CN102604940B - 转基因玉米事件ie034外源插入片段旁侧序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域,具体涉及一种转基因抗虫玉米事件IE034外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明提供的抗虫转基因玉米事件IE034经Southern blot鉴定有一个插入位点,这个插入位点的外源插入片段的5’端旁侧序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供了用于检测该旁侧序列的引物,如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明的转基因抗虫玉米IE034外源插入片段旁侧序列的鉴定适用于对抗虫转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域,具体地,涉及一种转基因玉米IE034外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物,本发明还涉及利用该引物进行转基因玉米检测的方法和试剂盒。
背景技术
虫害(尤其是玉米螟害)会造成玉米的严重减产,抗虫转基因玉米是世界上最早开展的研究性状之一。抗虫基因主要来源于苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫蛋白,其作用机理是使昆虫胃肠产生穿孔,从而使昆虫代谢紊乱而死亡。美国孟山都公司是转基因抗虫玉米研发与应用的领跑者,其开发的抗虫转基因玉米MON810和MON863都已经进入商品化生产多年。在MON810转基因玉米中表达的Cry1Ab蛋白能有效防治玉米螟,在MON863中表达的Cry3Bb对危害玉米根部的害虫有很好的防治效果。先正达公司也开发了表达Cry1Ab蛋白的转基因抗虫玉米BT11和BT176。先锋公司和陶氏公司共同开发了含Cry34和Cry35的抗玉米根部害虫的转基因玉米。我国在上世纪90年代初期就开展了转基因抗虫玉米的研究工作,丁群星等(1993)首次报道了用子房注射法将Bt毒蛋白基因导入玉米;王国英等(1995)用玉米悬浮细胞、愈伤组织和幼胚作受体,通过基因枪轰击法成功地将Bt毒蛋白基因转入玉米细胞,并获得了大量转基因植株;周逢勇等(1998)将Bt杀虫蛋白导入玉米自交系P9-10,外源基因能稳定遗传到转基因植株后代。张艳贞等(2002)对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究。但相对于国外公司开发的抗虫玉米,我国科学家得到的抗虫玉米材料对玉米螟的抗性较低,需进一步得到大量转化体并从中筛选到抗性优良的事件。
抗虫转基因玉米的商业化种植增加了玉米产量,降低了杀虫剂等农药的使用,带来巨大的社会和经济效益。但是,抗虫玉米的长时间种植有可能使昆虫对玉米螟产生抗性。研究发现,种植Bt176玉米地里的玉米螟滞育和滞育后发育延长,这些将加快昆虫对Bt蛋白产生抗性(Christou等,2006)。延缓害虫对转Bt作物产生抗性的策略很多,比如高剂量/庇护所策略、新毒素策略、多基因策略等。最初高剂量/庇护所策略在农业生产中曾成功应用多年,但由于它需要大面积的庇护所,所以对于可用耕地相对匮乏的我国来说该策略还难以推广。因此寻找新型Bt基因对减缓害虫抗性产生具有重要意义。应对昆虫产生抗性好的策略是向玉米中导入不同类型的杀虫基因,或导入多个具有不同作用机制的同类基因。孟山都公司已经研制成功转基因抗虫玉米事件MON89034,在玉米中表达两个相互补充的蛋白Cry2Ab和Cry1A.105,用于防治鳞翅目害虫(James,2010)。孟山都公司和陶氏公司联合开发出的具有更广谱抗性转基因玉米SmartStaxTM含有防治鳞翅目害虫的Cry1F,Cry1a.105和Cry2Ab2基因,防治玉米根虫的Cry34Ab1,Cry35Ab1和Cry3Bb1基因(Gatehous等,2008)。
Cry1Ie是中国农业科学院植物保护研究所发现一新型的Bt基因,能表达一种新型的Bt蛋白。我国科学家的研究结果表明通过多代筛选获得的抗Cry1Ac蛋白的亚洲玉米螟系对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性,而对Cry1Ie没有交互抗性(韩海亮等,2009),在烟草中共表达人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因对抗性棉铃虫有更好的杀虫活性(练云等,2008)。这些结果表明在转基因玉米中共表达Cry1Ac和Cry1Ie将有可能延缓玉米螟产生抗性。
我们将Cry1Ie基因通过农杆菌介导法转入到玉米基因组中,获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034并在进行环境释放阶段的安全评价,今后有可能进入商业化种植。对转基因玉米进行转化事件特异性检测,能更好的对转基因玉米进行监督管理。而外源插入片段的旁侧序列和依据此旁侧序列建立的检测方法,是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因玉米IE034的旁侧序列,并建立鉴定体系以备对此事件的监督管理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因玉米事件IE034外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。
本发明另一目的在于提供一种转基因玉米的PCR检测方法和试剂盒。
本发明的抗虫转基因玉米事件IE034按如下方式获得:
根据玉米密码子偏好性原则设计Cry1Ie序列如SEQ ID NO.2所示,由上海生物工程有限公司合成,连接到载体pUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17,回收2.0kb ubiquitin启动子片段,并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie,回收4.9kb片段并补平。两个片段进行连接,构建载体pUbi-cry1Ie,从而使ubiquitin启动子连到Cry1Ie基因前面。BamHI酶切载体pUbi-cry1Ie,回收6.9kb片段并补平,然后用HindIII部分酶切,回收4.2kb片段。同时,用BstEII酶切质粒p3301,回收11kb片段,并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这11kb片段,回收9kb片段。将4.2kb片段和9kb片段进行连接,构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe,其T-DNA结构图如图1所示。
将载体p3301UbiIe通过冻融法转入农杆菌EHA105中。剥取授粉12天大小为1-1.5mm左右的玉米自交系综31的幼胚,用农杆菌进行侵染。然后再共培养3天,恢复7天后分别用含1.5mg/L,3mg/Lbialaphos的培养基上筛选四轮。筛选得到的愈伤分化成苗,转入土中使转基因植株生长并进行授粉结实。对转基因植株进行PCR鉴定得到抗虫转基因玉米IE034。对转基因玉米进行温室及田间喷施草铵膦以选择阳性苗。
经Southern blot杂交实验及转基因后代基因分离鉴定实验,鉴定所得该转基因阳性植株IE034为一个拷贝。Southern blot杂交结果如图2。对转基因玉米进行温室及田间接玉米螟,表明获得的转基因玉米具有很好的玉米螟抗性。该抗虫转基因玉米事件IE034已于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101)保藏,分类命名为玉米,Zea mays,保藏号为CGMCCNo.5578。
本发明提供了抗虫转基因玉米事件IE034(Zea mays)插入位点的外源插入片段的5’端旁侧序列,其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。
本发明提供了SEQ ID NO.1所示的旁侧序列在检测转基因玉米中的应用。
特定的转基因事件其旁侧序列是特定的,因此,应用旁侧序列可以特异地检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交,或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物,进行PCR扩增,检测特异条带等。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物,根据外源插入片段设计下游特异性引物,扩增特异性片段;或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物,根据3’旁侧序列设计下游特异性引物,扩增特异性片段。
本发明还提供了用于扩增SEQ ID NO.1所示序列的特异性引物。
在本发明的一个实施例中,提取抗虫转基因玉米IE034叶片基因组DNA,利用特异性引物和随机引物进行TAIL-PCR反应,获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界982bp长的序列,包括第1-776共776bp的玉米基因组序列和第777-982共206bp的载体序列,如SEQID No.1所示。分析外源片段整合位点的左边界序列,根据玉米基因组序列信息分别设计特异性上游引物IE034F:5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’(SEQ ID No.4),根据载体p3301UbiIe中T-DNA区5’端CaMV35S polyA序列设计下游鉴定引物IE034R:5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’(SEQ ID No.5)。通过普通PCR扩增可得到312bp特异性片段,包括第1-111共111bp的玉米基因组序列和第112-312共201bp的载体序列(SEQ ID No.3)。
本发明提供了上述引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测转基因玉米事件IE034的方法,其是以样品总DNA为模板,利用本发明提供的引物进行PCR反应,根据PCR产物的电泳片段判断结果。
上述检测转基因玉米事件IE034的方法,20μL PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2μL,10mmol/L dNTP 0.4μL,5U/μl的taq酶0.4μL,玉米总DNA模板1.0μL,10μmol/L上游引物0.4μL,10μmol/L下游引物0.4μL,ddH2O15.4μL;
PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃7min。
PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳进行分离,EB染色后鉴定是否存在特异性条带。如存在特异性扩增产物312bp特异性片段,表明样品中含有IE034来源的成分。
本发明还提供了一种检测转基因玉米事件IE034的检测试剂盒,该试剂盒含有下列引物:
IE034F:5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’,
IE034R:5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’。
本发明提供了上述引物或检测试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
本发明通过TAIL-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件IE034的5’旁侧序列,根据这两个旁侧序列的序列信息,设计两对新的PCR引物并建立针对IE034事件的鉴定方法,通过普通PCR扩增得到了新的即包含载体片段又包含玉米基因组信息的序列。本发明提供的旁侧序列和引物适用于对转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
附图说明
图1是转化载体p3301UbiIe示意图。
图2是转基因玉米IE034基因组DNA Southern blot图片;1,非转基因玉米基因组DNA用EcoRI酶切;2,非转基因玉米基因组DNA用HindIII酶切;3,转基因玉米IE034基因组DNA用EcoRI酶切;4,转基因玉米IE034基因组DNA用HindIII酶切;5,质粒p3301UbiIe用HindIII酶切。
图3是IE034 T3代植株的PCR检测,其中M,DL2000 plus DNAmarker;1-18,转基因植株;19,水;20,非转基因植株;21,质粒p3301Ubile。
图4是转基因玉米IE034 T2代植株Western鉴定图,WT:非转基因玉米;1-3:转基因玉米。
图5是转基因玉米IE034 5’端旁侧序列TAIL-PCR扩增电泳图,M,DL2000 plus DNA marker;1-2,简并引物LAD1-1与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板,用巢式引物AC与特异性引物35S-1进行第二轮Tail-PCR产物;1为非转基因玉米,2为转基因玉米。3-4,分别以泳道1和2对应的PCR产物做模板,用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物;3为非转基因玉米,4为转基因玉米。5,泳道为空白。6-7,简并引物LAD1-2与35S-0第一轮TAIL-PCR扩增的产物做模板,用巢式引物AC与特异性引物35S-1进行第二轮Tail-PCR产物;6为非转基因玉米,7为转基因玉米。8-9,分别以泳道6和7对应的PCR产物做模板,用巢式引物AC与特异性引物35S-2进行第三轮Tail-PCR产物,箭头所指为982bp的条带;8为非转基因玉米,9为转基因玉米。
图6是转基因玉米IE034后代植株定性PCR扩增图,M:DL2000 plusDNA marker;1,水;2,质粒p3301UbiIe;3,非转基因玉米综31(实验室保存);4-5为IE034植株T1代亲本叶片基因组DNA;6,IE034植株亲本T2代叶片基因组DNA;7,IE034植株亲本T3代叶片基因组DNA;8,IE034植株亲本T2代种子DNA;9,IE034植株亲本T3代种子DNA;10,IE034植株杂种F1代基因组DNA。
图7是转基因玉米IE034 PCR检测的敏感性检测结构图,M,DL2000plus DNA marker;1,水;2,质粒p3301UbiIe;3,非转基因玉米综31;4,1μg IE034基因组DNA;5,50ng IE034基因组DNA;6,10ngIE034基因组DNA;7,1ng IE034基因组DNA;8,0.1ng IE034基因组DNA;9,0.01ng IE034基因组DNA。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1抗虫转基因玉米IE034的获得
1、转化载体p3301UbiIe的构建
根据玉米密码子偏好性原则设计Cry1Ie序列如SEQ ID NO.2所示,由上海生物工程有限公司合成,连接到载体pUC57上构建载体pUC57Ie。用PstI酶切质粒pAHC17,回收2.0kb ubiquitin启动子片段,并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。同时用SalI酶切质粒pUC57Ie,回收4.9kb片段并补平。两个片段进行连接,构建载体pUbi-cry1Ie,从而使ubiquitin启动子连到Cry1Ie基因前面。BamHI酶切载体pUbi-cry1Ie,回收6.9kb片段并补平,然后用HindIII部分酶切,回收4.2kb片段。同时,用BstE II酶切质粒p3301,回收11kb片段,并用T4 DNA聚合酶进行两端补平。然后用HindIII酶切这11kb片段,回收9kb片段。将4.2kb片段和9kb片段进行连接,构建成农杆菌转化载体p3301UbiIe,其结构图如图1所示。
2、农杆菌转化玉米幼胚获得转基因植株
将载体p3301UbiIe通过冻融法转化到农杆菌EHA105中,PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料,将幼胚放到D-inf溶液中一个小时后,用D-inf洗一次,再浸入添加100μM乙酰丁香酮的D-inf的农杆菌菌液中,并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干,放到D-AS培养基上,在26℃黑暗条件下共培养3天,并设对照。幼胚洗涤去菌后,放至含1.5mg/L Bialaphos的筛选培养基上,开始筛选培养两周,然后转到含3mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养,每三周继代一次,筛选培养至两个月,有一些愈伤生长状态良好,为抗性愈伤。将以上实验选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基上,3周即可出现胚状体。再转入到分化培养基上进行分化,培养条件为28℃,每日3000Lux光强,光照16小时,很快就会有再生小苗出现。再生的小植株长到3片叶时,可将幼苗移植到罐头瓶中,并在室内培养。待小苗长出新叶及根后,将幼苗从罐头瓶中取出,自来水冲净培养基,移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中。当玉米又长出2-3片新叶时,可将其移入大田或大花盆中,自交获得种子。
3、转基因植株的PCR鉴定
3.1植物总DNA的提取,采用CTAB法快速提取玉米叶片总DNA,具体步骤如下:
(1)取30-50ml离心管,加入7.5ml CTAB提取缓冲液(Tris100mM,NaCl 1.4M,20mM EDTA,2%CTAB,0.1%巯基乙醇),在60℃恒温水浴中预热30min;
(2)取适量玉米叶片置于2ml离心管中,在液氮速冻下利用2000GENO/GRINDER组织磨碎仪将叶片磨成粉末状;
(3)打开离心管,加入700μl CTAB提取缓冲液(Tris 100mM,NaCl 1.4M,20mM EDTA,2%CTAB,0.1%巯基乙醇)。60℃水浴中保温30min,其间轻摇几次;
(4)取出离心管,每管中加入1ml饱和酚,摇动均匀后再加700μl氯仿/异戊醇(24∶1)轻微而彻底地混合,放置10min以上,待蛋白质变性后离心;室温下以12000r/min离心10min;
(5)将上清液转移到新的离心管中,加三分之二体积的异丙醇,混匀,使核酸沉淀成絮状,12000r/min离心5min,弃上清。
(6)在沉淀中加入1ml70%乙醇,用手指轻弹几下,放置20min以上;
(7)12000r/min离心2min,弃上清;
(8)在超净台上吹干沉淀,溶于适量无菌水(100-200μl)中。
(9)将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。
3.2鉴定引物设计
根据Cry1Ie人工改造基因序列信息,设计扩增引物如下
上游引物5’-AACAGCCAGATCAGCACCTT-3’(SEQ ID No.6)
下游引物5’-CTGTACACCAGGGCCTTCAC-3’(SEQ ID No.7)
扩增片段长度为830bp。
3.3PCR扩增体系及反应程序
PCR反应体系:
PCR反应程序:
95℃ 5分钟
72℃ 7分钟
25℃ 保温
以上述体系及程序进行PCR反应,获得转基因阳性植株,结果如图3所示。
4、转基因植株的Western杂交鉴定
4.1玉米叶片总蛋白的提取
1)称取少量叶片于研钵中,加入液氮充分研磨;
2)将粉末转入1.5ml的离心管,加入等体积的1×SDS样品Buffer[50mM Tris·HCl(pH6.8),2%SDS,0.02%溴酚蓝,10%甘油,100mM DTT(现用现加)],振荡;
3)将样品于100℃加热10min,立即置于冰上冷却至室温;
4)12000r/min,4℃离心10min;取上清,-20℃保存备用或直接进行SDS-PAGE电泳。
4.2Western杂交
1)根据凝胶大小,剪一张大小适中的NC膜和6张3M滤纸;
2)将凝胶、NC膜、滤纸在转移缓冲液中浸泡5min;
3)按说明安装好转移装置,赶尽凝胶、滤纸和NC膜之间的气泡,NC膜朝正极方向。
4)20V,室温转移45分钟;
5)转好的NC膜在ddH2O中洗一下;
6)将NC膜正面朝上放入封闭液(TBST+5%脱脂牛奶)中,置摇床上轻轻摇动,于室温下封闭2-3小时;
7)将NC膜转到10ml的TBST溶液中,再加入20μl的一抗(1∶1000),混匀,室温下轻摇1-2hr;
8)用TBST洗膜三次,每次10min;
9)加10ml TBST和二抗1.33μl(1∶7500),混匀,室温轻摇1-2hr;
10)用TBST洗膜三次,每次10min;
11)加10ml辣根过氧化物酶反应缓冲液,混匀,轻轻晃动,显色5min;与X光片一起放到X光片夹中曝光5分钟;
12)X光片在显影液中显色5分钟,用水冲洗后放到定影液中定影。
以上方法对转基因植株进行Western杂交鉴定,结果如图4。
5、转基因植株的Southern blot鉴定
5.1玉米叶片总DNA的提取,采用CTAB法提取高纯度的DNA
1)取30-50ml离心管,加入7.5ml CTAB提取缓冲液(Tris 100mM,NaCl 1.4M,20mM EDTA,2%CTAB,0.1%巯基乙醇),在60℃恒温水浴中预热30min;
2)称取1.0g玉米叶片,在研钵中加液氮研磨成粉末状;
3)将叶片粉末小心刮入离心管的液体中,搅动混匀。在60℃水浴中保温30min,其间轻摇几次;
4)取出离心管,每管中加入1ml饱和酚,摇动均匀后再加入6.5ml氯仿/异戊醇(24∶1)轻微而彻底地混合,放置5min以上,待蛋白质变性后离心;室温下以3000-4000r/min离心10min;
5)将上清液转移到新的离心管中,加三分之二体积的异丙醇,混匀,使核酸沉淀成絮状。
6)将絮状沉淀转移到另一离心管中,加入5-10ml洗液,放置30min以上。
7)弃上清(或低速离心后弃上清),让核酸沉淀在超静台上吹干或用真空泵抽干。
8)用0.5ml TE溶解沉淀后,转移到1.5ml离心管中,用酚/氯仿(1∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次。每次在加入变性液(苯酚等)后要柔和而彻底地混合,放置10min以上后,用12000r/min离心10min,吸出上清。操作时要特别小心,以防吸上蛋白质沉淀;
9)加入RNaseA至终浓度10μg/ml,37℃保温1h;
10)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提一次,吸出上清;
11)在上清中加入7.5mol/L乙酸铵至终浓度2.5mol/L,然后加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,低温下放置10min以上,12000r/min离心10min,弃上清;
12)在沉淀中加入1ml70%乙醇,用手指轻弹几下,放置20min以上;
13)12000r/min离心10min,弃上清;
14)在超净台上吹干沉淀,溶于适量TE或无菌水(50-100μl)中。
15)取2μl DNA溶液,用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量,并对照分子量Marker估测DNA含量。
将提取的DNA于-20℃下冷藏备用。
5.2基因组酶切
将基因组DNA用紫外分光光度计进行定量后,每个样品取80μg进行酶切。
1)EcoRI酶切反应体系:
2)HindIII酶切反应体系:
37℃反应12-16h;然后取5μL进行电泳,电泳缓冲液为1×TAE,EB染色,凝胶成像仪照相,检测酶切是否充分及各样品间亮度是否一致,检测通过后,浓缩酶切产物。
5.3基因探针的标记
将基因片段回收后,用分光光度计进行定量,取1μg回收DNA,定容到16μL,沸水浴煮10min,快速放到冰中,然后快速离心10秒,再放回冰浴中10min,然后加入4μL 5×标记反应液,混匀,37℃反应20h。标记结束后,沸水浴10min,冰上速冻,然后放入-20℃冰箱备用。
5.4酶切产物的电泳
取1μL DNA ladder稀释到20μL,然后加入4μL 6×loadingbuffer混匀后上样,酶切好的样品也依次上样,上样结束后让样品充分沉降3min,然后开始电泳,30V,7h。
5.5转膜
1)电泳结束后,将胶小心从电泳槽中取出,用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪,然后将胶放入0.25N HCl中脱嘌呤10min,
2)将胶从HCl溶液中取出,用ddH2O涮洗两次,然后放入碱变性液(0.5mol/L NaOH)中处理45min可以延长至90min,然后浸到10×SSC中备用。
3)按照胶的大小剪出一张Hybond N+尼龙膜,先用ddH2O充分浸润约10min,再浸泡到10×SSC中,10min以上。
4)将真空转印仪充分洗涤,往多孔载板上泼倒10×SSC,然后将尼龙膜铺到载板中央位置,此步骤应检查尼龙膜与多孔载板间是否存在气泡,如有应小心排除。
5)将带窗口硬塑料纸铺到载板上,使窗口的位置正好与下方尼龙膜的位置一致。
6)往尼龙膜上泼倒10×SSC,然后将胶用手掌小心托起,缓慢移放至完全尼龙膜窗口完全盖住,此步中胶比较脆弱,应小心用力操作。
7)将带窗口硬塑料纸与多孔载板卡紧,往胶上泼倒10×SSC至没过胶,在到10×SSC时,另一只手应轻按胶块以防胶块发生移动。
8)打开真空泵,将真空度调至5inch,转膜70min或者是:一开始2inch一小时后调整至3inch,一小时后调整至55inch 30min。期间按需要补加10×SSC
9)转膜结束后,将尼龙膜浸到2×SSC中轻轻涮洗两次。
10)将湿膜放到紫外交联仪中交联50s,紫外交联仪应是Energy 1500降至600的时间。取出后用干净滤纸包裹备用,如不用可置于4℃保持,建议不要超出一周。
5.6预杂交和杂交
1)预杂交:将试剂盒中的预杂交液65℃水浴化开,取10mL加入到杂交管中,对尼龙膜进行预杂交,42℃,90min;
2)配制杂交液:取1.6μL标记反应液(200ng探针),加入到8mL新预杂交液中,用0.45uM或0.22uM滤膜过滤备用;
3)弃预杂交液,将过滤好的杂交液加入杂交管中,42℃,20h。
5.7洗涤尼龙膜
1)杂交结束后,将杂交液倒出,-20℃冻存。往杂交管中加入50mL2×SSC/0.1%SDS,室温洗涤30min,重复一次;
2)往杂交管中加入66℃预热的50mL 0.5×SSC/0.1%SDS,66℃洗涤60min,重复一次。
5.8尼龙膜的封闭及与抗体反应
1)洗涤结束后,将尼龙膜小心从杂交管中取出,放入盛有wash buffer(马来酸buffer/0.3%Tween20)的大培养皿中,浸泡5min;
2)将尼龙膜放回杂交管中,加入100mL blocking buffer,室温,1h;
3)配制抗体溶液,取1.6μL试剂盒中的抗体,加入到20mL blockingbuffer中,混匀;
4)倒掉杂交管中的blocking buffer,加入抗体溶液,室温,1.5h。
5.9尼龙膜的洗涤及检测
1)抗体反应结束后,将抗体溶液倒掉,往杂交管中加入50mL washbuffer,室温,2h-过夜;
2)将尼龙膜从杂交管中取出,放入盛有detection buffer(Tris,NaCl,pH9.5)的大培养皿中,浸泡5min;
3)将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上,均匀滴加800μL CSPD溶液,将另一侧的尼龙膜平整地覆盖到膜上,轻轻挤走气泡;
4)37℃,温育10min;
5)将尼龙膜铺到暗匣中,在暗室中压上X光胶片,压片2h;
6)洗片:暗室中,依次将胶片放入显影液3min,定影液1min。然后用自来水将胶片充分涮洗后晾干。
实施例2通过TAIL-PCR方法获得抗虫转基因玉米IE034外源基因整合位点5’端旁侧序列
1、抗虫转基因玉米事件IE034总DNA的提取
方法参见实施例1中的5.1。
2、引物设计
根据CaMV35S polyA终止子序列设计特异性引物
35S-0:5’-CGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAAT-3’;(SEQID No.8)
35S-1:5’-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCA-3’;(SEQ ID No.9)
35S-2:5’-GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATA-3’;(SEQ ID No.10)
设计TAIL-PCR随机引物:
LAD1-1:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(T/A/C)N(A/G/C)NNNCCAC-3’(SEQ ID No.11);
LAD1-2:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA’(SEQ ID No.12);
设计巢式引物
AC:5’-ACGATGGACTCCAGAG-3’(SEQ ID No.13)
3、PCR反应
第一轮扩增PCR反应体系:
第二轮扩增PCR反应体系:
第三轮扩增PCR反应体系:
第一轮扩增PCR反应程序
93℃2分钟,95℃1分钟,(94℃30秒,60℃1分钟,72℃3分钟)重复11次;94℃30秒,25℃2分钟,72℃3分钟,(94℃20秒,58℃1分钟,72℃3分钟)重复26次,72℃5分钟。
第二轮扩增PCR反应程序
(94℃20秒,65℃1分钟,72℃3分钟)重复2次;(94℃20秒,68℃1分钟,72℃3分钟,94℃20秒,68℃1分钟,72℃3分钟,94℃20秒,50℃1分钟,72℃3分钟)重复14次,72℃5分钟。
第三轮扩增PCR反应程序
(94℃20秒,68℃1分钟,72℃3分钟,94℃20秒,68℃1分钟,72℃3分钟,94℃20秒,50℃1分钟,72℃3分钟)重复8次,72℃5分钟。
提取抗虫转基因玉米IE034叶片基因组DNA,利用特异性引物和随机引物LAD1-1或LAD1-2进行TAIL-PCR反应。用LAD1-2和特异性引物扩增得到约1kb大小的扩增片段(图5)。将此片段连接到Promega公司的T-easy vector上进行测序,获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界982bp长的序列(SEQ ID No.1),包括第1-776共776bp的玉米基因组序列和第777-982共206bp的载体序列。
实施例3抗虫转基因玉米IE034旁侧序列的应用
利用抗虫转基因玉米IE034的旁侧序列及外源片段中的CaMV35S polyA序列针对两个不同的插入位点分别设计一对引物,建立IE034事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。依据其中一个外源片段中整合位点5’端玉米基因组设计的引物为5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’(SEQ ID No.4),依据CaMV35SpolyA终止子序列设计的引物为5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’(SEQ ID No.5)。
玉米基因组DNA的提取及PCR反应体系依实施例1中的方法。PCR反应程序为95℃5min,(94℃30s,58℃30s,72℃1min)35个循环,72℃7min。用此特异性引物进行PCR扩增时,水、非转基因植株或质粒均无扩增条带,只有转基因植株IE034亲本、杂种F1和后代及其叶片、种子的DNA扩增序列有特异性312bp目的条带(图6),其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。此方法最低检测到的IE034基因组DNA量为1ng(图7),表明该检测方法灵敏度高。试验说明利用转基因玉米事件IE034旁侧序列进行PCR检测,可以特异性地检测转基因玉米事件IE034的亲本、杂种F1和后代及其制品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.抗虫转基因玉米事件(Zea mays)IE034插入位点的外源插入片段的5’端旁侧DNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的DNA在检测转基因玉米中的应用。
3.用于检测权利要求1所述DNA的特异性引物,其核苷酸序列为:
IE034F:5’-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3’,
IE034R:5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’。
4.权利要求3所述的引物在制备检测转基因玉米试剂盒中的应用。
5.一种检测转基因玉米事件IE034的方法,其特征在于,以样品总DNA为模板,利用权利要求书3所述的引物进行PCR反应,根据PCR产物的电泳片段判断结果;若扩增得到312bp的片段,则结果为阳性。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,20μL PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2μL,10mmol/L dNTP0.4μL,5U/μl的taq酶0.4μL,玉米总DNA模板1.0μL,10μmol/L上游引物0.4μL,10μmol/L下游引物0.4μL,ddH2O15.4μL。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共35个循环;72℃7min。
8.一种检测试剂盒,其特征在于,含有权利要求3所述的引物。
9.权利要求3所述引物在检测转基因玉米中的应用。
10.权利要求8所述的试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
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