CN117025658A - 调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因与应用 - Google Patents

调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因与应用。本发明公开的调控大豆豆荚颜色的蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，其编码基因为SEQ ID No.1所示的L1基因。本发明发现，含有SEQ ID No.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黑色，不含有SEQ ID No.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黄褐色。使黄褐色豆荚的豆科植物表达L1，可以得到黑色豆荚的豆科植物；敲除黑色豆荚豆科植物中的L1编码基因，可以得到黄褐色豆荚的豆科植物。说明本发明的调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因可以调控豆科植物豆荚颜色，可用于调控豆科植物豆荚颜色。

Description

调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，调控大豆豆荚颜色的蛋白质及其编码基因与应用。
背景技术
大豆[Glycine max(L.)Merr.]是人类消费、动物饲料和工业加工中植物性蛋白质和油脂的主要来源之一。大豆起源于距今约5,000-9,000年前的东亚野生大豆(Glycinesoja(Sieb.&Zucc))。人类通过选择性地改变野生大豆(G.soja)的形态和基因特征，在大豆驯化和改良的复杂进化过程中培育出了具有良好性状的品种。因此，更深入地解析野生大豆到驯化大豆形态和遗传变化，为了解大豆驯化提供了一个良好的窗口，同时也为提高大豆产量和品质提供了有价值的信息。
大豆驯化的过程涉及到多种性状的选择，其中包括成熟后大豆果荚的颜色。野生大豆(G.soja)的豆荚通常是黑色的，而驯化大豆的豆荚倾向于是褐色或黄褐色。经典的遗传学研究表明，大豆豆荚的颜色是由L1和L2两个基因位点的上位作用决定的。L1等位基因导致黑色豆荚，而在L2或l2背景下，l1等位基因则导致褐色或黄褐色豆荚。然而，负责豆荚颜色的基因仍然未知。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何培育改变豆科植物豆荚颜色。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
D1)调控豆科植物豆荚颜色；
D2)制备调控豆科植物豆荚颜色产品；
D3)使豆科植物豆荚颜色由黄褐色改变为黑色；
D4)制备使豆科植物豆荚颜色由黄褐色改变为黑色产品；
D5)使豆科植物豆荚颜色由黑色改变为黄褐色；
D6)制备使豆科植物豆荚颜色由黑色改变为黄褐色产品；
D7)培育黑色豆荚豆科植物；
D8)制备培育黑色豆荚豆科植物产品；
D9)培育黄褐色豆荚豆科植物；
D10)制备培育黄褐色豆荚豆科植物产品；
所述蛋白质来源于大豆，其名称为L1，L1为如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)来源于大豆且与A1)或A2)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有调控豆荚颜色功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，为与SEQ ID No.2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQID No.2所示的蛋白质。
上述应用中，所述物质可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码L1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低L1表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；
b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码L1的DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码L1的DNA分子；
B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的gRNA。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码L1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的L1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码L1蛋白质且具有L1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码L1蛋白质的核酸分子的表达盒(L1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达L1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动L1基因转录的启动子，还可包括终止L1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(1985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述L1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述用于表达L1基因的载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为JRH0641-OE载体。
B3)所述重组载体具体可为0641-L1过表达载体，所述0641-L1过表达载体为在JRH0641-OE载体的多克隆位点间插入序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段得到的重组载体，该载体能表达SEQ ID No.2所示的L1蛋白质。
上述应用中，B9)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低L1含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的gRNA。所述gRNA的靶序列可为序列表中SEQ ID No.1的第129-151位。
所述载体可为表达cas9并含有gRNA骨架的载体，如JRH0645载体。
B9)所述重组载体可为CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA。所述CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA为将JRH0645载体与SEQ ID No.3所示的DNA片段进行同源重组得到的重组载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌K599或EHA105。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还提供了下述任一方法：
X1)培育黑色豆荚豆科植物的方法，包括使受体豆科植物中表达L1，或提高受体豆科植物中L1的含量或活性，得到黑色豆荚的目的植物；
X2)培育黄褐色豆荚豆科植物的方法，包括降低受体豆科植物中L1的含量或活性，或敲除受体豆科植物中L1编码基因，得到黄褐色豆荚的目的植物；
X3)培育植株颜色改变植物的方法，包括改变受体豆科植物中L1的含量或活性，得到豆荚颜色改变的目的植物。
其中，所述豆荚颜色改变可为豆荚颜色从黄褐色变为黑色，或从黑色变为黄褐色。
上述方法中，X1)所述方法可通过向所述受体豆科植物中导入L1的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；
X2)所述方法可通过对所述受体豆科植物中L1的编码基因的进行编辑实现；
X3)所述方法可通过向所述受体豆科植物中导入L1的编码基因并使所述编码基因得到表达，或对所述受体豆科植物中L1的编码基因的进行编辑实现。
上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。
本发明中，含有SEQ ID No.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黑色，不含有SEQ IDNo.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黄褐色。使黄褐色豆荚豆科植物中表达L1，或提高该植物中L1的含量或活性，可以得到黑色豆荚的豆科植物。降低黑色豆荚豆科植物中L1的含量或活性，或敲除黑色豆荚豆科植物中L1编码基因，可以得到黄褐色豆荚的豆科植物。
上述方法中，对所述受体豆科植物中L1的编码基因的进行编辑可利用crisper/cas9系统进行。具体可将所述CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA导入所述受体豆科植物中实现。
在本发明的一个实施例中，所述基因编辑实现了在SEQ ID No.1的第135-136位间插入核苷酸为A(反向互补序列上位T)，或实现了将SEQ ID No.1的第130-135位的CCCGGA替换为AGGTTTCCAGCCAGTTCAGGATGCGGACATAATGAGTGCAGTGACAATCCTGGACACCCCGCATTATG。
所述基因编辑也可通过实现将基因组中SEQ ID No.1的第91位的C编辑为T完成豆荚从黑色变为黄褐色，也可通过实现将基因组中SEQ ID No.1的第91位的T编辑为C完成豆荚从黄褐色变为黑色。
上述方法中，其中所述L1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述L1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述L1的编码基因可利用含有所述L1的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述0641-L1过表达载体。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。
所述目的植物理解为不仅包含L1蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了调控豆科植物豆荚颜色的产品，所述产品含有(或其活性成分为)L1或所述调控所述蛋白质含量或活性的物质。
上文中，所述豆科植物可为大豆。
L1，也属于本发明的保护范围。
所述调控所述蛋白质含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。
本发明发现，含有SEQ ID No.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黑色，不含有SEQ ID No.1所示L1基因的豆科植物的豆荚表现为黄褐色。使黄褐色豆荚豆科植物中表达L1，可以得到黑色豆荚的豆科植物；敲除黑色豆荚豆科植物中L1编码基因，可以得到黄褐色豆荚的豆科植物。说明本发明的L1基因及其编码的蛋白质可以调控豆科植物豆荚颜色，可用于调控豆科植物豆荚颜色。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为黑荚和黄褐色豆荚分离群体的构建。(A)将大豆品种中品03-5373(ZP03-5373)和中黄13(ZH13)进行杂交，连续自交十代后获得245个重组自交系。其中R171株系进一步分离出R171-BLk和R171-LBn两个株系。(B)将R171-BLk和R171-LBn进行杂交，构建F2荚色表型分离群体。
图2为L1基因的图位克隆。(A)将F2分离群体中的30个黑荚植株和30个黄褐荚植株的叶片混池后测序，进行BSR-Seq分析。虚线表示与L1位点的关联概率值大于0.25的SNP。(B)利用M5和M8标记将L1位点定位于第19号染色体上16.2kb区域内，该区域仅包含Glyma.19g120400基因的部分外显子，其在亲本R171-BLk和R171-LBn之间存在一个核苷酸变异。字母A表示L1纯合子，字母B表示L1纯合子。
图3为载体构建及转基因阳性材料的分子检测。(A)CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA图谱。(B)0641-L1过表达载体图谱。(C)Glyma.19g120400基因的部分结构，横线上方的字母表示CRISPR-Cas9介导的l1突变体中核苷酸插入的位置与序列。(D)野生型、突变体CR-1和CR-2中L1蛋白结构域示意图。(E)过表达转基因材料中L1基因表达量。
图4为大豆转基因材料的大豆颜色表型。(A)野生型(R171-BLk)以及L1基因编辑突变体CR-1和CR-2植株的成熟果荚颜色。(B)野生型(TL1)以及L1过表达转基因株系OE-1和OE-2植株成熟果荚颜色。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的JRH0645载体(为CRISPR-Cas9载体)记载在文献(Li,C.etal.Adomestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock andflowering time in soybean.Mol Plant 13,745–759(2020).)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的JRH0641-OE载体，其序列如SEQ ID No.6所示。
下述实施例中的大豆天龙一号(TL1)(Li,C.et al.A domestication-associatedgene GmPRR3b regulates the circadian clock and flowering time in soybean.MolPlant 13,745–759(2020))，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的大豆中品03-5373(ZP03-5373)(刘波等，中品03-5373对大豆胞囊线虫3号生理小种免疫抗性的遗传解析，作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2015,41(1):15-21)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的中黄13(ZH13)(王连铮等，广适高产高蛋白大豆品种中黄13的选育与应用，大豆科学，2019，38(1):001－006)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、L1基因的图位克隆
(一)大豆黑荚性状的分离和遗传分析
将大豆中品03-5373(ZP03-5373)和中黄13(ZH13)进行杂交，连续自交10代后，获得了245份重组自交系，其中R171株系表现出大豆荚色分离：其自交后代R171-BLk成熟后具有黑色豆荚，而其自交后代R171-LBn株系成熟后带有黄褐色豆荚(图1中A)。
为解析控制大豆黑荚的分子机制，发明人将R171-BLk与R171-LBn植株进行杂交。F2群体的遗传分析表明黑色和黄褐色豆荚的比例为3:1[χ2(1:3)＝0.05<χ2 0.05＝3.84](图1中B)，表明黑荚性状是由单一显性基因控制的。
(二)L1基因的图位克隆
为了分离控制黑荚性状的单一显性基因，本实施例进一步对R171-BLk与R171-LBn的F2后代群体进行了基因定位。分别从F2群体中选取30株黑荚植株的叶片和30个黄褐色荚植株的叶片混合后进行BSR-Seq分析。经过质量控制和数据过滤，鉴定出149,157个高质量的SNP位点。筛选等位基因频率差异>0.8，连锁概率>0.05的SNP，共获得了229个SNP标记与大豆黑荚性状高度连锁。其中，185个SNP标记(80.8％)定位于19号染色体的36.5Mb到38.2Mb区域(图2中A)。利用KASP标记及SNP标记，对F2:4群体(即F2代的自交二代，n＝2,662)进行了定位，将L1基因位点缩小到M5和M8标记之间的16.2kb区域(图2中B)。该区域仅包含一个基因的一部分，即Glyma.19G120400。发明人分别测定了两个亲本的Glyma.19G120400基因序列，并在第一外显子的第91个核苷酸上鉴定出C>T变异，该核苷酸变异导致了精氨酸到半胱氨酸的氨基酸替换(p.R31C)(图2中B)。将R171-BLk中的Glyma.19G120400基因命名为L1基因，该基因在R171-BLk与中品03-5373中的CDS序列为SEQ ID No.1，编码SEQ IDNo.2所示的L1蛋白质。黑荚植株的L1基因的CDS均为SEQ ID No.1，黄褐荚植株的L1基因的CDS除第91位为C外，其他均同黑荚植株的L1基因。
实施例2、L1基因可以调控大豆豆荚颜色
(一)重组载体的构建
1.CRISPR/Cas9基因编辑载体L1-gRNA的构建
靶序列的设计：
根据L1基因序列设计1个gRNA位点，相应靶位点的核苷酸序列如下：5’-TGGAAACCATGGAGGCTCCG-3’，对应于L1基因的序列表中SEQ ID No.1的第129-151位核苷酸。
U6-gRNA的获得：
引物序列用于扩增包含gRNA(guide RNA)序列的引物如下：
L1-F：5’-TGTGCCACCACATGGATTGTGGAAACCATGGAGGCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
gRNA-XbaI-R：5’-GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’；
用于扩增U6启动子片段的引物序列为：
U6-Xbal-F：5’-GGAAGCTTAGGCCTAAAATAAATGGTAAAATGTC-3’；
U6-R：5’-AATCCATGTGGTGGCACAT-3’。
以JRH0645载体(包含GmU6启动子序列及gRNA序列，其图谱如图3中A所示)为模板，利用U6-XbaI-F与U6-R组成的引物对进行PCR扩增，所得扩增产物即为U6启动子片段；以JRH0645载体为模板，利用L1-F和gRNA-XbaI-R组成的引物对进行PCR扩增，所得扩增产物即为gRNA的编码DNA片段。
以扩增产物U6启动子片段和gRNA的编码DNA片段的混合物为模板，分别利用U6-XbaI-F与gRNA-XbaI-R组成的引物对进行扩增，所得扩增产物将U6启动子与gRNA的编码DNA片段连在一起，将扩增产物记为U6-gRNA1(其序列为序列表中SEQ ID No.3)。
CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA的连接：
酶切：分别利用StuI和XbaI酶切JRH0645载体，将酶切产物回收即得到线性化的pJRH0645载体。
In-fusion连接：利用HD Cloning Plus(Clontech,638909)连接步骤2得到的U6-gRNA1与线性化的pJRH0645载体，所得的序列正确的重组载体即为CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA。该重组载体含有目的片段U6-gRNA1(SEQ ID No.3所示的DNA分子)，能表达靶向SEQ ID No.1的第129-151位的gRNA，还能表达Cas9。
2.L1-0641过表达载体的构建
取大豆黑荚材料R171-BLk的叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA，以所得cDNA为模板利用L1OE-F与L1OE-R进行PCR扩增，得到PCR产物，所用引物如下(下划线为L1基因上的序列)：
L1OE-F：5’-GGAGAGCCACCATGCTCGAGATGGCAGCCAAAACATCTAC-3’；
L1OE-R：5’-CCACTAGTCCCGGGCTCGAGTCATTCCTTTAAATCGAGCATT-3’。
将JRH0641-OE载体(其图谱如图3中B所示)利用XholI酶切后，回收载体骨架，将所得载体骨架与所得PCR产物利用HD Cloning Plus(Clontech,638909)进行连接，所得序列正确的重组载体即为0641-L1过表达载体。0641-L1过表达载体含有序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段，能表达SEQ ID No.2所示的L1蛋白质。
(二)转基因大豆植株的获得
将CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA分别导入转化农杆菌K599(ZOMANBIO，货号ZC1506)与EHA105中，分别得到重组农杆菌K599/L1-gRNA和EHA105/L1-gRNA；将0641-L1过表达载体导入农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌EHA105/0641-L1。
1.大豆发根检测CRISPR载体编辑效率
利用重组农杆菌K599/L1-gRNA转化大豆，步骤如下：
(1)种子消毒：挑选出健康，饱满，无病斑的大豆天龙一号(TL1)种子。用4mL浓盐酸和100mL消毒水(花王Bleach)反应出的氯气对豆子进行灭菌，16-18小时左右，拿出，在超净工作台中吹干净氯气。
(2)种子催芽：将豆子均匀摆放在催芽培养基上，每皿摆6-8颗左右。(如果其中某一颗豆子染菌，则一板豆子都不要)温室中光照培养三天左右。
(3)切豆子，调菌液OD值：切子叶，取萌发4-7天(5-6天最好)的大豆种子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。取出摇好的重组农杆菌菌液(K599/L1-gRNA，OD600nm值＝0.6-0.8，一般切豆子前两天小摇，前一天晚上大摇，当天上午可以用)离心(4000rpm，10min)，收集菌体，将所得菌体利用液体共培培养基(含有MS盐，AS，蔗糖，MES)重悬，使菌液OD600nm值＝0.6-0.8，将豆子加入调好的菌液中，隔几分钟用手摇一次，共浸染15min，取出吹10min左右。
(4)共培养：在固体共培培养基(向液体共培养培养基中加入琼脂得到)中铺上已灭菌滤纸，然后将菌液浸染过的种子均匀的摆放在培养基中，黑暗条件下培养三天，温度26℃左右。
(5)诱导培养：暗培养3天后，胚芽长长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。胚芽朝上斜插入固体诱导培养基(向诱导培养基中加入琼脂得到)中，放入温室中光照培养。在温室培养15天左右，有的豆瓣开始生根。
(6)取根检测：取豆瓣伤口处长出的根，2-3根/管，一般取3个重复，CTAB法提取DNA，进行PCR检测和测序，确定gRNA靶位点的编辑效果。检测靶位点的引物为L1-CF:5’-AAACAACAATCTCTTCCCT-3’和L1-CR:5’-TACAAAGAAAGCGATAGAAC-3’，测序结果显示gRNA靶位点处的碱基为双峰，表明CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA能够在靶位点位置对大豆基因组发生有效编辑。
2.利用重组农杆菌EHA105/L1-gRNA与EHA105/0641-L1转化大豆
利用EHA105/L1-gRNA转化大豆黑荚材料R171-BLk，利用EHA105/0641-L1转化大豆材料天龙一号(TL1)，步骤如下：
(1)用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气灭菌的大豆材料的种子。
(2)将豆子对半切开，去掉一部分胚尖，在豆子的分生区部分划伤口，泡在无菌水中。下午取出摇好的重组农杆菌菌液，离心(4000rpm，10min)，收集菌体重悬在侵染培养基(infection medium)中，调菌，使菌液OD600nm值＝0.4-0.6，将豆子中的无菌水倒掉，加入重组农杆菌菌液，放在摇床中摇30min(28℃，200rpm左右)，取出吹10min左右，平铺在共培培养基(cocultivation medium)中暗培养3天。
(3)3天后，胚芽伸长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基(liquid shootinduction(SI)medium)进行脱菌处理，一般清洗4-5次，确保将农杆菌洗净。
(4)将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm长度，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。
(5)在温室培养10天后，有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉。
(6)温室中培养10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中继代培养四周。
(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基(shoot elongation(SE)medium)中，每20天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代3-4次，合计60-80天。
(8)愈伤在伸长培养的同时也在筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。
(9)当苗长到超过100mL刻度的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基(rootingmedium)中。
(10)苗子在培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗五天。
(11)每种一棵转基因苗标上豆子品种，基因名称，生根日期和土培日期。加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜。得到T0代转基因株系单株。
其中，所用侵染培养基、共培养培养基、加入激素的液体诱导培养基、固体诱导培养基、伸长培养基和生根培养基均记载于如下文献中：Paz,M.M.,J.C.Martinez,A.B.Kalvig,T.M.Fonger and K.Wang(2006).″Improved cotyledonary node methodusing an alternative explant derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation.″Plant Cell Rep 25(3):206-213。
3.转基因植株的鉴定
3.1l1纯合突变体的鉴定
为了确定转基因阳性植株，取利用EHA105/L1-gRNA转化大豆黑荚材料R171-BLk得到的T0代转基因材料的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，检测其是否含有Basta抗性基因片段、Cas9蛋白编码基因片段和U6启动子。并对其gRNA靶序列的上下游进行PCR扩增和测序，扩增引物为L1-CF和L1-CR组成的引物对。各引物如下：
检测Basta抗性基因片段引物：JRH0912-Basta-CF：5’-TCCGCAGCCATTAACGACTT-3’；JRH0912-Basta-CR：5’-ACAGATAAAGCCACGCACATT-3’。
检测Cas9蛋白编码基因片段引物：JRH0912-CAS9-CF：5’-CAGCTCGTCCAAACCTAC-3’；JRH0912-CAS9-CR：5’-CTGTGCCATCCATCTTCT-3’。
检测U6启动子引物：JRH0912-GmU6-CF：5’-GCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’；JRH0912-GmU6-CR：5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’。
PCR检测结果和测序结果显示，得到T0代转基因大豆植株中发生基因编辑的植株4株。将T0代基因编辑发生的植株分别自交两代，得到T2代基因编辑的植株(即由导入L1-gRNA得到的T0代转基因大豆植株自交2代得到的T2代基因编辑的植株)。之后按照上述PCR方法检测T2代基因编辑的植株的突变类型。共获得2个独立的纯合突变体株系：CR-1和CR2。2个纯合突变体的检测结果见图3中C(L1基因结构示意和具体编辑方式)。
与野生型相比，CR-1突变体中L1基因存在1bp核苷酸的插入，插入位置为SEQ IDNo.1的第135-136位间，插入核苷酸为A(反向互补序列上位T)。CR-2突变体中L1基因存在插入/缺失，具体为将SEQ ID No.1的第130-135位的CCCGGA替换为AGGTTTCCAGCCAGTTCAGGATGCGGACATAATGAGTGCAGTGACAATCCTGGACACCCCGCATTATG。野生型L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，CR-1突变体中突变后的L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。CR-2突变体中突变后的L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.2L1过表达株系的鉴定
为了确定过表达转基因阳性植株，取利用EHA105/0641-L1转化大豆材料天龙一号(TL1)得到的T0代转基因材料的叶片，提取DNA，利用JRH0912-Basta-CF/JRH0912-Basta-CR为引物，进行PCR检测。检测其含有Basta抗性基因片段。将获得的含有Basta抗性基因片段的T0代转基因植株自交2代，得到T2代L1基因过表达转基因株系OE-1与OE-2。
以2040-QF/2040-QR为引物检测T2代L1基因过表达转基因株系中L1基因的表达，以GmActin-qF(L838)/GmActin-qR(L838)为引物检测大豆内参Actin的表达。利用大豆材料天龙一号(TL1)作为对照。引物如下：
2040-QF：5’-GATGAAGAAGTTGAGAGT-3’；
2040-QR：5’-ATAGTTGCTGTTGAAGAA-3’；
GmActin-qF(L838)：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’；
GmActin-qR(L838)：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’。
后使用ΔCT方法计算基因相对表达量。
结果表明，L1基因过表达转基因株系(OE-1与OE-2)中L1基因的表达量均显著高于野生型TL1，检测结果见图3中E。
(三)L1基因敲除突变体及L1过表达大豆豆荚颜色鉴定
将得到的l1突变体CR-1、CR-2突变体和野生黑荚R171-BLk，L1过表达转基因植株(OE-1与OE-2)和天龙一号大豆种子播种在中国农业科学院103温室(中日照条件，12h光照/12h黑暗)中，温室温度27℃、光照350μmol m-2s-1。观察各植株成熟豆荚颜色，并拍照记录。
实验结果如图4所示，与野生型的黑荚相比，L1基因敲除突变体材料的成熟豆荚颜色显著变浅，变为黄褐色。相反地，天龙一号成熟后表现出黄褐色的大豆荚，而L1过表达转基因材料成熟后，豆荚变黑色。以上结果表明L1基因具有调控大豆成熟果荚颜色的功能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质或调控所述蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
D1)调控豆科植物豆荚颜色；
D2)制备调控豆科植物豆荚颜色产品；
D3)使豆科植物豆荚颜色由黄褐色改变为黑色；
D4)制备使豆科植物豆荚颜色由黄褐色改变为黑色产品；
D5)使豆科植物豆荚颜色由黑色改变为黄褐色；
D6)制备使豆科植物豆荚颜色由黑色改变为黄褐色产品；
D7)培育黑色豆荚豆科植物；
D8)制备培育黑色豆荚豆科植物产品；
D9)培育黄褐色豆荚豆科植物；
D10)制备培育黄褐色豆荚豆科植物产品；
所述蛋白质为如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)来源于大豆且与A1)或A2)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有调控豆荚颜色功能的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；
b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的gRNA。
4.下述任一方法：
X1)培育黑色豆荚豆科植物的方法，包括使受体豆科植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到黑色豆荚的目的植物；
X2)培育黄褐色豆荚豆科植物的方法，包括降低受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，或敲除受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质编码基因，得到黄褐色豆荚的目的植物；
X3)培育植株颜色改变植物的方法，包括改变受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质的含量或活性，得到豆荚颜色改变的目的植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：X1)所述方法通过向所述受体豆科植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；
X2)所述方法通过对所述受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的进行编辑实现；
X3)所述方法通过向所述受体豆科植物中导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达，或对所述受体豆科植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的进行编辑实现。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。
7.调控豆科植物豆荚颜色的产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求1-3中任一所述调控所述蛋白质含量或活性的物质。
8.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，其特征在于：所述豆科植物为大豆。
9.权利要求1中所述蛋白质。
10.权利要求1-3中任一所述调控所述蛋白质含量或活性的物质。
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