc cgtctccatc 5340

attagggccc cgatgttctc atggatccac cggtccgcgg agttcaataa catcattgct 5400

agcgattcga tcacgcagat tccagcggtc aagggcaatt tcctcttcaa cgggagcgtt 5460

atctcgggcc ctgggttcac aggcggggac ctggtgaggc tcaatagctc gggcaataac 5520

atccagaaca ggcggtacat tgaggtccca atccacttcc cttctacctc aacgcgctac 5580

agggtccggg ttcgctacgc gtccgtgaca ccaattcatc tgaatgtcaa ctggggcaat 5640

tcttcaatct tctcgaacac tgtgcctgcc acagcgactt ctctggacaa tctccagtcc 5700

agcgatttcg gctacttcga gtctgctaac gccttcacct cgtctctcgg caatatcgtg 5760

ggggtccgca acttcagcgg cacggctggc gttattattg ataggttcga gttcatccct 5820

gttactgcta ccctggaggc tgagtaagta ggtgaggaat tctttgagta ttatggcatt 5880

ggaaaagcca ttgttctgct tgtaatttac tgtgttcttt cagtttttgt tttcggacat 5940

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt taacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt 6000

ttaattcgat tatcctcgag ccctagtgtc ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat 6060

gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt 6120

agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc 6180

gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact acttatatgt 6240

acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac atctatgata 6300

gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt attattacaa atccaatttt aaaaaaagcg 6360

gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt acataaatct tattcaaatt tcaaaagtgc 6420

cccaggggct agtatctacg acacaccgag cggcgaacta ataacgctca ctgaagggaa 6480

ctccggttcc ccgccggcgc gcatgggtga gattccttga agttgagtat tggccgtccg 6540

ctctaccgaa agttacgggc accattcaac ccggtccagc acggcggccg ggtaaccgac 6600

ttgctgcccc gagaattatg cagcattttt ttggtgtatg tgggccccaa atgaagtgca 6660

ggtcaaacct tgacagtgac gacaaatcgt tgggcgggtc cagggcgaat tttgcgacaa 6720

catgtcgagg ctcagcagga cctgcaggcg tttaaactat cagtgtttga caggatatat 6780

tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt ta 6812

<210> 2

<211> 7272

<212> DNA

<213> ZM2-104事件序列

<400> 2

tgcgtcctaa attgtcagtt acataattcg agctattgct ttcctcgttc tcccttcttc 60

ctttttttta ccttgattgg gtgaggagtg atgagtttgc catgatctgg taaaaatcct 120

tcctagctgt agcgactcat aattcttata actgctcata gtagtatatg gaaaagagta 180

agttatatcg caatctcctc ctaattttgt gtggcatgtt ggtagaagaa gataacattc 240

tctctgattc attcatggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 300

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 360

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 420

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 480

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagtcaaatc tcggtgacgg 540

gcaggaccgg acggggcggt accggcaggc tgaagtccag ctgccagaaa cccacgtcat 600

gccagttccc gtgcttgaag ccggccgccc gcagcatgcc gcggggggca tatccgagcg 660

cctcgtgcat gcgcacgctc gggtcgttgg gcagcccgat gacagcgacc acgctcttga 720

agccctgtgc ctccagggac ttcagcaggt gggtgtagag cgtggagccc agtcccgtcc 780

gctggtggcg gggggagacg tacacggtcg actcggccgt ccagtcgtag gcgttgcgtg 840

ccttccaggg gcccgcgtag gcgatgccgg cgacctcgcc gtccacctcg gcgacgagcc 900

agggatagcg ctcccgcaga cggacgaggt cgtccgtcca ctcctgcggt tcctgcggct 960

cggtacggaa gttgaccgtg cttgtctcga tgtagtggtt gacgatggtg cagaccgccg 1020

gcatgtccgc ctcggtggca cggcggatgt cggccgggcg tcgttctggg ctcatggtag 1080

actcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg 1140

aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 1200

ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 1260

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 1320

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 1380

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 1440

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 1500

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt 1560

gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 1620

catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 1680

gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag 1740

ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag 1800

ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 1860

ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 1920

gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 1980

cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 2040

ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 2100

catgattacg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc 2160

aagcttatcc agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 2220

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 2280

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 2340

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 2400

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 2460

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 2520

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 2580

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 2640

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 2700

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 2760

cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 2820

cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 2880

agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 2940

gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct 3000

acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata 3060

gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca 3120

accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct 3180

cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 3240

gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 3300

gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt 3360

tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat 3420

tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg 3480

tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg 3540

tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt 3600

tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga 3660

tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata 3720

tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca 3780

ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg 3840

aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg 3900

atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat 3960

gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt 4020

tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg 4080

atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat 4140

gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcg tatttttaca 4200

acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac aattacaacc 4260

atggattgcc ggccctacaa ctgcctgtcg aaccctgagg tggaggtcct gggcggcgag 4320

cggattgaga ctggctacac accgattgac atctcactct ccctgaccca gttcctcctg 4380

tcggagttcg tgccaggcgc tgggttcgtt ctcggcctgg tggatatcat ttggggcatc 4440

ttcgggccaa gccagtggga cgctttcctg gtccagatcg agcagctcat taatcagagg 4500

atcgaggagt tcgcgcggaa ccaggctatt agccgcctcg agggcctgtc gaacctctac 4560

cagatctacg ccgagagctt cagggagtgg gaggctgatc cgacgaaccc cgccctgagg 4620

gaggagatgc ggattcagtt caatgacatg aactccgctc tgaccacggc tatcccactc 4680

ttcgcggtgc agaattacca ggtcccactc ctgagcgtct acgtgcaggc tgcgaacctc 4740

cacctgtctg tgctgcgcga tgtttcagtg ttcggccaga cctgggggtt cgacgctgct 4800

acgattaatt ccaggtacaa cgatctgaca cggctcatcg gcaattacac tgaccatgcc 4860

gttcggtggt acaacaccgg cctcgagagg gtgtgggggc cagactccag ggattggatt 4920

aggtacaacc agttccgcag ggagctcaca ctgactgtcc tggacatcgt ttccctcttc 4980

ccaaactacg atagccggac ctaccctatt cgcacggtgt cccagctgac aagggagatc 5040

tacactaatc cagtcctcga gaacttcgac ggctctttcc gcgggtcagc tcagggcatt 5100

gaggggtcca tcaggagccc tcacctgatg gatatcctca actcaatcac catctacacg 5160

gacgctcacc gcggcgagta ctactggtcc gggcatcaga tcatggcttc cccagtcggc 5220

ttcagcgggc cagagttcac cttcccactg tacggcacga tggggagcgc tgctccacag 5280

cagaggatcg ttgctcagct cggccagggg gtgtaccgca cactgtccag cactctctac 5340

cggcgcccgt tcaacatcgg cattaacaat cagcagctga gcgtgctcga cggcacagag 5400

ttcgcctacg ggacttcgtc taacctgccc tcggcggtct acaggaagtc gggcaccgtt 5460

gactctctcg atgagatccc gccccagaac aataacgtcc cacctcgcca gggcttctcg 5520

cacaggctgt cgcatgtttc tatgttccgg tcaggcttct ccaactcatc cgtctccatc 5580

attagggccc cgatgttctc atggatccac cggtccgcgg agttcaataa catcattgct 5640

agcgattcga tcacgcagat tccagcggtc aagggcaatt tcctcttcaa cgggagcgtt 5700

atctcgggcc ctgggttcac aggcggggac ctggtgaggc tcaatagctc gggcaataac 5760

atccagaaca ggcggtacat tgaggtccca atccacttcc cttctacctc aacgcgctac 5820

agggtccggg ttcgctacgc gtccgtgaca ccaattcatc tgaatgtcaa ctggggcaat 5880

tcttcaatct tctcgaacac tgtgcctgcc acagcgactt ctctggacaa tctccagtcc 5940

agcgatttcg gctacttcga gtctgctaac gccttcacct cgtctctcgg caatatcgtg 6000

ggggtccgca acttcagcgg cacggctggc gttattattg ataggttcga gttcatccct 6060

gttactgcta ccctggaggc tgagtaagta ggtgaggaat tctttgagta ttatggcatt 6120

ggaaaagcca ttgttctgct tgtaatttac tgtgttcttt cagtttttgt tttcggacat 6180

caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt taacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt 6240

ttaattcgat tatcctcgag ccctagtgtc ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat 6300

gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt 6360

agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc 6420

gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa tttactgatt gtaccctact acttatatgt 6480

acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg ctgaataggt ttatagcgac atctatgata 6540

gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt attattacaa atccaatttt aaaaaaagcg 6600

gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt acataaatct tattcaaatt tcaaaagtgc 6660

cccaggggct agtatctacg acacaccgag cggcgaacta ataacgctca ctgaagggaa 6720

ctccggttcc ccgccggcgc gcatgggtga gattccttga agttgagtat tggccgtccg 6780

ctctaccgaa agttacgggc accattcaac ccggtccagc acggcggccg ggtaaccgac 6840

ttgctgcccc gagaattatg cagcattttt ttggtgtatg tgggccccaa atgaagtgca 6900

ggtcaaacct tgacagtgac gacaaatcgt tgggcgggtc cagggcgaat tttgcgacaa 6960

catgtcgagg ctcagcagga cctgcaggcg tttaaactat cagtgtttaa actagtgggc 7020

gcgaatggcg cacctgggcc cgaccccgac ccctttcctg tcgattaata tttgtttgcc 7080

acgtaggagt acaagtgtag gctaggtgaa ggtgaagcgc agtcatggta aggaaattgc 7140

cacttggaag tagtagtagt ttgcggtttg gtgagttctt ttccttcttt gcagcctgct 7200

ctgctctgct ctactcagcc caaccgaacc catgaaattg atcggttaaa taaatactgg 7260

ttgcttttgg ga 7272

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

tgcgtcctaa attgtcagtt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

acttagacat gcaatgctca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

gcggataaca atttcacaca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

ctgcagaagt aacaccaaac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

actgtttctt ttgtcgatgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

tttgacctgc acttcatttg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

ggctagtatc tacgacacac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

tcccaaaagc aaccagtatt 20

<210> 11

<211> 333

<212> DNA

<213> 探针

<400> 11

cacgcagatt ccagcggtca agggcaattt cctcttcaac gggagcgtta tctcgggccc 60

tgggttcaca ggcggggacc tggtgaggct caatagctcg ggcaataaca tccagaacag 120

gcggtacatt gaggtcccaa tccacttccc ttctacctca acgcgctaca gggtccgggt 180

tcgctacgcg tccgtgacac caattcatct gaatgtcaac tggggcaatt cttcaatctt 240

ctcgaacact gtgcctgcca cagcgacttc tctggacaat ctccagtcca gcgatttcgg 300

ctacttcgag tctgctaacg ccttcacctc gtc 333

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 12

cacgcagatt ccagcggtca a 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 13

gacgaggtga aggcgttagc a 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 14

tatagggttt cgctcatgtg 20

Claims (6)

1.核酸分子，其由SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列或其互补序列组成。

2.检测权利要求1所述核酸分子的引物对，其选自：

引物对，其包括特异性识别SEQ ID NO: 2所示序列中包含其第1-255位核苷酸的序列的一条引物和特异性识别SEQ ID NO: 2所示序列中包含其第256-7008位核苷酸的序列或者互补序列的另一条引物；和/或

引物对，其包括特异性识别SEQ ID NO: 2所示序列中包含其第256-7008位核苷酸的序列的一条引物和特异性识别SEQ ID NO: 2所示序列中包含其第7009-7272位核苷酸的序列或者互补序列的另一条引物；

其中所述引物对选自：

(1) SEQ ID NO: 3与SEQ ID NO: 4；

(2) SEQ ID NO: 3与SEQ ID NO: 14；

(3) SEQ ID NO: 7与SEQ ID NO: 10；和

(4) SEQ ID NO: 9与SEQ ID NO: 10。

3.用于鉴定生物样品中转化事件ZM2-104的方法，其包括使用权利要求2所述的引物对，其中所述转化事件ZM2-104是向玉米中引入外源DNA从而在玉米中产生SEQ ID NO: 2序列的DNA。

4.用于检测玉米转化事件ZM2-104的试剂盒或微阵列，其包含权利要求2所述的引物对，其中所述转化事件ZM2-104是向玉米中引入外源DNA从而在玉米中产生SEQ ID NO: 2序列的DNA。

5.权利要求2所述的引物对或者权利要求4所述的试剂盒或微阵列用于检测生物样品中的玉米转化事件ZM2-104的应用，其中所述转化事件ZM2-104是向玉米中引入外源DNA从而在玉米中产生SEQ ID NO: 2序列的DNA。

6.检测生物样品中转化事件ZM2-104或其后代的存在的方法，其包括

提供生物样品，并从所述生物样品提取DNA；

提供权利要求2所述的引物对；

利用上述引物对进行DNA扩增反应；和

检测所述DNA扩增反应产生的DNA扩增子分子，其中所述DNA扩增子分子的存在表明转化事件ZM2-104的存在，其中所述转化事件ZM2-104是向玉米中引入外源DNA从而在玉米中产生SEQ ID NO: 2序列的DNA。

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