CN105567682A - 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 - Google Patents

转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属植物生物技术领域，涉及一种抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列及其应用。本发明提供的抗病转基因大豆事件B4J8049经Southern杂交鉴定为单位点插入，该插入位点外源片段右边界旁侧序列见SEQ-1。本发明依据该旁侧序列设计特异性引物见SEQ-5和SEQ-6，建立抗病转基因大豆事件B4J8049特异性PCR检测方法。本发明提供的检测引物和检测方法适用于对该抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品的特异性检测。

Description

转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列及其应用
技术领域
本发明属植物生物技术领域，具体地，涉及一种抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物，本发明还涉及利用该引物对转基因大豆事件B4J8049进行特异性检测的方法和试剂盒。
背景技术
大豆疫霉根腐病（Phytophthorarootrot,PRR）是由大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）引起的一类土传检疫性病害。该病原菌在大豆整个生育期都能侵染大豆并造成危害，导致早期大豆烂种、猝倒和中后期根、茎腐烂。大豆疫霉根腐病在全球各大豆主产区均有发生，每年造成大豆产量损失超过10亿美元，是危害大豆生产的毁灭性病害之一。我国自1989年首次在东北地区分离到该病原菌以来，随着国外大豆品种的不断引入，大豆疫霉根腐病在我国大豆主要产区特别是东北大豆主产区的发生和为害程度逐步加重。一般发病率在5%左右，感病品种一般减产25％-50%，高感品种可达90％以上。严重地块的大豆植株成片枯死，甚至绝产，对我国大豆生产构成巨大的潜在威胁。
大豆疫霉菌为寄主专化性病原菌，属鞭毛菌亚门卵菌纲疫霉属。该病原菌生理小种分化明显，自1965年首次报道1号、2号生理小种以来，目前已报道的大豆疫霉菌生理小种至少有55种以上（LeizRA等，2000），且不同地区的生理小种分布不同。朱正东和马淑梅等（2005）对我国东北地区大豆疫霉菌生理小种分布情况鉴定表明，该地区疫霉菌生理小种组成多样化，包括1号、3号、4号、13号、15号等，其中1号生理小种为优势种群，占鉴定小种数量的60%以上。目前生产上对大豆疫霉菌的防治主要采用种植抗病品种，改进栽培措施和化学防治等方法。由于大豆疫霉根腐病为土传病害，采用化学防治较为困难，且常用的化学杀菌剂如甲霜灵等并不是对所有生理小种都有效。轮作等栽培措施虽然可以在一定程度上减缓病原菌的危害，但并不能够完全控制病害，且在大豆实际生产中应用具有一定的局限性。抗病品种的培育和种植是防治大豆疫霉根腐病最为经济、有效和环境安全的措施。
目前在大豆资源中发现了多个对疫霉根腐病存在小种特异性抗性的大豆品种，携带1个或多个抗性基因如Rps1a、Rps1b、Rps1d、Rps1k、Rps3a、Rps3b、Rps3c、Rps4、Rps5、Rps6、Rps7、Rps8等。由单一抗性基因Rps介导的抗性，在受到病原菌侵染后，通常会引发寄主产生超敏感反应（hypersensitiveresponse，HR），从而对病原产生较强的抗性。但由于单基因控制的抗性极易造成病原生理小种的快速分化，导致新的病原小种产生并对原有抗病品种产生抗性。由于抗源基础狭窄，病原生理小种毒性类型复杂，而且变化很快，新的小种不断出现，利用常规育种方法育成的大豆疫霉根腐病抗病品种的平均使用寿命很短，易出现抗性退化等方面问题。因此，如何进一步拓宽大豆霉根腐病抗源基础，提高大豆抗疫霉根腐病水平及抗性持久性，延缓病原生理小种的进化速度，对于减少大豆病害的发生，提高大豆产量和保护环境等方面均具有重要的意义。
目前国际上利用转基因技术提高大豆疫霉根腐病抗性的研究较少。SumitR.等（2012）报道利用拟南芥非宿主抗性基因pss1转化大豆品种，转基因大豆对疫霉根腐病的抗性显著提高。FanS等（2015年）研究表明，编码抗菌活性蛋白基因Glym4l在大豆中的过量表达可以显著增强转基因大豆抗疫霉根腐病能力。国内郭玉双等（2006）在大豆中过表达菜豆几丁质酶基因chi和大豆核糖体失活蛋白基因rip，获得抗性水平较受体品种明显提高的转基因大豆株系。我们采用转基因技术，将我国自主克隆的广谱抗病基因hrpZPsta按照大豆偏爱性密码子进行人工优化，并导入栽培大豆基因组，获得了一个对疫霉根腐病抗性水平显著提高的转基因大豆事件B4J8049。该转基因大豆事件已进入环境释放，今后有可能进入商业化种植。对转基因事件进行特异性检测，能更好的对转基因植物进行监督管理，而外源插入片段的旁侧序列和根据此旁侧序列建立的检测方法，是对转基因植物及其产品进行有效监督管理的一个重要依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。
本发明的另一目的在于提供一种转基因大豆事件的特异性PCR检测方法和试剂盒。
本发明提供的抗病转基因大豆事件B4J8049按如下方式获得：
根据大豆密码子偏爱性对hrpZPsta基因序列进行人工优化，新序列命名为hrpZm，序列如SEQ-2所示。优化序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并连接到克隆载体pUC-57上，构建载体pUC57-hrpZm。分别用PstI/XbaI双酶切pUC57-Gmubi3和中间载体pTF101-35S，胶回收Gmubi3酶切片段和pTF101-35S酶切大片段，并利用T4DNA连接酶连接，构建中间表达载体pTF101-Gmubi3。采用同样的方法，利用XbaI/SacI双酶切pUC57-hrpZm质粒和中间载体pTF101-Gmubi3，回收hrpZm酶切片段和pTF101-Gmubi3酶切大片段，构建植物表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZm。载体中目的基因hrpZm位于大豆组成型强启动子Gmubi3下游，终止子为nos。构建载体结构如图1所示。
采用冻融法将pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒转入农杆菌EHA101。利用浸泡24小时的大豆种子作为外植体。沿大豆种脐部位将大豆种子剖开，并在子叶节位置轻微划伤处理后，用携带载体质粒的农杆菌进行侵染。共培养4天后，在含6mg/L草丁膦的诱导培养基上进行连续3轮筛选培养。筛选获得的抗性芽经诱导伸长和生根后再生为完整的小植株。再生苗移栽至温室中开花、结实。经连续多代PCR检测和田间除草剂（BASTA）喷施筛选，获得转基因大豆事件B4J8049。
采用Southern杂交检测及转基因后代外源片段分离比例分析，确定该转基因事件外源片段为单拷贝插入。Southern杂交检测结果如图2所示。连续多代接种疫霉菌结果表明，转基因事件B4J8049对大豆疫霉根腐病具有较好的抗性。
本发明提供了抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段右边界旁侧序列，
其具有SEQ-1所示的序列或其特异性片段或互补于该序列的序列。
本发明提供了SEQ-1所示序列在检测抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中的应用。
鉴于独立转基因事件中，外源T-DNA片段在植物基因组中的整合具有随机性的特点，不同转基因事件其外源片段在基因组中的插入位点不同。对于特定的转基因事件来说，其旁侧序列是特异的。因此，应用插入片段旁侧序列可以对转基因事件进行特异性检测。如利用包含部分旁侧序列和部分外源插入片段序列的探针进行杂交，或是设计包含部分旁侧序列和部分外源插入片段序列的特异性引物进行PCR扩增等。可以根据5’端旁侧序列设计上游引物，外源插入片段序列设计下游引物，扩增特异性片段；或是根据外源插入片段序列设计上游引物，3’端旁侧序列设计下游引物，扩增特异性片段。
本发明还提供了用于扩增SEQ-1所示序列的特异性引物。
在本发明提供的一个实施例中，提取转基因大豆事件B4J8049叶片基因组DNA，利用特异性引物和高简并性随机引物进行TAIL-PCR扩增，获得外源片段在转基因大豆基因组中整合位点的右边界1027bp序列。包括第1—993bp大小为993bp的大豆基因组序列和第994—1027bp大小为34bp的外源片段序列，如SEQ-1所示序列。分析外源片段整合位点的右边界序列，根据插入片段右边界左侧序列（T-DNA区内）设计特异性上游引物B4J8049F:5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’（SEQ-5）；根据大豆基因组序列设计特异性下游引物B4J8049R:5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’（SEQ-6）。利用PCR反应进行扩增，获得1010bp特异性片段，包括第1—976bp大小为976bp的大豆基因组序列和第977—1010bp大小为34bp的外源片段序列（SEQ-7）。
本发明提供了上述引物在制备检测转基因大豆试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测转基因大豆事件B4J8049的方法，以大豆样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。
上述检测转基因大豆事件B4J8049的方法，其PCR反应体系（25uL）为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/LdNTPs0.5uL,5U/uLTaq酶0.5uL，大豆样品总DNA1.0uL，10umol/L上游引物0.5uL，10umol/L下游引物0.5uL，ddH2O19.5uL。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s,58℃30s,72℃1.5min，共35个循环；72℃10min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，并利用EB进行染色，以鉴定是否存在特异性扩增条带。如出现1010bp特异性扩增条带，则表明样品中含有来源于B4J8049的成分。
本发明还提供了一种检测转基因大豆事件B4J8049的检测试剂盒，该试剂盒含有下列引物：
B4J8049F:5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’（SEQ-5）
B4J8049R:5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’（SEQ-6）
本发明提供了上述引物或试剂盒在检测抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中的应用。
本发明获得了抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁侧序列，并建立了该转化事件及其衍生产品的特异性PCR检测方法，为转基因大豆及其产品检测提供依据。
附图说明：
图1.植物表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZm
图2.转基因大豆事件B4J8049Southern杂交检测结果.A，HindIII酶切转基因大豆和对照非转基因大豆基因组DNA；B,XbaI酶切转基因大豆和对照非转基因大豆基因组DNA.1,DNAmarker(15K)；2，阳性对照pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒；3，对照非转基因大豆；4，转基因大豆事件B4J8049
图3.T3代转基因大豆B4J8049单株PCR检测结果.1，DNAmarker(2K)；2，阳性对照pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒；3，对照非转基因大豆；4-12，转基因大豆B4J8049单株
图4.转基因大豆B4J8049外源片段右边界旁侧序列PCR检测结果.1，DNAmarker(2K)；2,阳性对照pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒；3,对照非转基因大豆；4,转基因大豆B4J8049.
图5.转基因大豆B4J8049特异性PCR检测结果.1，DNAmarker(15K)；2，非转基因大豆吉育47（常规品种）叶片基因组DNA;3，非转基因大豆吉育47种子基因组DNA；4，B4J8049叶片基因组DNA；5，B4J8049种子基因组DNA。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1.抗病转基因大豆事件B4J8049的获得
1.转化载体pTF101-Gmubi3-hrpZm的构建
根据大豆密码子偏爱性设计hrpZPsta基因序列如SEQ-2所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并连接到克隆载体pUC-57上，构建载体pUC57-hrpZm。分别用PstI/XbaI双酶切pUC57-Gmubi3和中间载体pTF101-35S，胶回收Gmubi3酶切片段和pTF101-35S酶切大片段，T4DNA连接酶连接，构建中间表达载体pTF101-Gmubi3。在此基础上，利用XbaI/SacI双酶切pUC57-hrpZm质粒和中间载体pTF101-Gmubi3，回收hrpZm酶切片段和pTF101-Gmubi3酶切大片段，构建植物表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZm，其结构如图1所示。
2.转基因大豆植株的获得
采用冻融法将pTF101-Gmubi3-hrpZm质粒转入农杆菌EHA101。利用浸泡24小时的大豆种子作为外植体。沿种脐部位将大豆种子剖开，并在子叶节位置轻微划伤处理后，用携带载体质粒的农杆菌进行侵染30min。侵染后的外植体转移至共培养基中，于23℃条件下暗培养4天。然后将外植体转移至含6mg/L草丁膦的诱导培养基中，于25℃，16/8h光/暗条件下培养4—8周左右，且每2周继代1次。诱导培养4—6周后即有抗性芽出现。将抗性芽转移至芽伸长培养基中培养，培养条件为25℃，16/8h光/暗周期。待抗性芽长至3—5cm时，即转移至生根培养基中培养，2—3周后转移至温室中生长结实。
3.转基因植株PCR鉴定
3.1总DNA提取
利用天根DNA提取试剂盒（DP304-02）提取大豆基因组DNA。
（1）取植株叶片100mg于1.5mL离心管中，液氮速冻后，用玻璃杵充分研磨。将研磨好的粉末加入700μL预热缓冲液GP1(含0.1%巯基乙醇)，迅速颠倒均匀，65℃水浴20min。
（2）加入700μL氯仿，充分均匀，12000rpm离心5min。
（3）将上层水相转入一个新的1.5mL离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分均匀。
（4）将均匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。
（5）向吸附柱CB3中加入缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。
（7）将吸附柱CB3放回收集管，12000rpm离心2min，倒掉废液。
（8）将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，然后转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间滴加50-100μLddH2O，室温放置5min。
（9）12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存待用。
3.2PCR检测引物设计
根据目的基因hrpZm及上游启动子Gmubi3序列设计引物如下：
上游引物：5’-ATTACCCGTGTCATAGGCACCAAG-3’（SEQ-3）
下游引物：5’-CGCATTATCAGCAGACGCTCC-3’（SEQ-4）
扩增片段大小为1091bp。
3.3PCR扩增体系及反应程序
PCR反应体系：
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTPs(10mM) 0.5μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
基因组DNA 1μL
Taq酶(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 18.5μL
总体积25μL
PCR反应程序：
以上述体系及程序进行PCR反应，获得转基因阳性植株，结果如图3所示。
4.转基因植株Southern杂交鉴定
4.1大豆基因组总DNA大量提取
采用高盐CTAB法提取高纯度大豆基因组DNA。
（1）取1—2g大豆叶片，在液氮下研磨至粉末状，装入50mL离心管中。
（2）依次加入5mL提取液A（100mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.35mol/L山梨醇，5mmol/LEDTA，pH8.0，1%2-巯基乙醇），3.5mL提取液B（50mmol/LTris-HCl，pH8.0，4.0mol/LNaCl，1.8%CTAB，25mmol/LEDTA，pH8.0），0.3mL30%月桂酰肌氨酸钠和2%PVP-360，55℃下温育60～90分钟，期间轻摇几次。
（3）取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒轻摇15分钟，然后常温下离心10分钟（13000rpm）。
（4）吸取上清液，加入2/3体积预冷的混合有上清液1/10体积的乙酸钠的异丙醇，4℃10000g离心20分钟。
（5）弃上清，用冷75％乙醇漂洗。空气中干燥DNA至表面干燥后，用200uLddH2O溶解。
（6）加入5uLRNase（10mg/mL），37℃温育40分钟。
（7）转移溶液至一个2mL离心管，并用等体积的酚/氯仿抽提。室温下13000rpm离心10分钟。
（8）转移上清至一个新的1.5mL离心管，并用等体积预冷的100％氯仿沉淀。室温下13000rpm离心10分钟。
（9）转上清至新的2mL离心管，用两倍体积冷的无水乙醇（混合1/10体积乙酸钠）沉淀DNA，然后于-20℃放置30分钟。
（10）13000rpm离心离心15分钟，75％乙醇漂洗2次后，于空气中干燥15-20分钟。
（11）50～100uLddH2O溶解DNA。紫外分光光度计（QuawellQ5000）测定DNA浓度后，于-20℃保存备用。
4.2基因组DNA酶切
（1）基因组DNAHindIII酶切体系（NEB公司高浓度HindIII酶）
基因组DNA 50uL（50ug）
10×酶切缓冲液 8uL
HindIII（100U/uL） 2uL
ddH2O 20uL
总体积 80uL
（2）基因组DNAXbaI酶切体系（NEB公司高浓度XbaI酶）
基因组DNA 50uL（50ug）
10×酶切缓冲液 8uL
XbaI（15U/uL） 12uL
ddH2O 10uL
总体积 80uL
上述反应体系于37℃保温12-16小时，取2uL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切反应是否完全。
4.3外源目的基因探针标记
采用DIG试剂盒（Roche）标记探针。
（1）将外源目的基因hrpZm片段回收后，用分光光度计进行定量。
（2）取1.0ug回收DNA，加ddH2O至16uL。沸水浴煮5min，迅速置于冰上。
（3）加入4uLDIG试剂盒5×标记反应液，混匀，5000rpm离心5s。37℃孵育20小时。
（4）标记结束后，65℃加热10min终止反应，然后放入-20℃冰箱保存备用。
4.4基因组DNA酶切产物电泳
在基因组DNA酶切产物中加入适量的6×上样缓冲液，依次将DNA标准分子量和样品加入到点样孔内。上样结束后，样品沉降1min后接通电泳仪电源。30V电泳过夜。
4.5DNA转移及固定
（1）电泳结束后，将凝胶小心从电泳槽中取出。凝胶电泳成像后，用ddH2O漂洗凝胶，然后放入0.25NHCI脱嘌呤液，室温浸泡10-15min。
（2）倒掉脱嘌呤液，用ddH2O漂洗2次，然后放入碱变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中处理30min。
（3）倒掉变性液，用ddH2O漂洗2次，然后放入中和液（0.5mol/LTris-HCl，PH7.0，1.5mol/LNaCl）中处理30min。
（4））倒掉中和液，用ddH2O漂洗3次。将凝胶置于20×SSC溶液中，轻缓振荡10min。
（5）裁取大小合适的HybondN+尼龙膜（10cm×15cm），用铅笔在膜顶端做好标记。将膜在ddH2O中完全浸湿后，浸泡在20×SSC中备用。
（6）安装转膜装置及转膜。从下到上依次为：盛放20×SSC溶液的盒子，1层用作桥联的普通滤纸，3层经20×SSC浸湿的普通滤纸（Whatman），凝胶（点样孔朝下），HybondN+尼龙膜（有标记的一面朝下），3层经20×SSC浸湿的普通滤纸；4层干的普通滤纸，80层干的与膜大小一致的普通滤纸，500g重物。室温转膜12-24小时。
（7）转膜完成后，轻缓拆除转膜装置。在揭去凝胶之前，用铅笔将点样孔和DNA分子量Marker位置标注在膜上。
（8）在膜下垫一层经10×SSC浸湿的Whatman滤纸，紫外交联仪1200U固定1min。
（9）紫外交联后，用ddH2O漂洗膜2次，然后用干净滤纸包裹备用。如不用可置于4℃冰箱保存，不超过1周。
4.6预杂交和杂交
（1）制备杂交液：向DIGEasyHybGranules中加入64mLddH2O，置于37℃水浴直至完全溶解。
（2）按10mL/100cm2膜，将适量预杂交液预热至杂交温度42℃，将膜置于杂交管中，结合DNA面朝上。加入预杂交液，轻缓振荡，预杂交30min以上。
（3）按25ng/mL预杂交液，将适量探针煮沸变性5min，立即置于冰上冷却后，稍微离心。
（4）将变性后的探针加入预热的预杂交液中即成杂交液（3.5mL杂交液/100cm2膜），混匀，避免产生泡沫。
（5）倒出预杂交液，加入杂交液，杂交4—24小时。
4.7洗膜
（1）杂交结束后，将膜置于2×SSC，0.1%SDS溶液中，15-25℃持续振荡洗膜5-10min，共2次。
（2）将足量0.5×SSC，0.1%SDS溶液预热至65℃，在洗膜温度下持续振荡洗膜15-20min，共2-3次。
4.8尼龙膜封闭与抗体反应
（1）洗涤结束后，将尼龙膜小心从杂交管中取出，放入盛有washingbuffer（马来酸缓冲液，0.3%Tween20）的大培养皿中，浸泡5min。
（2）将尼龙膜放回杂交管中，加入100mLblockingbuffer，室温下封闭1小时。
（3）配制抗体溶液，取1.6uL试剂盒中的抗体，加入到20mLblockingbuffer中，混匀。
（4）倒掉杂交管中的blockingbuffer，加入抗体溶液，室温下孵育1.5小时。
4.9尼龙膜洗涤与显色
（1）抗体反应结束后，将抗体溶液倒掉，向杂交管中加入50mLwashingbuffer，洗膜2次，每次15min。
（2）倒掉washingbuffer，将尼龙膜从杂交管中取出，加入20mL检测缓冲液（0.1mol/LTris-HCl，0.1mol/LNaCl，PH9.5），室温放置5min。
（3）倒掉检测缓冲液，加入10mL新配制显色溶液（加40uLNBT/BCIP至2mL检测缓冲液）中，避光显色2小时。
（4）显色完成后照相，然后在室温下晾干，用保鲜膜包裹后，于4℃保存。
实施例2.利用TAIL-PCR获得转基因大豆事件B4J8049插入片段右边界旁侧序列
1．转基因大豆事件B4J8049总DNA提取
具体方法参加实施例1中的4.1。
2．引物设计
根据转化载体pTF101-Gmubi3-hrpZmT-DNA区右边界（RB）左侧序列（位于T-DNA区内）设计特异性引物：
101RB-0a：5’-ACGTGGTTAAACAAATGCAGAAAATCGACGTCGTC-3’
101RB-1a：5’-AGTAGACTGACAAATAAATTACCTGACAACATCGTTTCAC-3’
101RB-2a：5’-CACAAAAAGGGAGTGCATTTTCCAGGGC-3’
设计TAIL-PCR高简并性随机引物：
LAD-1：5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA-3’
LAD-2：5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(T/A/C)N(A/G/C)NNNCCAC-3’
设计巢式引物：
Ac1：5’-ACGATGGACTCCAGAG-3’
3．PCR扩增反应
3.1第一轮PCR反应体系及程序
第一轮PCR反应体系：
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTPs (10mM) 0.5μL
LAD1(10μM) 2.5μL
LAD2(10μM) 2.5μL
101RB-0a(10μM) 0.75μL
基因组DNA（50ng/uL） 1μL
Taq酶(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 14.75μL
总体积25μL
第一轮PCR反应程序：93℃2分钟；95℃1分钟；（94℃30秒，60℃1分钟，72℃3分钟）重复10次；94℃30秒；25℃2分钟；72℃3分钟；（94℃20秒，60℃1分钟，72℃3分钟）重复25次；72℃5分钟。
3.2第二轮PCR反应体系及程序
第二轮PCR反应体系：
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTPs (10mM) 0.5μL
Ac1(10μM) 0.75μL
101RB-1a(10μM) 0.75μL
第一轮扩增产物稀释50倍 1.0μL
Taq酶(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 19.0μL
总体积25μL
第二轮PCR反应程序：（94℃20秒；68℃1分钟；72℃3分钟；94℃20秒；68℃1分钟；72℃3分钟；94℃20秒；50℃1分钟；72℃3分钟）重复12次；72℃5分钟。
3.3第三轮PCR反应体系及程序
第三轮PCR反应体系：
10×PCR缓冲液 2.5μL
dNTPs (10mM) 0.5μL
Ac1(10μM) 0.75μL
101RB-2a(10μM) 0.75μL
第二轮扩增产物稀释10倍 1.0μL
Taq酶(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 19.0μL
总体积25μL
第三轮PCR反应程序：（94℃20秒；68℃1分钟；72℃3分钟；94℃20秒；68℃1分钟；72℃3分钟；94℃20秒；50℃1分钟；72℃3分钟）重复7次；72℃5分钟。
提取转基因大豆事件B4J8049叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物组LAD1/LAD2进行连续三轮PCR扩增，获得大小约1000bp扩增片段。将扩增片段连接到GENSTAR公司的EZ-T克隆载体中进行测序。测序结果检索大豆基因组数据库（http://soybase.org/），获得外源片段在大豆基因组整合位点右边界1027bp序列，包括第1—993bp大小为993bp的大豆基因组序列和第994—1027bp大小为34bp的外源片段序列，如SEQ-1所示序列。
实施例3抗病转基因大豆事件B4J8049旁侧序列的应用
根据抗病转基因大豆事件B4J8049旁侧序列及外源片段右边界左侧序列（T-DNA区内），设计特异性上游引物B4J8049F:5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’（SEQ-5）；根据大豆基因组序列设计特异性下游引物B4J8049R:5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’（SEQ-6）。
大豆基因组DNA提取及PCR反应体系依实施例1中的方法。PCR扩增程序95℃5分钟；（94℃30秒，58℃30秒，72℃1.5分钟）35个循环；72℃10分钟。用此特异性引物进行PCR扩增时，非转基因植株或质粒均无扩增条带，只有转基因大豆B4J8049植株叶片和种子DNA产生1010bp特异性扩增条带（图4和图5），其核苷酸序列如SEQ-1所示。本实验说明利用转基因大豆事件B4J8049旁侧序列进行PCR检测，可以特异性地检测样品中是否含有来源于B4J8049的成分。
以上所述仅是本发明优选的实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
SEQ-1序列：
1CGGCCGCCGAAAACCACGACGCCGTCAACAATGGTGAACAACACCACCACCACTTCGCCA
61GAAGAAACAACACCCAGTGGTCGCAAAAGCAGCAAAGCGCAAGAGAAGACGAGAGGAACG
121CGGAAGAAGATGAACTGAGCTCGCGGAACAGAAGAACAGGAACACGGAAAAGAAGAGGAA
181TAGGCGTTGGGTGCACAAATTTTTAAAAAAAACCACAGGGGTATTTACGTATTTTCACAT
241AAACTGTTGGGTGCACCTAGCAACAGCCTAGGGAAAAGTGTCATCTTGTATGTTTCTGAA
301AAAATAACGGGGTGAGAATAGCAACTCCCTCGTGGTTTTCAGCATAATATGGGCCAACTC
361AATCTTCAATAGGTGCTAGCCCGTTAACTAAGATGAGTCCTAGCCTAGTTGAAGCTTTGT
421CTATTATATATTTGTCCTTTAGTGCACAAGGCAGTGGGAAGGATGAAGAAGCTTCCCAGA
481CGGTGCCAAACATACTACTAGACGACAAAAGGTTCATATCCCTTTGGACCTCTTGCCTCT
541TTCTACATCCAACTAGGTTTACCATTGACAAAGATGTTTCTTAACTATGCTCATTTTTTA
601TACATATATTTAAAAATTGAGTACGATATCAACTCATTTATAATACTCAATCAATTAATT
661ATGTTCATTAAACTAGTATATCTTTATTTAATTTAAACAAATAATTTATTAGATTCGGAC
721CACTAAATAGACGGCGGCGAGCATGTATCATGATTATGTATGGAGCAAAAGGAGCTAGAA
781AACTTGGTGATCAAGTATAGACGTAAGTAGATTCCATTTCATAATATTGTGACCAAAGGA
841AAATTTCAAGGACCAAAAGATGGAGAAAATCTTTTTCAAATCATATCCATAAGCAGACAA
901ACTAGCACGAGGGCTTGATTCTTAACAAAAATCATTATTATTTTAAGTCAACAGTTAGTA
961GAAATTCTAACGCAAATCAAGTGTTCACACTGATCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGG
1021CGGGAAA
SEQ-2序列：
1ATGCAAAGCCTTAGTTTGAACTCTTCTACTCTGCAATCCCCTGCAATGGCACTAGTTCTC
61ATCAGGCCCGAAACCGAAACAACTGGTCCATCTACGAGTTCAAGAGCCCTTCAAGAGGTC
121ATTGCCCAGCTCGCACAAGAGTTGACTCACAATGGGCAGCTTGATGAAAGTAGCCCTCTG
181GGAAAGCTGTTGGGAAAGGCAATGGCAGCCTCAGGTAAGGCTGGAGGCGGACTCGAGGAC
241ATTAAGGCAGCTTTGGACACCTTAATACACGAAAAGTTGGGTGACAACTTCGGAGCGTCT
301GCTGATAATGCGAGTGATACCGGCCAGCCTGATTTAATGACTCAAGTCTTAAACGGCCTG
361GCCAAGTCAATGCTCAATGATTTGTTAACCCGGCCTCGTCAGCAACAGCAGTTTCAATGG
421TGA
SEQ-3序列：5’-ATTACCCGTGTCATAGGCACCAAG-3’
SEQ-4序列：5’-CGCATTATCAGCAGACGCTCC-3’
SEQ-5序列：5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’
SEQ-6序列：5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’
SEQ-7序列：
1GACGCCGTCAACAATGGTGAACAACACCACCACCACTTCGCCAGAAGAAACAACACCCAG
61TGGTCGCAAAAGCAGCAAAGCGCAAGAGAAGACGAGAGGAACGCGGAAGAAGATGAACTG
121AGCTCGCGGAACAGAAGAACAGGAACACGGAAAAGAAGAGGAATAGGCGTTGGGTGCACA
181AATTTTTAAAAAAAACCACAGGGGTATTTACGTATTTTCACATAAACTGTTGGGTGCACC
241TAGCAACAGCCTAGGGAAAAGTGTCATCTTGTATGTTTCTGAAAAAATAACGGGGTGAGA
301ATAGCAACTCCCTCGTGGTTTTCAGCATAATATGGGCCAACTCAATCTTCAATAGGTGCT
361AGCCCGTTAACTAAGATGAGTCCTAGCCTAGTTGAAGCTTTGTCTATTATATATTTGTCC
421TTTAGTGCACAAGGCAGTGGGAAGGATGAAGAAGCTTCCCAGACGGTGCCAAACATACTA
481CTAGACGACAAAAGGTTCATATCCCTTTGGACCTCTTGCCTCTTTCTACATCCAACTAGG
541TTTACCATTGACAAAGATGTTTCTTAACTATGCTCATTTTTTATACATATATTTAAAAAT
601TGAGTACGATATCAACTCATTTATAATACTCAATCAATTAATTATGTTCATTAAACTAGT
661ATATCTTTATTTAATTTAAACAAATAATTTATTAGATTCGGACCACTAAATAGACGGCGG
721CGAGCATGTATCATGATTATGTATGGAGCAAAAGGAGCTAGAAAACTTGGTGATCAAGTA
781TAGACGTAAGTAGATTCCATTTCATAATATTGTGACCAAAGGAAAATTTCAAGGACCAAA
841AGATGGAGAAAATCTTTTTCAAATCATATCCATAAGCAGACAAACTAGCACGAGGGCTTG
901ATTCTTAACAAAAATCATTATTATTTTAAGTCAACAGTTAGTAGAAATTCTAACGCAAAT
961CAAGTGTTCACACTGATCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAA
序列表
SEQ-1序列：
1CGGCCGCCGAAAACCACGACGCCGTCAACAATGGTGAACAACACCACCACCACTTCGCCA
61GAAGAAACAACACCCAGTGGTCGCAAAAGCAGCAAAGCGCAAGAGAAGACGAGAGGAACG
121CGGAAGAAGATGAACTGAGCTCGCGGAACAGAAGAACAGGAACACGGAAAAGAAGAGGAA
181TAGGCGTTGGGTGCACAAATTTTTAAAAAAAACCACAGGGGTATTTACGTATTTTCACAT
241AAACTGTTGGGTGCACCTAGCAACAGCCTAGGGAAAAGTGTCATCTTGTATGTTTCTGAA
301AAAATAACGGGGTGAGAATAGCAACTCCCTCGTGGTTTTCAGCATAATATGGGCCAACTC
361AATCTTCAATAGGTGCTAGCCCGTTAACTAAGATGAGTCCTAGCCTAGTTGAAGCTTTGT
421CTATTATATATTTGTCCTTTAGTGCACAAGGCAGTGGGAAGGATGAAGAAGCTTCCCAGA
481CGGTGCCAAACATACTACTAGACGACAAAAGGTTCATATCCCTTTGGACCTCTTGCCTCT
541TTCTACATCCAACTAGGTTTACCATTGACAAAGATGTTTCTTAACTATGCTCATTTTTTA
601TACATATATTTAAAAATTGAGTACGATATCAACTCATTTATAATACTCAATCAATTAATT
661ATGTTCATTAAACTAGTATATCTTTATTTAATTTAAACAAATAATTTATTAGATTCGGAC
721CACTAAATAGACGGCGGCGAGCATGTATCATGATTATGTATGGAGCAAAAGGAGCTAGAA
781AACTTGGTGATCAAGTATAGACGTAAGTAGATTCCATTTCATAATATTGTGACCAAAGGA
841AAATTTCAAGGACCAAAAGATGGAGAAAATCTTTTTCAAATCATATCCATAAGCAGACAA
901ACTAGCACGAGGGCTTGATTCTTAACAAAAATCATTATTATTTTAAGTCAACAGTTAGTA
961GAAATTCTAACGCAAATCAAGTGTTCACACTGATCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGG
1021CGGGAAA
SEQ-2序列：
1ATGCAAAGCCTTAGTTTGAACTCTTCTACTCTGCAATCCCCTGCAATGGCACTAGTTCTC
61ATCAGGCCCGAAACCGAAACAACTGGTCCATCTACGAGTTCAAGAGCCCTTCAAGAGGTC
121ATTGCCCAGCTCGCACAAGAGTTGACTCACAATGGGCAGCTTGATGAAAGTAGCCCTCTG
181GGAAAGCTGTTGGGAAAGGCAATGGCAGCCTCAGGTAAGGCTGGAGGCGGACTCGAGGAC
241ATTAAGGCAGCTTTGGACACCTTAATACACGAAAAGTTGGGTGACAACTTCGGAGCGTCT
301GCTGATAATGCGAGTGATACCGGCCAGCCTGATTTAATGACTCAAGTCTTAAACGGCCTG
361GCCAAGTCAATGCTCAATGATTTGTTAACCCGGCCTCGTCAGCAACAGCAGTTTCAATGG
421TGA
SEQ-3序列：5’-ATTACCCGTGTCATAGGCACCAAG-3’
SEQ-4序列：5’-CGCATTATCAGCAGACGCTCC-3’
SEQ-5序列：5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’
SEQ-6序列：5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’
SEQ-7序列：
1GACGCCGTCAACAATGGTGAACAACACCACCACCACTTCGCCAGAAGAAACAACACCCAG
61TGGTCGCAAAAGCAGCAAAGCGCAAGAGAAGACGAGAGGAACGCGGAAGAAGATGAACTG
121AGCTCGCGGAACAGAAGAACAGGAACACGGAAAAGAAGAGGAATAGGCGTTGGGTGCACA
181AATTTTTAAAAAAAACCACAGGGGTATTTACGTATTTTCACATAAACTGTTGGGTGCACC
241TAGCAACAGCCTAGGGAAAAGTGTCATCTTGTATGTTTCTGAAAAAATAACGGGGTGAGA
301ATAGCAACTCCCTCGTGGTTTTCAGCATAATATGGGCCAACTCAATCTTCAATAGGTGCT
361AGCCCGTTAACTAAGATGAGTCCTAGCCTAGTTGAAGCTTTGTCTATTATATATTTGTCC
421TTTAGTGCACAAGGCAGTGGGAAGGATGAAGAAGCTTCCCAGACGGTGCCAAACATACTA
481CTAGACGACAAAAGGTTCATATCCCTTTGGACCTCTTGCCTCTTTCTACATCCAACTAGG
541TTTACCATTGACAAAGATGTTTCTTAACTATGCTCATTTTTTATACATATATTTAAAAAT
601TGAGTACGATATCAACTCATTTATAATACTCAATCAATTAATTATGTTCATTAAACTAGT
661ATATCTTTATTTAATTTAAACAAATAATTTATTAGATTCGGACCACTAAATAGACGGCGG
721CGAGCATGTATCATGATTATGTATGGAGCAAAAGGAGCTAGAAAACTTGGTGATCAAGTA
781TAGACGTAAGTAGATTCCATTTCATAATATTGTGACCAAAGGAAAATTTCAAGGACCAAA
841AGATGGAGAAAATCTTTTTCAAATCATATCCATAAGCAGACAAACTAGCACGAGGGCTTG
901ATTCTTAACAAAAATCATTATTATTTTAAGTCAACAGTTAGTAGAAATTCTAACGCAAAT
961CAAGTGTTCACACTGATCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAA

Claims (10)

1.抗病转基因大豆事件B4J8049外源插入片段右边界旁侧序列，其特征在于：具有SEQ-1所示的序列或其特异性片段或互补于该序列的序列。
2.权利要求1所述的序列在检测抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中的应用。
3.用于检测权利要求1所示序列的特异性引物。
4.如权利要求3所述的引物，其核苷酸序列为：
B4J8049F:5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAG-3’（SEQ-5）
B4J8049R:5’-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3’（SEQ-6）。
5.权利要求3和4所述的引物在制备检测转基因大豆试剂盒中的应用。
6.一种检测转基因大豆事件B4J8049的方法，其特征在于：以样品总DNA为模板，利用权利要求3或4所述的引物进行PCR反应，根据PCR产物的电泳片段判断结果。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：25uLPCR反应体系为：10×PCR缓冲液2.5uL，10mmol/LdNTPs0.5uL,5U/uLTaq酶0.5uL，大豆样品总DNA1.0uL，10umol/L上游引物0.5uL，10umol/L下游引物0.5uL，ddH2O19.5uL。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s,58℃30s,72℃1.5min，共35个循环；72℃10min。
9.一种检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求3或4所述的引物。
10.权利要求3或4所述的引物或权利要求9所述的试剂盒在抗病转基因大豆事件B4J8049包括亲本、衍生品系或品种，及其制品包括植株、组织、种子及产品中的应用。
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