CN113151258B - 一种抗虫转基因玉米am63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用 - Google Patents

一种抗虫转基因玉米am63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用。所述旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.9所示的序列或其特异性片段；和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.10所示的序列或其特异性片段；抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20180。运用本发明的旁侧序列可对是否成功获得抗虫转基因玉米事件AM63进行有效判断，为监管抗虫转基因玉米AM63及其后代等提供了有力的保障。

Description

一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序 列及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用。
背景技术
虫害(尤其是玉米螟害)会造成玉米的严重减产，抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白，其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔，从而使昆虫代谢紊乱而死亡。孟山都公司是转基因抗虫玉米研发与应用的领跑者，其开发的抗虫转基因玉米MON810和MON863都已经进入商品化生产多年。在MON810转基因玉米中表达的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟，在MON863中表达的Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达公司也开发了表达Cry1Ab蛋白的转基因抗虫玉米BT11和BT176。先锋公司和陶氏公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。丁群星等(1993)首次报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米；王国英等(1995)用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体，通过基因枪轰击法成功地将Bt毒蛋白基因转入玉米细胞，并获得了大量转基因植株；周逢勇等(1998)将Bt杀虫蛋白导入玉米自交系P9-10，外源基因能稳定遗传到转基因植株后代。张艳贞等(2002)对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。
截止目前，国产转基因植酸酶玉米BVLA430101、抗虫耐除草剂玉米DBN9936、瑞丰125和耐除草剂玉米DBN9858已被认为符合安全标准。随着转基因玉米的商业化应用将加快玉米产业升级。为今后转基因玉米的可持续利用，有必要研发更多的抗性优良转化体。
我们将改造的cry1Ab基因(专利申请号202010553528.0)和cry1m7基因(专利号201410591794.3)构建转化载体p3301UbiAbUbiM7，通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件AM63，今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因玉米进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法，是进行监督管理的一个重要指标。因此有必要获得转基因玉米AM63的旁侧序列，并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可对抗虫转基因玉米事件AM63进行有效监管的方法。
本发明所述抗虫转基因玉米事件AM63以种子的形式，于2021年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为玉米Zea mays，保藏编号为CGMCC NO.20180。
具体地，本发明提供如下技术方案：
抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列，其为外源插入片段的5’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.9所示的序列或其特异性片段；
和/或，其为外源插入片段的3’端旁侧序列，具体为SEQ ID NO.10所示的序列或其特异性片段；
抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20180。
本发明另提供：
用于检测抗虫转基因玉米事件AM63的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。
上述旁侧序列或DNA片段在检测转基因玉米AM63中的应用。
用于扩增上述DNA片段的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12或SEQID NO.13-14所示。
用于检测抗虫转基因玉米AM63的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14所示。
用于检测抗虫转基因玉米AM63的试剂盒，其含有上述的特异性引物对。
一种检测抗虫转基因玉米AM63的方法，其以样品总DNA为模板，利用上述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。
上述方法中，当采用核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为716bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分；
若采用核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为583bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分。
本发明还提供上述特异性引物对或试剂盒在检测转基因玉米AM63亲本、后代、杂种F1，及其植株、组织、种子或其制品中的应用。
本发明再提供一种培养对昆虫具有抗性的玉米的方法，其包括种植玉米种子，所述玉米种子的基因组中包含SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示的序列。
本发明的抗虫转基因玉米事件AM63按如下方式获得：
将载体pCambia3301上的gus基因换成cry1m7基因，35S启动子换成玉米Ubiquitin启动子，构建植物表达载体p3301UbiM7；同时，将Ubiquitin启动子-Cry1Ab-NOS终止子表达框构建到载体p3301UbiM7上，从而构建植物表达载体p3301UbiAbUbiM7。在T-DNA区结构为35S polyA终止子-bar基因-35S启动子-ubiquitin启动子-cry1Ab基因-NOS终止子-ubiquitin启动子-cry1m7基因-NOS终止子，大小约为10.7kb。载体图谱如图1所示。
将载体p3301UbiAbUbiM7通过冻融法转入农杆菌LBA4404中。剥取授粉12天大小为1-1.5mm左右的玉米自交系综31的幼胚，用农杆菌进行侵染。然后再共培养3天，恢复7天后分别用含1.5mg/L，3mg/L bialaphos(双丙氨膦)的培养基上筛选四轮。筛选得到的愈伤分化成苗，转入土中使转基因植株生长并进行授粉结实。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米AM63。对转基因玉米进行温室及田间喷施草铵膦以选择阳性苗。
经PCR及转基因后代基因分离鉴定实验，转化载体中的目的基因cry1Ab和选择标记基因bar单拷贝整合到AM63基因组中，在转基因植株能稳定遗传；转化载体中的目的基因cry1m7没有整合到玉米基因组中。通过三代测序等方法鉴定外源基因整合到玉米第3号染色体214Mb附近，明确了插入序列上下游旁侧序列。
本发明提供了抗虫转基因玉米事件AM63(Zea mays)插入位点的外源插入片段的5’端和3’端旁侧序列，其具有SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的序列或其特异性片段。
特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。本发明提供了鉴定抗虫转基因玉米事件AM63(Zea mays)插入位点的5’端旁侧序列的引物，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。提供了鉴定抗虫转基因玉米事件AM63(Zea mays)插入位点的3’端旁侧序列的引物，如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示。
本发明的抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列，以及用于检测该序列的PCR引物、方法等可对是否成功获得抗虫转基因玉米事件AM63进行有效判断，为监管抗虫转基因玉米AM63及其后代等提供了有力的保障。
附图说明
图1是转化载体p3301UbiAbUbiM7的图谱示意图。
图2是转基因玉米AM63基因组DNA PCR图片；
其中，泳道1：DNA分子量marker；泳道2,6,10：质粒作为正对照；泳道3,7,11：转基因玉米AM63；泳道4,8,12：非转基因玉米综31；泳道5,9,13：水。
图3是实施例2的抗虫实验结果图。
图4是AM63插入序列示意图。
图5是AM63转化体5’旁侧序列特异性PCR结果图；其中，M,DNA分子量marker；1，质粒；2，T2代AM63植株；3，T3代AM63植株；4，非转基因玉米(综31)；5，水。
图6是AM63转化体3’旁侧序列特异性PCR结果图；其中，M,DNA分子量marker；1，质粒；2，T2代AM63植株；3，T3代AM63植株；4，非转基因玉米(综31)；5，水。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗虫转基因玉米AM63的获得
1、转化载体p3301UbiAbUbiM7的构建
将载体pCambia3301上的gus基因换成cry1m7基因，35S启动子换成玉米Ubiquitin启动子，构建植物表达载体p3301UbiM7；同时，将Ubiquitin启动子-Cry1Ab-NOS终止子表达框构建到载体p3301UbiM7上，从而构建植物表达载体p3301UbiAbUbiM7。在T-DNA区结构为35S polyA终止子-bar基因-35S启动子-ubiquitin启动子-cry1Ab基因-NOS终止子-ubiquitin启动子-cry1m7基因-NOS终止子，大小约为10.7kb。载体图谱如图1所示。载体T-DNA序列参见SEQ ID No.1。
2、农杆菌转化玉米幼胚获得转基因植株
将载体p3301UbiAbUbiM7通过冻融法转化到农杆菌LBA4404中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米综31幼胚为材料，将幼胚放到D-inf溶液中一个小时后，用D-inf洗一次，再浸入添加100μM乙酰丁香酮的D-inf的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。幼胚洗涤去菌后，放至含1.5mg/LBialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养，每三周继代一次，筛选培养至两个月，有一些愈伤生长状态良好，为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上，3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化，培养条件为28℃，每日3000Lux光强，光照16小时，很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗移植到罐头瓶中，并在室内培养。待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3)的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中，自交获得种子。
3、转基因植株的PCR鉴定
3.1植物总DNA的提取，采用CTAB法快速提取玉米叶片总DNA，具体步骤如下：
(1)取30-50ml离心管，加入7.5ml CTAB提取缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M,20mMEDTA,2％CTAB,0.1％巯基乙醇)，在60℃恒温水浴中预热30min；
(2)取适量玉米叶片置于2ml离心管中，在液氮速冻下利用2000GENO/GRINDER组织磨碎仪将叶片磨成粉末状；
(3)打开离心管，加入700μl CTAB提取缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M,20mMEDTA,2％CTAB,0.1％巯基乙醇)。60℃水浴中保温30min，其间轻摇几次；
(4)取出离心管，每管中加入1ml饱和酚，摇动均匀后再加700μl氯仿/异戊醇(24:1)轻微而彻底地混合，放置10min以上，待蛋白质变性后离心；室温下以12000r/min离心10min；
(5)将上清液转移到新的离心管中，加三分之二体积的异丙醇，混匀，使核酸沉淀成絮状，12000r/min离心5min，弃上清。
(6)在沉淀中加入1ml 70％乙醇，用手指轻弹几下，放置20min以上；
(7)12000r/min离心2min，弃上清；
(8)在超净台上吹干沉淀，溶于适量无菌水(100-200μl)中。
(9)将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。
3.2鉴定引物设计
根据Cry1Ab基因序列信息，设计扩增引物如下
上游引物5’-GATCTACGCCGAGTCCTTCA-3’(SEQ ID No.2)
下游引物5’-ATGTTGAACGGCCTCCTGTA-3’(SEQ ID No.3)
扩增片段长度为795bp。
根据Cry1m7基因序列信息，设计扩增引物如下
上游引物5’-ACAACTTCTACTACCCGGGC-3’(SEQ ID No.4)
下游引物5’-CCTCTCGATGTGGATCTGCT-3’(SEQ ID No.5)
扩增片段长度为848bp。
根据bar基因序列信息，设计扩增引物如下
上游引物5’-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3’(SEQ ID No.6)
下游引物5’-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3’(SEQ ID No.7)
扩增片段长度为370bp。
3.3PCR扩增体系及反应程序
PCR反应体系：
Figure BDA0003020510690000051
PCR反应程序：
Figure BDA0003020510690000052
Figure BDA0003020510690000061
以上述体系及程序进行PCR反应，获得转基因阳性植株，结果如图2所示。结果表明cry1Ab和bar基因整合到转基因玉米AM63基因组中，但是cry1m7基因没有整合到转基因玉米中。
实施例2转基因玉米AM63的抗虫性鉴定
种植在温室田间的转基因玉米AM63 T3代长至吐丝期时，取样玉米花丝放入培养皿中，每皿接10头初孵玉米螟幼虫。试验在相对湿度为70％–80％、温度为26–28℃、光照周期为16h:8h(L:D)的培养室里进行，每24h统计昆虫的死亡率，根据组织被取食消耗情况添加或更换相同来源的新组织，试验在相同条件下重复三次，另设一组采用非转基因玉米综31作为对照进行平行试验。结果表明非转基因玉米综31花丝高感玉米螟，转基因玉米AM63高抗玉米螟(图3，表1)。
表1转基因玉米对玉米螟抗性鉴定
Figure BDA0003020510690000062
注：表中数据为平均值±标准差，数据后小写字母不同表示各处理之间在P<0.05水平上差异显著。
实施例3抗虫转基因玉米AM63旁侧序列的获得及应用
通过PacBio三代测序技术对转基因玉米AM63基因组DNA进行测序，获得外源插入序列(SEQ ID No.8)、5’旁侧序列(SEQ ID No.9)和3’旁侧序列(SEQ ID No.10)(具体AM63插入序列示意图见图4)。
1)5’旁侧序列特异性PCR鉴定
利用抗虫转基因玉米AM63的5’端旁侧序列及外源片段中的bar基因序列针对两个不同的插入位点分别设计一对引物，建立AM63事件5’端旁侧序列的PCR鉴定方法。依据其中一个外源片段中整合位点5’端玉米基因组设计的引物为5’-ACCTGGTAGGCGACGAACTT-3’(SEQ ID No.11)，依据bar基因序列设计的引物为5’-AGGCACAGGGCTTCAAGAG-3’(SEQ IDNo.12)。
玉米基因组DNA的提取及PCR反应体系依实施例1中的方法。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，58℃60s，72℃1min)35个循环，72℃7min。用此特异性引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株或质粒均无扩增条带，只有转基因植株AM63 DNA扩增序列有特异性716bp(SEQ ID No.15)目的条带(图5)。进行3次重复试验，所反映的结果一致。
2)3’旁侧序列特异性PCR鉴定
利用抗虫转基因玉米AM63的3’端旁侧序列及外源片段中的cry1Ab基因序列分别设计一对引物，建立AM63事件3’端旁侧序列的PCR鉴定方法。依据Cry1Ab基因序列设计的引物为5’-AGACCGACGTGACCGACTAC-3’(SEQ ID No.13)。依据其中一个外源片段中整合位点3’端玉米基因组设计的引物为5’-AATCAAACACTCGCCATGCT-3’(SEQ ID No.14)。
玉米基因组DNA的提取及PCR反应体系依实施例1中的方法。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，58℃60s，72℃1min)35个循环，72℃7min。用此特异性引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株或质粒均无扩增条带，只有转基因植株AM63 DNA扩增序列有特异性583bp(SEQ ID No.16)目的条带(图6)。进行3次重复试验，结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种抗虫转基因玉米AM63插入位点的外源插入片段的旁侧序列及其应用
<130> KHP211111696.8
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120
ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180
atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240
cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagtcaaatc tcggtgacgg 300
gcaggaccgg acggggcggt accggcaggc tgaagtccag ctgccagaaa cccacgtcat 360
gccagttccc gtgcttgaag ccggccgccc gcagcatgcc gcggggggca tatccgagcg 420
cctcgtgcat gcgcacgctc gggtcgttgg gcagcccgat gacagcgacc acgctcttga 480
agccctgtgc ctccagggac ttcagcaggt gggtgtagag cgtggagccc agtcccgtcc 540
gctggtggcg gggggagacg tacacggtcg actcggccgt ccagtcgtag gcgttgcgtg 600
ccttccaggg gcccgcgtag gcgatgccgg cgacctcgcc gtccacctcg gcgacgagcc 660
agggatagcg ctcccgcaga cggacgaggt cgtccgtcca ctcctgcggt tcctgcggct 720
cggtacggaa gttgaccgtg cttgtctcga tgtagtggtt gacgatggtg cagaccgccg 780
gcatgtccgc ctcggtggca cggcggatgt cggccgggcg tcgttctggg ctcatggtag 840
actcgagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg 900
aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 960
ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 1020
ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 1080
ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 1140
cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 1200
tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 1260
tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt 1320
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ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 1620
ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 1680
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cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 1800
ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 1860
catgattacg aattggcatg caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 1920
ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 1980
tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 2040
ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 2100
tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 2160
ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 2220
acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 2280
aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 2340
ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 2400
aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 2460
agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 2520
ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 2580
ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 2640
ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 2700
gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 2760
ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 2820
cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac 2880
gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg 2940
gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga 3000
tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct 3060
aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg 3120
atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat 3180
ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg 3240
ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa 3300
ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta 3360
cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt 3420
tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt 3480
tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta 3540
tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat 3600
ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat 3660
acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata 3720
ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca 3780
gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttattgc ttggtactgt 3840
ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcaggtcga ctctagagga 3900
tccatggaca acaacccgaa catcaacgag tgcatcccgt acaactgcct gtccaacccg 3960
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ctggagggcc tgtccaacct gtaccagatc tacgccgagt ccttcaggga gtgggaggcc 4260
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gtgtacgtgc aggccgccaa cctgcacctg tccgtgctga gggacgtgtc cgtgttcggc 4440
cagaggtggg gcttcgacgc cgccaccatc aactccaggt acaacgacct gaccaggctg 4500
atcggcaact acaccgacca cgccgtgagg tggtacaaca ccggcctgga gagggtgtgg 4560
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gtgtcccagc tgaccaggga gatctacacc aacccggtgc tggagaactt cgacggctcc 4740
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taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 6300
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gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 6600
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 6660
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tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt 7500
tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc 7560
ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 7620
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caccctgaac atctccaccc agggctccac caacacctcc atcaacccgg tgaccctgcc 9360
gttcacctcc agggacgtgt acaggaccga gtccctggcc ggcctgaacc tgttcctgac 9420
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cgacgagttc tacctggacg agaagaggga gctgttcgag atcgtgaagt acgccaagca 10320
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atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 10440
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tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 10560
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tgttactaga tcgggaatta aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaac 10678
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgttgaacg gcctcctgta 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 5
cctctcgatg tggatctgct 20
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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ctcgatgtag tggttgacga tggtgcagac cgccggcatg tccgcctcgg tggcacggcg 780
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gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg 3060
aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt 3120
cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt 3180
gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc 3240
ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg 3300
gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat 3360
atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc 3420
tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga 3480
tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg 3540
tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag 3600
gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat 3660
tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat 3720
tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc 3780
cctgccttca tacgctattt attgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt 3840
gtttggtgtt acttctgcag gtcgactcta gaggatccat ggacaacaac ccgaacatca 3900
acgagtgcat cccgtacaac tgcctgtcca acccggaggt ggaggtgctg ggcggcgaga 3960
ggatcgagac cggctacacc ccgatcgaca tctccctgtc cctgacccag ttcctgctgt 4020
ccgagttcgt gccgggcgcc ggcttcgtgc tgggcctggt ggacatcatc tggggcatct 4080
tcggcccgtc ccagtgggac gccttcctgg tgcagatcga gcagctgatc aaccagagga 4140
tcgaggagtt cgccaggaac caggccatct ccaggctgga gggcctgtcc aacctgtacc 4200
agatctacgc cgagtccttc agggagtggg aggccgaccc gaccaacccg gccctgaggg 4260
aggagatgcg catccagttc aacgacatga actccgccct gaccaccgcc atcccgctgt 4320
tcgccgtgca gaactaccag gtgccgctgc tgtccgtgta cgtgcaggcc gccaacctgc 4380
acctgtccgt gctgagggac gtgtccgtgt tcggccagag gtggggcttc gacgccgcca 4440
ccatcaactc caggtacaac gacctgacca ggctgatcgg caactacacc gaccacgccg 4500
tgaggtggta caacaccggc ctggagaggg tgtggggccc ggactccagg gactggatca 4560
ggtacaacca gttcaggagg gagctgaccc tgaccgtgct ggacatcgtg tccctgttcc 4620
cgaactacga ctccaggacc tacccgatca ggaccgtgtc ccagctgacc agggagatct 4680
acaccaaccc ggtgctggag aacttcgacg gctccttcag gggctccgcc cagggcatcg 4740
agggctccat caggtccccg cacctgatgg acatcctgaa ctccatcacc atctacaccg 4800
acgcccacag gggcgagtac tactggtccg gccaccagat catggcctcc ccggtgggct 4860
tctccggccc ggagttcacc ttcccgctgt acggcaccat gggcaacgcc gccccgcagc 4920
agaggatcgt ggcccagctg ggccagggcg tgtacaggac cctgtcctcc accctgtaca 4980
ggaggccgtt caacatcggc atcaacaacc agcagctgtc cgtgctggac ggcaccgagt 5040
tcgcctacgg cacctcctcc aacctgccgt ccgccgtgta caggaagtcc ggcaccgtgg 5100
actccctgga cgagatcccg ccgcagaaca acaacgtgcc gccgaggcag ggcttctccc 5160
acaggctgtc ccacgtgtcc atgttcaggt ccggcttctc caactcctcc gtgtccatca 5220
tcagggcccc gatgttctcc tggatacaca ggtccgccga gttcaacaac atcatcccgt 5280
cctcccagat cacccagatc ccgctgacca agtccaccaa cctgggctcc ggcacctccg 5340
tggtgaaggg cccgggcttc accggcggcg acatcctgag gaggacctcc ccgggccaga 5400
tctccaccct gagggtgaac atcaccgccc cgctgtccca gaggtacagg gtgaggatca 5460
ggtacgcctc caccaccaac ctgcagttcc acacctccat cgacggcagg ccgatcaacc 5520
agggcaactt ctccgccacc atgtcctccg gctccaacct gcagtccggc tccttcagga 5580
ccgtgggctt caccaccccg ttcaacttct ccaacggctc ctccgtgttc accctgtccg 5640
cccacgtgtt caactccggc aacgaggtgt acatcgacag gatcgagttc gtgccggccg 5700
aggtgacctt cgaggccgag tacgacctgg agagggccca gaaggccgtg aacgagctgt 5760
tcacctcctc caaccagatc ggcctgaaga ccgacgtgac cgactaccac atcgaccagg 5820
tgtccaacct ggtggagtgc ctgtccgacg agtgaggtac cgagctcgaa tttccccgat 5880
cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 5940
attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 6000
acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 6060
atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 6120
ttactagatc gggaattcaa gcttgcatgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc 6180
tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt 6240
gtcacacttg tttgaagtgc 6260
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtggctggg cgcgcgctgg atccgcggag gtaggggatg gctccgcggg acccgtgggg 60
ggcagggacg ggaggtaggg gatggcggct gggcgcgcgc gggatccgcg gaagtaggcg 120
atggcggcgc ggaacccgcg gggaacaggg acgggaggta ggggatggcg ggtgcagcgg 180
atcgggagcg gcatgcggct gggcgcgcgc gggatccgcg gaggaagggg atggcggagg 240
agatcttgcg cacctggtag gcgacgaact tggcggggac ggggccgtcg ggggcgccgg 300
agaggagctc ggacagcggg atgtggacct cgccgacgtc gcggtcgcgg agggcgcgct 360
cggcgcggag gagaacatgg agggaggaag gcaccacgcc gctcggcgcg gaggagaaca 420
tggagggcgg acctgagtgg ggtacggacc tgagcggggt gcgcgggggt cacggaggcg 480
ggggcggggg cacggtctac 500
<210> 10
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctttttacta gcgctaaact aactgatatc atcacgatca cgacgatgtg gtgttggtaa 60
tacatgtgcc acgtacgaag catgcatgca agcatggcga gtgtttgatt tggtcaaaca 120
agtcgagggg acgtgcgcat ggactgggtc caattggacc agcagctagc caatggacgg 180
agaaagcttt caatcaggtt caacgtcacg tgatcggcct gtctctgttc cccctctaat 240
ctaacatgct gacattttgt caaagatcgt tacaggagtg gactggccac tgaccatata 300
tgctaccagt gttttgcttt gtttactagt acgtatatgc atgcgtagca ggtgcatgtg 360
gtgttattct tcccatataa tttttcttgg ggtccttttg acttgccgct cctgaccagt 420
tgggtgggta gctagggtat agatcgaggc gaggcagtgt tttttttata cgcataaaag 480
ccctttgttt cctagtagca tacactcctt ctctgctcgt ctctatttat tactcctttc 540
gtttctttta tttatcgctg gatagtgtaa aattgcacta tctagcgata aattaaaaag 600
aaacggagga agtatattat attgggcccg caaccgcaac ccgcagagaa tgttctccca 660
gaaagtcccg tt 672
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acctggtagg cgacgaactt 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggcacaggg cttcaagag 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaccgacgt gaccgactac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatcaaacac tcgccatgct 20
<210> 15
<211> 716
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acctggtagg cgacgaactt ggcggggacg gggccgtcgg gggcgccgga gaggagctcg 60
gacagcggga tgtggacctc gccgacgtcg cggtcgcgga gggcgcgctc ggcgcggagg 120
agaacatgga gggaggaagg caccacgccg ctcggcgcgg aggagaacat ggagggcgga 180
cctgagtggg gtacggacct gagcggggtg cgcgggggtc acggaggcgg gggcgggggc 240
acggtctaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac 300
tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg 360
aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 420
atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 480
tcacacatta ttatggagaa actcgagtca aatctcggtg acgggcagga ccggacgggg 540
cggtaccggc aggctgaagt ccagctgcca gaaacccacg tcatgccagt tcccgtgctt 600
gaagccggcc gcccgcagca tgccgcgggg ggcatatccg agcgcctcgt gcatgcgcac 660
gctcgggtcg ttgggcagcc cgatgacagc gaccacgctc ttgaagccct gtgcct 716
<210> 16
<211> 583
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agaccgacgt gaccgactac cacatcgacc aggtgtccaa cctggtggag tgcctgtccg 60
acgagtgagg taccgagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 120
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 180
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 240
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 300
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt caagcttgca 360
tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt 420
ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgccttttta 480
ctagcgctaa actaactgat atcatcacga tcacgacgat gtggtgttgg taatacatgt 540
gccacgtacg aagcatgcat gcaagcatgg cgagtgtttg att 583

Claims (9)

1.用于检测抗虫转基因玉米AM63的DNA片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.16所示，所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 20180。
2.权利要求1所述的DNA片段在检测抗虫转基因玉米AM63中的应用，所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20180。
3.用于扩增权利要求1所述的DNA片段的特异性引物对，其特征在于，扩增SEQ IDNO.15所示的DNA片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12，扩增SEQ ID NO.16所示的DNA片段的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示。
4.用于检测抗虫转基因玉米AM63的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的特异性引物对。
5.一种检测抗虫转基因玉米AM63的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性引物对进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果；所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO. 20180。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当采用核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为716bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分；
若采用核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示的特异性引物对，对样品DNA进行PCR扩增时，若扩增产物条带大小为583bp，则待测样品含有玉米AM63来源的成分。
7.权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在检测抗虫转基因玉米AM63亲本、后代的植株、组织、种子或其制品中的应用；所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 20180。
8.权利要求3所述的特异性引物对或权利要求4所述的试剂盒在检测抗虫转基因玉米AM63杂种F1的植株、组织、种子或其制品中的应用；所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 20180。
9.一种培养对昆虫具有抗性的玉米的方法，其特征在于，包括种植玉米种子，所述玉米种子为抗虫转基因玉米AM63的种子，所述抗虫转基因玉米AM63保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 20180。
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