CN101939437A - 对应于转基因事件mon87769的大豆植物和种子及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转基因大豆事件MON87769以及包含可判断该大豆事件的DNA的细胞、种子和植物。本发明还提供了包含可判断样品中所述大豆事件的核苷酸序列的组合物，用于检测样品中所述大豆事件核苷酸序列的存在的方法，用于检测可判断样品中所述大豆事件的存在的核苷酸序列的引物和探针，培育这种大豆事件的种子成为大豆植物的方法，和产生包含可判断该大豆事件的DNA的大豆植物的育种方法。

Description

对应于转基因事件MON87769的大豆植物和种子及其检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2008年2月15日提交的美国临时申请61/029,197的优先权，该临时申请的全部公开内容通过引用并入本申请中。
计算机可读形式序列表的引入
序列表是本发明公开内容的一部分，包括计算机可读形式的37KB的文件，名称为“MONS193WO_ST25.txt”，包括本发明的核苷酸序列。序列表的主题通过引用完整并入本申请中。
发明背景
1.技术领域
本发明涉及包含事件(转化事件)MON87769的转基因大豆植物、后代植物及其种子。该事件显示出包含十八碳四烯酸(stearidonicacid)的油组成。本发明还涉及检测所述大豆事件在生物样品中的存在的方法，并提供该事件所特有的核苷酸序列。
2.相关技术描述
大豆是一种重要的农作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。生物技术方法已经被应用于大豆以改进农艺学性状和产品质量。一种这样的质量性状是包含十八碳四烯酸(SDA)的大豆油。
能够检测特定植物的转基因/基因组DNA的存在以确定有性杂交的后代是否含有目标转基因/基因组DNA是有利的。此外，当遵守要求上市前审批及对源自重组作物的食品进行标注的规定时，检测特定植物的方法是有用的。
已知多不饱和脂肪酸(PUFA)在食用后提供健康益处。含有SDA(一种PUFA)的油作为人和其它动物的健康饮食的一部分将是有利的。SDA可以来自植物和动物来源。SDA的商业来源包括植物属毛束草属(Trichodesma)、琉璃苣属(Borago)(琉璃苣)和蓝蓟属(Echium)以及鱼。但是，从天然来源商业生产PUFA有几个缺点。PUFA的天然来源，如动物和植物，常常具有高度不均匀的油组成。从这些来源获得的油因此可能需要充分的纯化来分离出一种或多种需要的PUFA或产生富含一种或多种PUFA的油。PUFA的天然来源在可获得性上也有不可控制的波动。鱼类资源可能遭受自然变化或者可能由于过度捕捞而消耗。鱼油也具有讨厌的味道和气味，因此经济地分离出需要的产品也许是不可能的，并且可能使这些产品作为食品补充物是不可接受的。动物油，特别是鱼油，可能积累环境污染物。食物可以富含鱼油，但是由于成本问题和世界上鱼类资源的减少，这种富含可能存在问题。尽管如此，如果社会上包括提高鱼肉摄取的健康信息，则在满足鱼肉需求上可能会出现问题。而且，这一产业的水产养殖饲料严重依赖于野生鱼类资源，其可持续性也存在问题(Naylor等人，Nature 405：1017-1024，2000)。
因此，在基于陆地的陆地作物系统中生产PUFA如SDA将是有利的，可以操作该系统以提供商业产量的SDA的生产。在诸如油菜、大豆、玉米、向日葵、红花或亚麻等商业油籽作物中，某些代表其种子油的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸部分转化为SDA需要Δ6-去饱和酶和Δ15-去饱和酶的种子特异性的表达。来源于表达高水平Δ6-和Δ15-去饱和酶的植物的油富含SDA。由于人和动物也需要提高Ω-3脂肪酸摄取，因此需要提供多种富含Ω-3的食品和食品补充物，使得接受者可以选择适合他们的日常饮食习惯的饲料、饲料成分、食品和食品成分。在大豆植物中提供商业产量的SDA也是有利的。
已知外来基因在植物中的表达受其染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或靠近整合位点的转录调控元件(如增强子)的接近性(Weising等人，Ann.Rev.Genet 22：421-477，1988)。基于这个原因，通常需要筛选大量的事件以判断以引入的目标基因的最佳表达为特征的事件。例如，在植物和其它生物中已观察到：引入基因的表达水平在事件之间差异很大。在表达的空间或时间模式上也有差异，例如，转基因在各种不同植物组织中的相对表达的差异，这可能不符合从引入的基因构建体中存在的转录调控元件预期的模式。基于这个原因，通常产生数百至数千个不同的事件，并对这些事件进行筛选，以选择具有所需转基因表达水平和用于商业目的的模式的单一事件。具有理想的转基因表达水平或模式的事件可以用于通过使用传统育种方法的有性远交将转基因渗入其它遗传背景中。这种杂交的后代保持原转化体的转基因表达特征。这一策略用来确保适当地适应当地特定生长条件的许多品种中的可靠的基因表达。
可以通过任何公知的核酸检测方法如聚合酶链反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测转基因的存在。这些检测方法一般集中于经常使用的遗传元件，如启动子、终止子、标记基因等。因此，这些方法可能不是事件特异性的(例如，可用于区分不同的事件)，特别是使用相同的DNA构建体产生的那些，除非邻近插入的DNA的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列是已知的。例如，Taverniers等人(J.Agric.Food Chem.，53：3041-3052，2005)讨论了事件特异性的PCR分析方法，其中证明了用于转基因玉米株系Bt11、Bt176和GA21及用于油菜(canola)事件GT73的事件特异性追踪系统。在这项研究中，事件特异性的引物和探针基于各事件的基因组/转基因接点(junction)的序列进行设计。负责批准使用包含给定转化事件的转基因植物的管理机构也可能需要事件特异性检测方法。转基因植物事件特异性的DNA检测方法也已在美国专利6,893,826、6,825,400、6,740,488、6,733,974、6,689,880、6,900,014和6,818,807中描述。
发明概述
本发明涉及包含被称为MON87769的转基因大豆事件的大豆植物及其与大豆事件MON87769不可区分的后代(这些后代也含有至少一个对应于插入的转基因DNA的等位基因)。本发明的另一方面是包含大豆事件MON87769的后代植物、或种子、或大豆植物和种子的可再生部分。本发明也包括包含大豆事件MON87769的植物的部分，该植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、花、芽、根、茎、叶、荚、种子和分生组织。包含MON87769的植物基因组中含有的新型遗传组合物和来自包含MON87769的植物的产品，如油、粗粉、面粉、食品、蛋白质补充剂和残留在已收获对应于MON87769的大豆植物的田地中的生物质，是本发明的方面。
本发明提供具有包含SDA的油组成的大豆植物，该植物具有包含事件MON87769的大豆植物的所有生理学和形态学特征。
根据本发明的一方面，提供了用于检测来自包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的新型大豆植物的转基因/基因组插入区域或被称为MON87769的事件是否存在的组合物和方法，其中包含大豆事件MON87769的种子的样品以ATCC保藏号PTA-8911保藏。提供了包含事件MON87769的至少一个接头序列(junction sequence)的DNA序列，该接头序列选自SEQ ID NO：1(“[A]SEQ ID NO：1”，对应于“[F]SEQ ID NO：6”的979位至998位，如图2所示)和SEQ ID NO：2(“[B]SEQ ID NO：2”，对应于“[F]SEQ ID NO：6”的8345位至8365位，如图2所示)及其互补序列；其中该接头序列是跨越插入基因组中的异源DNA与大豆细胞基因组DNA的连接点的核苷酸序列，在含有大豆DNA的生物样品中检测到该序列可以判断(diagnostic for)大豆事件MON87769 DNA在所述样品中的存在。这些接头序列至少含有SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或其互补序列。包含这些DNA分子的大豆事件MON87769和大豆种子是本发明的一方面。
来自大豆事件MON87769的包含新型转基因/基因组插入区域的DNA序列SEQ ID NO：3[C]、SEQ ID NO：4[D]和SEQ ID NO：5[E]或SEQ ID NO：1[A]、SEQ ID NO：2[B]和SEQ ID NO：5[E](参见图2)也是本发明的方面。包含这些分子的大豆植物和种子也是本发明的方面。
根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法的两个DNA分子，其中，第一DNA分子包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的DNA分子的转基因区域任何部分的至少11个或更多连续多核苷酸，以及类似长度的SEQ ID NO：3的5’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的DNA分子，其中，这些DNA分子一起使用时用作产生扩增子的DNA扩增方法中的DNA引物。当扩增子包含SEQ ID NO：1时，在DNA扩增方法中使用这些DNA引物产生的扩增子可判断大豆事件MON87769。使用与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子及任何包含SEQ ID NO：1的扩增子是发明的一方面。
根据本发明的另一个方面，提供用于DNA检测方法的两个DNA分子，其中，第一DNA分子包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的DNA分子的转基因区域任何部分的至少11个或更多连续多核苷酸，以及类似长度的SEQ ID NO：4的3’侧翼大豆基因组DNA区域的任何部分的DNA分子，其中，这些DNA分子用作DNA扩增方法中的DNA引物。当扩增子包含SEQ ID NO：2时，在DNA扩增方法中使用这些DNA引物产生的扩增子可判断大豆事件MON87769。使用与SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子及任何包含SEQ ID NO：2的扩增子是发明的一方面。
根据本发明的另一方面，提供了检测样品中对应于大豆事件MON87769的DNA的存在的方法。这些方法包括：(a)使包含DNA的样品与引物组接触，该引物组在与来自大豆事件MON87769的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生可判断大豆事件MON87769的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2。
本发明的另一方面是包含事件MON87769的大豆植物或种子，或得自该植物或种子的产物，其中，基因组DNA包含基本上由SEQ IDNO：3的大约1至988位的核苷酸序列、SEQ ID NO：5的大约1至7367位的核苷酸序列和SEQ ID NO：4的大约1至939位的核苷酸序列(其叠连群作为SEQ ID NO：6呈现)及其互补序列组成的DNA分子。包含事件MON87769的大豆植物或种子，或得自该植物或种子的产物(其中基因组DNA当从该大豆植物或种子或产物分离时，包含并入了SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的DNA分子)也是本发明的一方面。
本发明的另一方面是包含事件MON87769的大豆植物或种子，或得自该植物或种子的产物，其中，基因组DNA包含基本上由SEQ IDNO：6的大约1至9294位的核苷酸序列及其互补序列组成的DNA分子。也提供了大豆植物或种子，或得自该植物或种子的产物，其中，基因组DNA当从该大豆植物或种子或产物分离时，包含并入了SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2及其互补序列的DNA分子。
本发明的另一方面是MON87769的大豆植物或种子，或得自该植物或种子的产物，其中，基因组DNA当从该大豆植物或种子或产物分离时，在DNA扩增方法中产生扩增子，其中所述扩增子包含SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2。
根据本发明的另一方面，提供了检测对应于MON87769事件的DNA在样品中是否存在的方法，这样的方法包括：(a)使包含DNA的样品接触在严格杂交条件下与来自大豆事件MON87769的基因组DNA杂交且在严格杂交条件下不与对照大豆植物杂交的探针；(b)使所述样品和探针经历严格杂交条件；和(c)检测所述探针与大豆事件MON87769 DNA的杂交，其中，所述探针选自SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2。
本发明的另一方面是一种测定大豆事件MON87769的后代的接合性的方法，该方法包括：(a)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ5923(SEQ ID NO：8)、SQ5924(SEQ ID NO：9)、SQ5925(SEQ IDNO：11)和探针组6FAMTM-标记的PB2511(SEQ ID NO：10)和VICTM-标记的PB2512(SEQ ID NO：12)，所述引物组在与来自包含大豆事件MON87769的植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生第一扩增子，从而由引物SQ5923和SQ5924及6FAMTM-标记的引物/探针PB2511的组合释放可判断大豆事件MON87769的荧光信号；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测所述第一扩增子；和(d)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ59224和SQ5925和VICTM-标记的探针PB2512，当所述引物组在与来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时产生第二扩增子，释放荧光信号，该荧光信号可判断与确认为大豆事件MON87769的转基因插入的大豆基因组区域同源的野生型大豆基因组DNA；(e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；和(f)检测所述第二扩增子；和(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中，两种扩增子的存在表明该样品对于转基因插入是杂合的。
本发明的另一方面是一种测定包含大豆事件MON87769的植物之后代的接合性的方法，该方法包括：(a)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ5923(SEQ ID NO：8)、SQ5924(SEQ ID NO：9)和SQ5925(SEQ ID NO：11)，当该引物组在与来自大豆事件MON87769的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，由引物SQ5923和SQ5924的组合产生可以判断大豆事件MON87769的第一扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生第一扩增子；(c)检测所述第一扩增子；(d)使包含大豆DNA的样品接触引物组SQ5924和SQ5925，当该引物组在与来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，由引物SQ5924和SQ5925的组合产生第二扩增子，该扩增子可以判断与确认为大豆事件MON87769的转基因插入的大豆基因组区域同源的野生型大豆基因组DNA；(e)进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子；和(f)检测所述第二扩增子；和(g)比较样品中的第一和第二扩增子，其中，两种扩增子的存在表明该样品对于转基因插入是杂合的。
提供了用于检测大豆事件MON87769的试剂盒，其使用根据SEQID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5设计的引物。当使用所述试剂盒产生的扩增子(1)包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的任一核苷酸序列或(2)包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2两者时，该扩增子可判断MON87769。
本发明的另一方面是包含事件MON87769的大豆植物或种子，或种子后代，或得自该植物或种子的产物。在某些实施方案中，还提供了产生包含改变的PUFA含量的大豆植物的方法，包括将大豆事件MON87769渗入大豆植物基因组中，其中包含转化事件MON87769的种子的样品已经以ATCC保藏号PTA-8911保藏。
用于种植或用于制造商品的出售种子是本发明的一方面。这些商品包括但不限于：完整的或经过加工的大豆种子、动物饲料、植物油、粗粉、面粉、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品、豆浆、大豆果仁酱、纳豆、豆豉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化(texturized)大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白、植脂奶油(whipped topping)、烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、可食用全大豆(生的、烤的或作为青豆(edamamé))、豆奶、大豆酸奶、大豆干酪、豆腐、腐竹(yuba)和生物柴油(biodiesel)。
通过下面的详细描述，本发明的上述和其它方面将变得更加明显。
附图简述
图1.用于产生包含事件MON87769的大豆植物的双元转化载体pMON77245的图谱。
图2.在包含大豆事件MON87769的植物的基因组中转基因插入片段的组织：[A]对应于形成SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5之间的接头(junction)的SEQ ID NO：1的相对位置；[B]对应于形成SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5之间的接头的SEQ ID NO：2的相对位置；[C]对应于SEQ ID NO：3的相对位置，SEQ ID NO：3是位于整合到事件MON87769的基因组中的表达盒的任意分配的/指定的5′末端侧翼的大豆基因组序列；[D]对应于SEQ ID NO：4的相对位置，SEQ ID NO：4是位于整合到事件MON87769的基因组中的表达盒的任意分配的/指定的3′末端侧翼的大豆基因组序列；[E]代表构成SEQ ID NO：5的各种元件，SEQ ID NO：5是插入到包含事件MON87769的植物的基因组中的表达盒的序列；[F]代表包含如图中从左至右示出的SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4的连续序列，其中，如上所示，并入了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，因为这些序列存在于包含事件MON87769的大豆植物的基因组中。
序列简要说明
SEQ ID NO：1——代表大豆基因组DNA和整合的表达盒之间的右边界接头的20个核苷酸的序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的979至998位。此外，SEQ ID NO：1(图2的[A])是对应于SEQ ID NO：3([C]，见图2)的979至988位的核苷酸序列，和对应于SEQ ID NO：5([E]，见图2)的1至10位的去饱和酶表达盒的整合右边界。
SEQ ID NO：2——代表整合的表达盒和大豆基因组DNA之间的左边界接头的20个核苷酸的序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的8346至8365位。此外，SEQ ID NO：2([B]，见图2)是对应于SEQ IDNO：5([E]，见图2)的7358至7367位的核苷酸序列，和对应于SEQ IDNO：4([D]，见图2)的1至10位的3’侧翼序列。
SEQ ID NO：3——位于达到并包含T-DNA插入区域的MON87769插入DNA侧翼的5’序列。
SEQ ID NO：4——位于达到并包含T-DNA插入区域的MON87769插入DNA侧翼的3’序列。
SEQ ID NO：5——整合的去饱和酶表达盒的序列，包括整合后的左和右边界序列。
SEQ ID NO：6——代表位于MON87769的插入DNA侧翼的5’序列(SEQ ID NO：3)、整合的表达盒的序列(SEQ ID NO：5)和位于MON87769插入DNA侧翼的3’序列(SEQ ID NO：4)的叠连群的9294bp核苷酸序列。
SEQ ID NO：7——pMON77245的去饱和酶表达盒。
SEQ ID NO：8——用于鉴定MON87769事件以及MON87769事件的接合性的引物SQ5923。引物SQ5923对应于位于插入的去饱和酶盒5’侧的区域，该区域靠近对应于SEQ ID NO：6的944至968位的右T-DNA插入边界。使用引物SQ5923和SQ5924的组合产生的PCR扩增子对于事件MON87769的存在是阳性的。
SEQ ID NO：9——用于鉴定MON87769事件以及MON87769事件的接合性的引物SQ5924。引物SQ5924互补于插入的去饱和酶盒的5’区域，该区域靠近对应于SEQ ID NO：6的1007至1025位的右T-DNA插入边界。使用引物SQ5923和SQ5924的组合产生的PCR扩增子对于事件MON87769的存在是阳性的。
SEQ ID NO：10——用于鉴定MON87769事件的探针PB2511。该探针是6FAMTM-标记的合成寡核苷酸，其序列对应于SEQ ID NO：6的986至1005位。在扩增反应中使用引物SQ5923和SQ5924结合使用6FAMTM-标记的探针PB2511释放荧光信号可判断事件MON87769。
SEQ ID NO：11——用于确定MON87769事件的接合性的引物SQ5925。引物SQ5925与位于插入的表达盒侧翼的3’区域互补，该区域靠近对应于SEQ ID NO：6的8372至8395位的左T-DNA。使用FAMTM-标记的探针PB2512和引物SQ5923和SQ5925检测PCR扩增子对于在接合性分析中事件MON87769野生型的存在是阳性的。
SEQ ID NO：12——用于确定MON87769事件的接合性的引物SQ2512。该探针是VICTM-标记的合成寡核苷酸，其序列对应于在事件MON87769的表达盒的插入点处紧跟着与引物SQ5925同源的区域的野生型基因组DNA区域。使用引物SQ5924和SQ5925产生的PCR扩增子导致使用探针PB1112释放荧光信号，该荧光信号对于在事件MON87769的接合性分析中野生型等位基因的存在是阳性的。
优选实施方案详述
本发明涉及具有包含十八碳四烯酸(SDA)的油组成的包含事件MON87769的转基因大豆(Glycine max)植物，及其种子和后代。本发明还涉及插入到大豆事件MON87769中的DNA构建体，在包含事件MON87769的大豆植物或种子中发现的转基因/基因组插入区域，和包含事件MON87769的大豆植物或种子中转基因/基因组插入区域的检测，及其后代。
提供下面的定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，可以根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解术语。分子生物学中的常用术语的定义也可以在以下文献中找到：Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical andMolecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，GenesV，Oxford University Press：New York，1994。
如本文所用的术语“大豆”是指大豆(Glycine max)，且包括可用于大豆培育的所有植物品种，包括野生大豆种以及那些属于允许物种之间选育的野生大豆(Glycine soja)的植物。
如本文所用的术语“包括”是指“包括但不限于”。
术语“草甘膦”是指N-膦酰基甲基甘氨酸及其盐。N-膦酰基甲基甘氨酸是公知的对于大范围植物物种具有活性的除草剂。
“去饱和酶”是指能够去饱和或催化一个或多个脂肪酸的连续碳之间的双键形成，以产生单不饱和或多不饱和脂肪酸或其前体的多肽。特别有意义的是能够催化OA转化为LA、LA转化为ALA、或ALA转化为SDA的多肽，包括在12、15或6位去饱和的酶。选择具有去饱和酶活性的特定多肽的考虑因素包括但不限于该多肽的最适pH、该多肽是限速酶还是其成分、使用的去饱和酶是否是合成所需PUFA所必需的、和/或该多肽是否需要辅因子。表达的多肽优选地具有与其在宿主细胞中的位置的生化环境相容的特征。例如，该多肽可能竞争底物。
“商品”指任何由源自大豆或大豆油的材料组成的且向消费者出售的产品。加工的大豆是世界上蛋白质饲料和植物油的最大来源。大豆植物MON87769可用于生产通常是由大豆获得的商品。如下所述，包含大豆事件MON87769的种子的样品以ATCC保藏号PTA-8911保藏。MON87769大豆可以加工成粗粉、面粉或油，以及用作用于陆生动物和水生动物的动物饲料中的蛋白质或油来源。来自包含事件MON87769的植物、植物部分或种子的大豆和大豆油可以用于生产许多不同的产品，不限于无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品和护发产品。来自包含事件MON87769的植物、植物部分或种子的大豆和油适用于由全大豆制造的多种大豆食物，如豆奶、大豆果仁酱、纳豆和豆豉；和由加工的大豆和大豆油制造的各种大豆食物，包括大豆粗粉、大豆面粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白、植脂奶油、烹饪用油、色拉油、起酥油和卵磷脂。全大豆也是可食用的，且通常销售给消费者的是生的、烤的或是青豆。通常是由浸泡和磨碎全大豆生产的豆奶可以不经其它加工而食用，可以喷雾干燥，或加工成大豆酸奶、大豆干酪、豆腐或腐竹。
MON87769的油可以用来制造生物柴油。在传统的柴油发动机中使用生物柴油与使用石油柴油燃料相比导致如硫酸盐、一氧化碳和颗粒物等污染物的大幅减少，且在校车中的使用可极大地减少与有毒的柴油机废气的接触。生物柴油通常通过以下步骤获得：提取、过滤和精炼大豆油以除去游离的脂肪和磷脂，然后用甲醇对油进行酯交换以形成脂肪酸的甲酯(参见，例如，美国专利5,891,203)。产生的大豆甲酯通常被称为“生物柴油”。得自包含事件MON87769的植物、植物部分或种子的油也可以不形成甲酯而用作柴油机燃料，例如，通过混合缩醛和油(参见，例如，美国专利6,013,114)。可以通过本发明的方法鉴定用于制造所述油的包含事件MON87769的植物、植物部分或种子。预计从MON87769事件种子或其中一部分是或全部是MON87769的种子混合物纯化的油具有相对较少的或没有可用于测试的DNA。然而，从中提取油的种子可以用本发明的方法表征以鉴定MON87769事件在用于制造所述油的种子群中的存在。此外，用于制造所述油的工艺产生的植物废物可以用于本发明的方法中以鉴定包含事件MON87769的植物、植物部分或种子在进行加工以制造所述油的植物或种子混合物中的存在。同样，在制造商品之后剩下的或在收获大豆种子后遗留的植物残渣可以用本发明的方法表征以鉴定用于制造所述商品的原料中的MON87769事件。
转基因“事件”是如下产生的：用异源DNA(即，包括目标转基因的核酸构建体)转化植物细胞，再生由转基因插入植物基因组中产生的植物群体，和选择以插入特定基因组位置为特征的特定植物。术语“事件”指包含异源DNA的原始转化体和该转化体的后代。术语“事件”也指通过转化体和包含异源DNA的另一品种之间的有性远交产生的后代。甚至在与轮回亲本(recurrent parent)反复回交后，来自转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA在杂交后代中存在于同一染色体位置。术语“事件”也指来自包含插入DNA和紧邻该插入DNA的侧翼基因组序列的原始转化体的DNA，预期其由于包含插入DNA的亲本系(例如，原始转化体和由自交产生的后代)和不包含插入DNA的亲本系有性杂交而转移到接受了包含目标转基因的插入DNA的后代中。本发明涉及事件MON87769独特的或判断性的DNA序列、植物细胞、组织、种子和源自包含事件MON87769的植物组织的加工产品。
如本文中提及“分离的DNA分子”时，意思是DNA分子是单独或与其它成分组合存在的、但不存在于其自然环境中。例如，在大豆基因组DNA中天然存在的编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要它们存在于大豆基因组内，就不被认为与大豆基因组分离。但是，只要其结构和组分不在大豆基因组内，那么这些组分和这些组分的子部分中的每一个在本发明的范围内就是“分离的”。同样，只要核苷酸序列不在首次观察到该结构的生物体(九莱报春(Primula juliae)或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))的DNA内，那么编码九莱报春Δ6-去饱和酶蛋白或粗糙脉孢菌Δ15-去饱和酶蛋白的核苷酸序列是分离的核苷酸序列。与天然粗糙脉孢菌核苷酸序列编码相同氨基酸序列或基本上相同氨基酸序列的人工核苷酸序列对于本发明来说被认为是分离的。对于本发明，任何转基因核苷酸序列，即插入大豆植物事件MON87769的细胞基因组中的DNA的核苷酸序列，被认为是分离的核苷酸序列，不论它是存在于用于转化引起MON87769事件的大豆细胞的质粒中，存在于事件MON87769的基因组中，还是以可检测的量存在于源自事件MON87769的组织、后代、生物样品或商品中。因此，如果DNA分子可以从来自植物或种子或植物器官的细胞或组织或匀浆中提取，或者可以作为扩增子从来自植物或种子或植物器官的细胞或组织或匀浆(上述任一种都是得自由事件MON87769产生的材料)提取的DNA或RNA产生，那么核苷酸序列或任何由其获得的片段将被认为是分离的或可分离的。对于这个问题，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的接头序列和源自也包含这些接头序列的事件MON87769的核苷酸序列被认为是分离的或可分离的，不论这些序列是存在于事件MON87769的细胞的基因组中还是以可检测的量存在于得自事件MON87769的组织、后代、生物样品或商品中。
也可以理解：两种不同的转基因植物也可以配种以产生包含两个独立地隔离加入的外源基因的后代。适当的后代的自交可以产生对于两种加入的外源基因而言是纯合的植物。也包括与亲本植物的回交和与非转基因植物的远交，如无性繁殖。常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以在几篇参考文献中的某一种中找到，例如，Fehr，Breeding Methods for Cultivar Development，Wilcox J.编，AmericanSociety of Agronomy，Madison WI(1987)。
“探针”是其上附有常规可检测的标记或报告分子(如放射性核素、配体、化学发光剂或酶)的分离的核酸。这种探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况中与大豆事件MON87769的基因组DNA的链互补，不论其来自于大豆植物还是来自包含来自该事件的DNA的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特异性地结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这种结合可用于检测靶DNA序列的存在。
“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链的杂交体，然后通过聚合酶(例如，DNA聚合酶)沿着靶DNA链延伸。本发明的引物对是指它们用于靶核酸序列的扩增，例如，通过聚合酶链反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法。
探针和引物的长度一般为11个或更多个核苷酸，优选为18个或更多个核苷酸，更优选为24个或更多个核苷酸，最优选为30个或更多个核苷酸。这样的探针和引物在高严格杂交条件下特异性地与靶序列杂交。优选地，本发明的探针和引物具有与靶序列的完全序列相似性，虽然可以通过传统方法设计不同于靶序列而保留与靶序列杂交的能力的探针。一种或多种引物、引物对或探针，例如包含SEQ IDNO：1-6中任一个或多个的至少11个连续核苷酸序列或其互补序列，可以通过核苷酸序列合成、克隆、扩增或其它生产包含多核苷酸的分子的标准方法“得自”本发明的SEQ ID NO：1-6。同样，众所周知，将得自SEQ ID NO：1-6中任一个的一种或多种核苷酸序列或其互补序列可以例如通过计算机分析选择(例如，Wojciech和Rhoads，NAR17：8543-8551，1989)。
制备和使用探针和引物的方法在以下文献中描述，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1-3卷，Sambrook等人编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(下面简称为″Sambrook等人，1989″)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人编著，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(以下简称“Ausubel等人，1992”)；及Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Academic Press：San Diego，1990。PCR引物对可以源自已知的序列，例如，通过使用用于该目的的计算机程序，如Primer(Version 0.5，
Figure BPA00001190187700151
1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。
本文公开的基于侧翼DNA和插入序列的引物和探针可以用于通过常规方法(例如，通过再克隆和测序这样的序列)确认(及如果必要，校正)公开的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法可以用于鉴定在样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地与其它核酸分子杂交。如本文所用，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，那么这两个分子被认为能够特异性地彼此杂交。如果两个核酸分子表现出完全的互补性，则一核酸分子被认为与另一核酸分子“互补”。如本文所用，当一个分子的每个核苷酸都与另一分子的核苷酸互补时，则该分子被认为显示出“完全的互补性”。如果两个分子以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，那么这两个分子被认为是“最低限度互补的”。类似地，如果分子以足够的稳定性互相杂交从而允许它们在常规的“高严格”条件下保持彼此退火，那么分子是“互补的”。Sambrook等人，1989与Haymes等人，In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress，Washington，DC(1985)描述了常规的严格性条件。因而偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离没有完全消除该分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子用作引物或探针，只需要在序列中充分互补以在所采用的特定的溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
如本文所用，基本上同源的序列是在高严格条件下与所比照的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格条件，例如，大约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃下2.0xSSC洗涤，是本领域的技术人员已知的，或可以在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃下大约2.0xSSC的低严格条件到50℃下大约0.2xSSC的高严格条件中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(大约22℃)的低严格条件增加到大约65℃的高严格条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中的一种可以保持恒定，而另一个变量发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的核酸在中等严格条件(例如，大约2.0xSSC和大约65℃)下特异性地与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸分子或其互补序列或其中任一个的片段中的一个或多个杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸在高严格条件下特异性地与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸分子或互补序列或其中任一个的片段中的一个或多个杂交。在本发明的一方面，本发明的优选标记核酸分子具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段。在本发明的另一方面，本发明的优选标记核酸分子与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明的优选标记核酸分子与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核酸序列或其互补序列或其中任一个的片段共有95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2可以在植物育种方法中用作标记以鉴定类似于″DNA markers：Protocols，applications，and overviews″：173-185，Cregan等人编著，Wiley-LissNY，1997(本文通过引用引入)中简单序列重复DNA标记分析所描述的方法的遗传杂交的后代。可以通过本领域的技术人员已知的多种方法检测探针与靶DNA分子的杂交，这些方法可以包括但不限于，荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对进行靶核酸序列的扩增(例如，通过PCR)，“严格条件”是使得引物对仅与具有相应野生型序列(或其互补序列)的引物与之结合的靶核酸酸序列杂交的条件，并优选地在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物，扩增子。
术语“对于(靶序列)特异性的”表示探针或引物在严格杂交条件下只与包含靶序列的样品中的靶序列杂交。
如本文所用，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板的部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定有性杂交产生的大豆植物是否含有来自本发明大豆植物的转基因事件基因组DNA，从大豆植物组织样品中提取的DNA可以使用一个引物对(该引物对包含源自与插入的异源DNA的插入位点邻近的植物基因组的侧翼序列的引物，和源自插入的异源DNA的第二引物)执行核酸扩增方法，以产生可判断该事件DNA的存在的扩增子。该扩增子具有特定长度，且具有也可判断该事件的序列。扩增子的长度范围可为引物对加上1个核苷酸碱基对的组合长度，优选加上大约50个核苷酸碱基对，更优选加上大约250个核苷酸碱基对，甚至更优选加上大约450个核苷酸碱基对。可选择地，引物对可以源自位于插入的DNA两侧的侧翼序列，从而产生包含完整的插入核苷酸序列的扩增子。源自植物基因组序列的引物对的成员可能位于距离插入的DNA分子一定距离的位置，该距离范围可以是从1个核苷酸碱基对到高达大约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用明确排除可能在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种，包括聚合酶连锁反应(PCR)，实现核酸扩增。多种扩增方法是本领域已知的且在文献中有描述，特别是美国专利4,683,195和4,683,202及PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等人(编)，Academic Press，San Diego，1990。已经开发了PCR扩增方法以扩增高达22kb的基因组DNA和高达42kb的噬菌体DNA(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994)。这些方法以及DNA扩增领域内已知的其它方法可以用于实施本发明。可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自所述事件的这种序列，接着通过PCR扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证(如果必要，校正)来自包含大豆事件MON87769的植物或种子组织的异源DNA插入序列或侧翼序列。
可以通过多种技术检测通过这些方法产生的扩增子。一种这样的方法是遗传位分析(Genetic Bit Analysis)(例如，Nikiforov等人，Nucleic Acid Res.22：4167-4175，1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。继目标区域的PCR(使用插入序列中的一个引物和相邻的侧翼基因组DNA序列中的一个引物)之后，可以将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并用作使用DNA聚合酶和对于预期的下一碱基特异性的标记ddNTP的单碱基延伸反应的模板。读数可以是荧光或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而存在插入/侧翼序列。
另一种方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)所描述的焦磷酸测序技术(Pyrosequencing technique)。在该方法中，寡核苷酸设计为与相邻的基因组DNA和插入DNA的接头重叠。将寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物(插入序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate)和萤光素的存在下孵育。单个地加入dNTP，掺入产生进行测量的光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交或多碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
如Chen等人(Genome Res.9：492-498，1999)所述的荧光偏振是一种可用于检测本发明的扩增子的方法。使用此方法，设计与基因组侧翼DNA和插入DNA的接头重叠的寡核苷酸。将该寡核苷酸与目标区域的单链PCR产物(插入DNA中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。可以使用荧光计作为偏振的变化而测量掺入。偏振的改变表明由于成功的扩增、杂交或单碱基延伸而存在转基因插入/侧翼序列。
Figure BPA00001190187700191
(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为一种检测和定量DNA序列的存在的方法，且根据制造商提供的说明书可以完全理解。简单地说，设计与基因组DNA和插入DNA的接头重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。FRET探针的杂交导致荧光部分从FRET探针上的猝灭部分切割和释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。
如Tyangi等人(Nature Biotech.14：303-308，1996)所述，分子信标被描述用于序列检测。简单地说，设计与侧翼基因组和插入DNA的接头重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致它含有保持荧光部分和猝灭部分紧密接近的二级结构。FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)在热稳定聚合酶和dNTP的存在下循环。继成功进行PCR扩增之后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构丧失及荧光和猝灭部分的空间分离，其随之导致荧光信号的产生。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交而存在侧翼/转基因插入序列。
其它描述的方法，如微流体技术(美国专利公开2006068398、美国专利6,544,734)提供了分离和扩增DNA样品的方法和设备。利用光染料检测和定量特定的DNA分子(WO/05017181)；包含用于检测DNA分子的电子传感器的纳米管装置(WO/06024023)或结合特定的DNA分子然后可以被检测的纳米珠。
可以使用本发明公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。该试剂盒可用于鉴定样品中的大豆事件MON87769DNA，且可以应用于培育含有适当的事件DNA的大豆植物的方法。试剂盒可以包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5同源或互补的DNA引物或探针，或与DNA的遗传元件中包含的DNA同源或互补的DNA引物或探针。这些DNA序列可以在DNA扩增反应中使用或在DNA杂交方法中用作探针。包含事件MON87769的大豆基因组中所包含的基因组DNA和转基因遗传元件的序列由如下组织的双基因盒组成：胭脂碱右边界序列，然后是包含来自大豆β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)储存蛋白7Sα’亚单位(α’-bcsp)基因的启动子和前导序列的第一基因盒，其位于九莱报春Δ6-去饱和酶的上游(WO2005021761，通过参考并入本文)，该去饱和酶位于来自土壤杆菌(Agrobacterium)章鱼碱型Ti质粒的tml(肿瘤形态学大)基因的3’UTR的上游，接着是包含来自大豆β-伴大豆球蛋白7Sα亚单位基因的启动子和前导序列的第二基因盒，其位于密码子优化的粗糙脉孢菌Δ15-去饱和酶的上游(US20060156435，通过参考并入本文)，该去饱和酶位于豌豆RbcS2基因的3’UTR的上游，接着是章鱼碱左边界序列(例如图1)。用作DNA扩增方法中的引物的DNA分子可以源自MON87769事件包含的转基因插入序列的遗传元件序列。这些引物分子可以用作引物组的部分，该引物组还包括源自SEQ IDNO：3的碱基1至988和SEQ ID NO：4的碱基1至939给出的位于事件MON87769转基因插入序列的侧翼的基因组的DNA引物分子。
通过土壤杆菌介导的用质粒构建体pMON77245(如图1所示)转化近交大豆系的方法产生大豆植物MON87769。所用的转化方法类似于美国专利5,914,451所描述的方法。质粒构建体pMON77245包含与大豆植物细胞中去饱和酶蛋白表达所必需的调节遗传元件连接的植物表达盒。大豆细胞再生为完整的大豆植物，并从显示出植物表达盒的完整性和包含SDA的油组成以及未连锁的草甘膦抗性选择盒丧失的植物群体中选择单个植物。在其基因组中包含连接的pMON77245植物表达盒的大豆植物是本发明的一个方面。
插入包含被称为MON87769的事件的大豆植物基因组中的质粒DNA通过详细的分子分析进行鉴定。这些分析包括：插入数(大豆基因组中整合位点的数目)、拷贝数(一个基因座中T-DNA的拷贝数)和插入的基因盒的完整性。使用包括完整的去饱和酶编码区及其相应的调控元件、植物表达盒的启动子、内含子和多腺苷酸化序列及质粒pMON77245骨架DNA区的DNA分子探针。数据显示，包含事件MON87769的大豆基因组包含具有一个拷贝的去饱和酶盒的单T-DNA插入。在MON87769的基因组中没有检测到来自转化载体pMON77245的与完整基因盒连接或未连接的另外的元件。最后，进行反向PCR和DNA序列分析以确定5’和3’的插入序列-植物基因组接头，证实元件在插入序列中的组织(图2)，并确定包含事件MON87769的大豆植物中的插入序列的完全DNA序列(SEQ IDNO：5)。
本文包括下面的实施例来显示本发明的特定优选实施方案的实施例。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明中运用良好的技术，因此可以被认为构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。
保藏信息
对包含被称为MON87769的转基因大豆事件的种子系MON87769的至少2500个种子进行了保藏。保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA。ATCC保藏号为PTA-8911。保藏日为2008年2月5日。在本申请未决期间有资格的人在请求后可以获得该保藏物。该保藏物将在公开的保藏机构ATCC保藏机构保存30年或最后请求后的5年或专利的有效期间，以较长者为准，并在此期间如果无法存活的话进行更换。申请人不放弃对该专利授予的权利的任何侵犯或者任何其它形式的品种保护，包括植物品种保护条例(7 U.S.C.2321及其后各条)。
实施例
实施例1：用pMON77245转化大豆A3525和事件选择
大豆细胞用源自pMON77245(图1；参见美国专利申请公开20080063691，通过参考引入)的DNA片段通过土壤杆菌介导的转化生成包含被称为MON87769的事件的初始转基因大豆植物。双元植物转化载体pMON77245包含两个植物转化盒或T-DNA。每个盒在转化盒的5’和3’末端的旁侧分别为右边界和左边界序列。表达盒(SEQID NO：7)用于两个去饱和酶基因的表达。该双基因盒如下组织：胭脂碱右边界序列，然后是包含来自大豆β-伴大豆球蛋白储存蛋白7Sα’亚单位(α’-bcsp)基因的启动子和前导序列的第一基因盒，其位于九莱报春Δ6-去饱和酶的上游(WO2005021761，通过参考并入本文)，该去饱和酶位于来自土壤杆菌章鱼碱型Ti质粒的tml(肿瘤形态学大)基因的3’UTR的上游，接着是包含来自大豆β-伴大豆球蛋白7Sα亚单位基因的启动子和前导序列的第二基因盒，它位于密码子优化的粗糙脉孢菌Δ15-去饱和酶的上游(美国专利申请公开20060156435，通过参考并入本文)，该去饱和酶位于豌豆RbcS2基因的3’UTR的上游，接着是章鱼碱左边界序列(例如图1)。第二转化盒含有用作转化选择性标记的提供草甘膦抗性的基因。
通过根癌土壤杆菌介导的转化获得用pMON77245转化的外植体。由转化的组织再生为植物。对生出的根取样，并使用基于去饱和酶盒序列(SEQ ID NO：7)的引物通过PCR对去饱和酶盒的存在进行分析。产生大约38个R0转化事件，并通过InvaderR(Third WaveTechnologies，Inc.，Madison，WI)测试去饱和酶盒的单拷贝的存在。另外，利用连锁Southern印迹分析确定每个事件中转基因座的数量。选择限制性内切酶SwaI进行基因座Southern，因为它不包含在去饱和酶盒中。这种酶在大豆基因组中以足够的频率切割，从而通常使多拷贝事件中紧密连接的转基因拷贝分离。将证明有去饱和酶盒单拷贝插入的R0事件自花授粉以产生R1种子。通过FAME-GC分析确定R1种子的脂肪酸组成。成熟种子中的数值范围为8-12％SDA。基于这些分析，选择10个事件继续进行。
对10个选出的R2植物进行Southern分析以确认表达盒的存在和来自转化载体的不需要的核苷酸序列的不存在。另外，也确定每个事件的去饱和酶盒插入位点的侧翼序列。基于其表现特征和分子鉴定选择包含称为MON87769的事件的一个后代株系。
实施例2：使用反向PCR分离侧翼序列
使用Ochman等人，1990(PCR Protocols：A guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.)所述的反向PCR及通过TAIL(Thermal Asymmetric InterLaced)PCR确定MON87769中T-DNA插入的侧翼序列。从野生型A3525和来自温室条件下生长的组织的转基因系分离植物基因组DNA。冷冻的叶组织用研钵和研杵与液氮研磨或机械研磨。将22mL体积的提取缓冲液加至约1g磨碎的叶组织中，并在65℃下温育1小时。CTAB提取缓冲液由1.4M NaCl，2％CTAB，20mM EDTA和100mM Tris-HCl pH 8.0组成。在使用前，向提取缓冲液中添加0.02％β-巯基乙醇和0.5mg RNase A。用12mL苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液提取样品，然后在4℃下以4000xG离心10分钟。将上清液转移到新的试管中，用15mL异丙醇沉淀DNA。以4000xG离心10分钟后，沉淀物用5mL 70％乙醇洗涤。最后以4000xG离心5分钟；将沉淀物风干，然后重悬浮于300μL水中。
DNA等分试样进行TAIL PCR，分离与插入位点相邻的序列的区域并测序。另外，用基于T-DNA的限制分析选择的限制性内切酶消化DNA等分试样。经过限制性片段的自身连接后，使用由T-DNA序列设计的引物进行PCR，该引物将扩增由T-DNA的5’和3’端延伸的序列。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。直接使用标准测序方案对随后的产物测序。采用这两种方法，延伸到去饱和酶盒T-DNA的右边界序列中的5’侧翼序列表示为SEQ ID NO：3([C]，参见图2)。延伸到去饱和酶盒T-DNA的左边界序列中的3’侧翼序列表示为SEQ IDNO：4([D]，参见图2)。完全整合进入A3525基因组DNA中的来自pMON77245的去饱和酶盒DNA(SEQ ID NO：7)的部分表示为SEQ IDNO：5([E]，参见图2)。
将分离的序列与T-DNA序列进行比较，以鉴定侧翼序列和共分离的T-DNA片段。通过使用基于推导的侧翼序列数据和已知的T-DNA序列设计的引物进行PCR以确认表达盒的存在。使用由MON87769中的侧翼序列设计的引物分离对应于T-DNA整合到转化株系中的同一区域的A3525野生型序列。相对于多个核苷酸和蛋白质数据库分析MON87769中的侧翼序列和A3525野生型序列。该信息用于检查转基因与植物基因组的关系，并观察插入位点的完整性。利用侧翼序列和野生型序列设计用于如实施例3所述的用来鉴定事件和确定接合性的TaqMan端点分析的引物。
实施例3：事件特异性的端点TaqMan和接合性分析
在事件特异性的端点TaqMan PCR分析中描述了用来鉴定样品中的事件MON87769的存在的方法，表1和表2描述了其条件的例子。用于端点分析中的DNA引物是引物SQ5923(SEQ ID NO：8)、SQ5924(SEQ ID NO：9)和6FAMTM标记的引物PB2511(SEQ ID NO：10)。6FAMTM是连接到DNA引物上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。对于TaqMan MGB(小沟结合)探针，Taq DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性在荧光团和猝灭剂之间从5’-端切割探针。当与靶DNA链杂交时，猝灭剂和荧光团充分分离以产生荧光信号。
当如前所述与PB2511(SEQ ID NO：10)使用时，SQ5923(SEQ IDNO：8)和SQ5924(SEQ ID NO：9)产生可判断事件MON87769 DNA的DNA扩增子。用于此分析的对照应包括来自已知包含事件MON87769DNA的大豆的阳性对照、来自非转基因大豆的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
优化这些分析以用于Applied BiosystemsPCR System9700、Stratagene
Figure BPA00001190187700252
MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf
Figure BPA00001190187700253
Gradient热循环仪。本领域技术人员已知产生鉴定事件MON87769 DNA的扩增子的其它方法和仪器。
使用以下循环参数在Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪、AppliedBiosystems GeneAmp PCR System 9700或MJ Research DNA EnginePTC-225热循环仪中进行DNA扩增。当在Eppendorf MastercyclerGradient或MJ Engine中运行PCR时，热循环仪应该以计算模式运行。当在Perkin-Elmer 9700中运行PCR时，热循环仪以设定为最大值的变温速度运行。
表1.大豆MON87769事件特异性的端点TaqMan PCR
Figure BPA00001190187700261
表2.端点TaqMan热循环仪条件
采用事件特异性接合性端点TaqMan PCR确定样品中包含事件MON87769的组织的接合性，表3和表4描述了其条件的例子。用于接合性分析的DNA引物是引物SQ5923(SEQ ID NO：8)、SQ5924(SEQ ID NO：9)、SQ5925(SEQ ID NO：11)、6FAMTM标记的引物PB2511(SEQ ID NO：10)和VICTM标记的引物PB2512(SEQ ID NO：12)。6FAMTM和VICTM是连接到DNA引物上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。
当在这些反应方法中与PB2511(SEQ ID NO：10)使用时，SQ5923(SEQ ID NO：8)和SQ5924(SEQ ID NO：9)产生可判断事件MON87769 DNA的DNA扩增子。用于此分析的对照应包括来自包含事件MON87769 DNA的大豆的阳性对照、来自非转基因大豆的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
当在这些反应方法中与PB2512(SEQ ID NO：12)使用时，SQ5923(SEQ ID NO：8)和SQ5925(SEQ ID NO：11)产生可判断野生型等位基因的DNA扩增子。
通过由两个探针PB2511和PB2512的荧光信号释放证明两种扩增子的存在而确定杂合性。
优化这些分析方法以用于Applied Biosystems GeneAmp PCRSystem 9700、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪。本领域技术人员已知产生鉴定事件MON87769 DNA的扩增子的其它方法和仪器。
使用以下循环参数在Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、Eppendorf Mastercycler Gradient热循环仪、AppliedBiosystems GeneAmp PCR System 9700或MJ Research DNA EnginePTC-225热循环仪中进行DNA扩增。当在Eppendorf MastercyclerGradient或MJ Engine中运行PCR时，热循环仪应该以计算模式运行。当在Perkin-Elmer 9700中运行PCR时，热循环仪以设定为最大值的变温速度运行。
表3.大豆MON87769事件特异性的接合性端点TaqMan PCR
Figure BPA00001190187700281
表4.接合性端点TaqMan热循环仪条件
Figure BPA00001190187700282
实施例4：在任何MON87769育种事件中事件MON87769的鉴定
下面的实施例描述了如何鉴定在包含事件MON87769的任何大豆育种系的后代中的MON87769事件。
使用DNA事件引物对产生可判断大豆事件MON87769的扩增子。可判断MON87769的扩增子包含至少一个接头序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(分别如图2所示的“[A]”和“[B]”)。SEQ ID NO：1(图2的[A])是对应于5’侧翼序列(SEQ ID NO：3[C]的979至988位，参见图2)和去饱和酶盒的整合右边界(SEQ ID NO：5[E]的1至10位，参见图2)的接头的核苷酸序列。SEQ ID NO：2([B]，参见图2)是对应于去饱和酶盒的整合左边界(SEQ ID NO：5[E]的7358至7367位，参见图2)和3’侧翼序列(SEQ ID NO：4[D]的1至10位，参见图2)的接头的核苷酸序列。
产生MON87769的判断性扩增子的事件引物对包括基于侧翼序列和插入的去饱和酶盒的引物对。为了获得其中发现有SEQ ID NO：1的至少11个核苷酸的判断性扩增子，设计基于SEQ ID NO：3的碱基1至978的正向引物和基于插入表达去饱和酶盒SEQ ID NO：5的10至7367位的反向引物。为了获得其中发现有SEQ ID NO：2的至少11个核苷酸的判断性扩增子，设计基于插入去饱和酶盒SEQ ID NO：5的10至7357位的正向引物和基于3’侧翼序列SEQ ID NO：4的碱基10至939的反向引物。从实践上来看，应设计产生有限的大小范围、优选为200至1000个碱基的扩增子的引物。较小大小的扩增子一般在PCR反应中更可靠地产生，允许更短的循环时间，并且可以容易地分离和在琼脂糖凝胶上显示或适用于端点TaqManTM样的分析中。此外，使用所述引物对产生的扩增子可以克隆到载体中，增殖，分离并测序，或者可以用本领域确立的方法直接测序。由SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5的组合或其一个或多个亚序列或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的组合或其一个或多个亚序列衍生的用于DNA扩增方法以产生可判断MON87769或其后代的扩增子的任何引物对是本发明的一方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断MON87769或其后代的扩增子的包含SEQ ID NO：3的至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是本发明的一方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断MON87769或其后代的扩增子的包含SEQID NO：4的至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是本发明的一方面。任何用于DNA扩增方法中以产生可判断MON87769或其后代的扩增子的包含SEQ ID NO：5的至少11个连续核苷酸或其互补序列的单个分离的DNA多核苷酸引物分子是发明的一方面。
表5和表6显示了用于这种分析的扩增条件的例子。然而，对于这些方法或与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或产生可判断MON87769的扩增子的MON87769转基因插入序列(SEQ ID NO：5)中包含的遗传元件的DNA序列同源或互补的DNA引物的应用的任何改进都属于本领域的范围。判断性扩增子包含与至少一个转基因/基因组接头DNA(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)或其实质部分同源或互补的DNA分子。
对于样品中事件MON87769植物组织的分析应包括来自包含事件MON87769的植物组织的阳性组织对照、来自不包含事件MON87769的大豆植物的阴性对照(例如但不限于A3525)和不包含大豆基因组DNA的阴性对照。扩增内源性大豆DNA分子的引物对用作DNA扩增条件的内部控制。另外的引物序列可以由DNA扩增方法领域中的技术人员从SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中选择，且为了通过表5和表6所示的方法产生扩增子而选择的条件可能会有所不同，但产生可判断事件MON87769 DNA的扩增子。对根据表5和表6的方法进行改良的这些DNA引物序列的应用在本发明的范围内。由源自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少一个DNA引物序列产生的可判断MON87769的扩增子是本发明的一方面。
包含至少一个源自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的DNA引物的DNA检测试剂盒是本发明的一方面，当该至少一个DNA引物用于DNA扩增方法时，产生MON87769或其后代的判断性扩增子。其中其基因组在DNA扩增法中检测时产生可判断MON87769的扩增子的大豆植物或种子是本发明的一方面。可以通过使用Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700、StratageneRobocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、Eppendorf MastercyclerGradient热循环仪或任何其它可以用于如表6所示产生判断MON87769的扩增子的扩增系统对MON87769扩增子进行分析。
表5.大豆MON87769事件特异性的PCR分析
Figure BPA00001190187700311
表6.大豆MON87769事件热循环仪条件
Figure BPA00001190187700321
上面已经说明并描述了本发明的原理，本领域技术人员应当明白，可以在不背离这种原理的情况下在配置和细节方面对本发明进行修改。我们要求保护在所附的权利要求的精神和范围内的所有修改。
Figure IPA00001190187100011
Figure IPA00001190187100031
Figure IPA00001190187100041
Figure IPA00001190187100051
Figure IPA00001190187100061
Figure IPA00001190187100071
Figure IPA00001190187100081
Figure IPA00001190187100091
Figure IPA00001190187100101
Figure IPA00001190187100111
Figure IPA00001190187100121
Figure IPA00001190187100131
Figure IPA00001190187100141

Claims (34)

1.一种DNA分子，其包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的DNA序列或互补于该DNA序列的序列。
2.用作判断大豆事件MON87769 DNA的DNA探针的分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO：1的至少11个连续核苷酸或其互补序列。
3.用作判断大豆事件MON87769 DNA的DNA探针的分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO：2的至少11个连续核苷酸或其互补序列。
4.一种检测生物样品中大豆事件MON87769核苷酸序列的存在的方法，该方法包括：
i.使所述样品与DNA引物对接触；
ii.进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和
iii.检测所述扩增子，其中，所述扩增子包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：2。
5.一种稳定转化的大豆植物，其DNA在进行权利要求4所述的方法时产生包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的DNA扩增子。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述DNA引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO：3的至少11个连续核苷酸的序列或其互补序列，所述第二引物包含SEQ ID NO：5的至少11个连续核苷酸的序列或其互补序列。
7.如权利要求4所述的方法，其中，所述DNA引物对包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含SEQ ID NO：4的至少11个连续核苷酸的序列或其互补序列，所述第二引物包含SEQ ID NO：5的至少11个连续核苷酸的序列或其互补序列。
8.一种检测生物样品中大豆事件MON87769 DNA的存在的方法，包括：
i.使所述样品与一种探针接触，所述探针在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和其互补序列的序列杂交，并且在严格杂交条件下不与不包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其互补序列的大豆植物基因组DNA杂交；
ii.使所述样品和所述探针经历严格杂交条件；和
iii.检测所述探针与所述样品的结合；
其中，结合能够判断样品中大豆事件MON87769 DNA的存在。
9.一种测定样品中包含大豆事件MON87769 DNA的大豆植物基因组DNA的接合性的方法，包括：
i.使所述样品与包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：11的三种不同的引物接触，所述引物
(a)当在包含大豆事件MON87769 DNA的核酸扩增反应中一起使用时，产生判断样品中的大豆事件MON87769 DNA的第一扩增子；和
(b)当在包含MON87769 DNA之外的大豆基因组DNA的核酸扩增反应中一起使用时，产生判断样品中的事件MON87769 DNA之外的大豆基因组DNA的第二扩增子；
ii.进行核酸扩增反应；和
iii.检测产生的一个或多个扩增子；
其中，第二扩增子的存在可判断所述样品中的杂合基因组。
10.包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的大豆植物。
11.包含权利要求1的核酸序列的大豆种子。
12.包含事件MON87769的大豆植物或种子，包含转化事件MON87769的种子的样品已经以ATCC保藏号PTA-8911保藏。
13.权利要求12的植物或种子的部分。
14.权利要求12的大豆植物或种子的花粉、胚珠、荚、花、根或叶。
15.权利要求12的大豆植物的后代，其中，该后代包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。
16.一种分离的核酸区段，其包含选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：1的互补序列和SEQ ID NO：2的互补序列的序列的至少大约11个至大约20个连续核苷酸。
17.一种分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的序列或互补于该序列的核苷酸序列。
18.一种检测生物样品中大豆事件MON87769多核苷酸的存在的方法，包括：
i.使所述样品与一种探针在严格杂交条件下接触，其中所述探针包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列或互补于该序列的连续序列；和
ii.检测所述探针与所述样品的结合，其中，结合能够判断样品中大豆事件MON87769多核苷酸的存在。
19.一种包含选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列的组合物，其中，该组合物是选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油的商品。
20.包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的大约11个至大约20个连续核苷酸或其互补序列的探针，用于检测生物样品中大豆事件MON87769 DNA的存在。
21.如权利要求20所述的探针，其中，该探针包含选自脱氧核糖核酸、核糖核酸和核苷酸类似物的核苷酸。
22.如权利要求21所述的探针，其中，该探针用至少一种荧光团标记。
23.包含可检测量的大豆事件MON87769核苷酸序列的商品或食品，其中，所述序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
24.如权利要求23所述的商品或食品，其选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油。
25.一种检测生物样品中能判断大豆事件MON87769的存在的核苷酸序列的存在的方法，包括检测SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的存在，其中，该生物样品选自大豆粗粉、大豆粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、水解大豆蛋白和植脂奶油。
26.由事件MON87769的大豆种子或其后代产生的油，其中，所述油包含可检测量的判断大豆事件MON87769的核苷酸序列，其中，该序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
27.由权利要求26的油产生的商品，选自烹饪用油、色拉油、起酥油、卵磷脂、无毒塑料、印刷油墨、润滑剂、蜡、液压流体、变压器流体、溶剂、化妆品、护发产品和生物柴油。
28.用于检测生物样品中的大豆事件MON87769核苷酸序列的试剂盒。
29.如权利要求28所述的用于检测生物样品中的大豆事件MON87769核苷酸序列的试剂盒，其中，该试剂盒采用包括以下步骤的方法：
i.使所述样品与DNA引物对接触；
ii.进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和
iii.检测所述扩增子，其中，所述扩增子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
30.如权利要求29所述的试剂盒，其中，所述DNA引物对包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含来源于SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其互补序列，所述第二引物对包含来源于SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其互补序列。
31.如权利要求29所述的试剂盒，其中，所述DNA引物对包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含来源于SEQ ID NO：5的核苷酸序列或其互补序列，所述第二引物包含来源于SEQ ID NO：4的核苷酸序列或其互补序列。
32.一种产生包含改变的PUFA含量的大豆植物的方法，包括使包含大豆事件MON87769的植物与缺乏大豆事件MON87769的大豆植物杂交，以获得包含大豆事件MON87769和改变的PUFA含量的植物，其中，包含转化事件MON87769的种子的样品已经以ATCC保藏号PTA-8911保藏。
33.一种产生包含大豆事件MON87769的大豆品种的方法，包括使包含事件MON87769的大豆植物与第二大豆植物杂交，其中，包含转化事件MON87769的种子的样品已经以ATCC保藏号PTA-8911保藏。
34.一种产生包含事件MON87769的大豆植物或其部分的方法，包括培育权利要求12的种子。
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