TWI604053B - 大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０５及其檢測方法 - Google Patents

大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０５及其檢測方法 Download PDF

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大豆基因轉殖品系MON87705及其檢測方法
本發明係關於基因轉殖大豆品系MON87705及其植物部分及種子。該品系展示包含改變之脂肪酸含量的油組合物。本發明亦係關於用於檢測生物樣本中大豆品系之存在的方法，及提供能夠實行該方法之核苷酸序列。
本申請案主張2008年9月29日申請的美國臨時申請案第61/100,859之權利。
大豆為世界上許多地區之重要作物及主要食品來源。已將生物技術方法應用於大豆以改良產品之農藝性狀及品質。一種該品質性狀為包含改變之脂肪酸含量的大豆油。
能夠檢測特定植物之轉殖基因/基因組DNA之存在以判定有性雜交之子代是否含有所關注之轉殖基因/基因組DNA為有利的。此外，當遵守需要預銷售批准且標記源自重組作物植物之食品的法規時，檢測特定植物之方法將為有幫助的。
已藉由各種育種方法將大豆油改質以產生特定市場效益。然而，廣泛有益於主要大豆油使用者，諸如沙拉油、烹調油及油炸油之消費者，及諸如生物柴油及生物潤滑油市場之工業市場的大豆油不可獲得。先前之大豆油過於昂貴或缺乏重要之食品品質特性，諸如氧化穩定性、良好之油炸食品香味或飽和脂肪含量，或缺乏重要之生物柴油特性，諸如適當之氧化氮排放或耐寒性或冷流。
大豆油通常含有約20%油酸。油酸具有一個雙鍵，但在高溫下仍相對穩定，且具有高含量油酸之油適用於烹調及其他需要加熱之過程。最近，已推薦增加高油酸油之消費，因為油酸似乎可降低血液低密度脂蛋白(「LDL」)之含量而不會影響高密度脂蛋白(「HDL」)之含量。然而，油酸含量之一些限制為合乎需要的，因為當油酸在高溫下降解時，其產生香味不佳之化合物且減弱由亞麻油酸之氧化所產生之良好香味。Neff等人，JAOCS,77:1303-1313(2000)；Warner等人，J. Agric. Food Chem. 49:899-905(2001)。因此較佳使用油酸含量為65-85重量%或65-85重量%以下之油，以限制食品應用(諸如油炸油及油炸食品)中之變味(off-flavor)。其他較佳之油具有大於55重量%之油酸含量以改良氧化穩定性。
對於許多油之應用而言，小於8重量%或甚至小於約2-3重量%之飽和脂肪酸含量為合乎需要的。大豆油通常含有約16-20%之飽和脂肪酸：13-16%棕櫚酸(palmitate)及3-4%硬脂酸(stearate)(一般參見Gunstone等人，The Lipid Handbook,Chapman & Hall,London(1994))。飽和脂肪酸具有許多應用中不希望有之高熔點。當用作原料或燃料時，飽和脂肪酸在低溫下會引起混濁且賦予燃料以不良冷流特性，諸如傾注點(pour point)及低溫過濾阻塞點。消費者及食品工業有可能青睞含有低飽和脂肪酸含量之油產品，因為發覺根據FDA準則該等油產品更健康及/或可被稱為「不含飽和脂肪」。此外，低飽和油減少或消除使諸如沙拉油之食物應用油防凍之需要。在生物柴油及潤滑劑應用中，具有低飽和脂肪酸含量之油賦予改良之冷流特性且在低溫下不混濁。
生成具有中油酸及低飽和含量之種子的大豆系將合乎需要。本文揭示之方法使得能夠生成油酸含量在55-80%中油酸範圍內且飽和脂肪酸含量小於8%的大豆種子。
已知植物中外來基因之表現或許會歸因於染色質結構(例如異染色質)或接近整合位點的轉錄調節元件(例如強化子)之接近度受其染色體位置的影響(Weising等人，1988 Ann. Rev. Genet 22:421-477)。因此，通常必需篩選大量品系以鑑別特徵在於最佳表現所關注之引入基因的品系。舉例而言，已在植物及其他生物體中觀察到品系中所引入基因之表現量可能存在廣泛變化。表現之空間或時間模式亦可能存在差異，例如，轉殖基因在各種植物組織中的相對表現之差異，其可能並不對應於由所引入基因之構築體中存在之轉錄調節元件所期望的模式。因此，為商業目的生成數百至數千個不同品系且篩選該等品系以得到具有所需轉殖基因表現量及模式的單一品系為普遍的。具有所需轉殖基因表現量或模式的品系適用於使用習知育種方法藉由有性異型雜交將轉殖基因基因移入其他遺傳背景中。該等雜交之子代保持初始轉型體之轉殖基因表現特徵。使用此策略來確保在適當地適應於特定局部生長條件之許多種類中可靠之基因表現。
有可能藉由諸如聚合酶鏈反應(PCR)或DNA雜交之任何熟知核酸檢測方法，使用核酸探針檢測轉殖基因之存在。此等檢測方法一般集中於經常使用遺傳元件，諸如啟動子、終止子、標記基因等等。因此，該等方法可能並不適用於辯別不同品系，尤其使用相同DNA構築體生成者，除非鄰近於插入之DNA(「側接DNA」)之染色體DNA的序列已知。例如由Taverniers等人論述品系特異性PCR檢定(J. Agric. Food Chem.,53:3041-3052,2005)，該文獻中顯示基因轉殖玉米系Bt11、Bt176及GA21及芥花品系GT73之品系特異性示蹤系統。在此研究中，品系特異性引子及探針係基於各品系之基因組/轉殖基因接合之序列而設計。基因轉殖植物品系特異性DNA檢測方法亦已在美國專利第6,893,826號；第6,825,400號；第6,740,488號；第6,733,974號；第6,689,880號；第6,900,014號及第6,818,807號中描述。
本發明係關於具有包含改變之脂肪酸含量之油組合物的基因轉殖大豆(大豆(Glycine max))植物MON87705且係關於大豆植物MON87705之DNA構築體及對大豆MON87705及其子代中轉殖基因/基因組插入區之檢測。
本發明包括一種稱為MON87705之基因轉殖大豆植物及其與大豆品系MON87705不可區分之子代(達到這種程度以致該子代亦含有至少一個對應於插入之基因轉殖DNA之等位基因)，其具有以寄存編號PTA-9241存放於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)之種子。本發明之另一態樣為大豆品系MON87705之子代植物或種子或該等植物及種子之可再生部分。本發明亦包括大豆品系MON87705之植物部分，包括(但不限於)花粉、胚珠、花、芽、根、莖、葉、莢果、種子及分生組織。本發明之態樣為MON87705之基因組中及來自MON87705之產品(諸如油、粕粉、豆粉(flour)、食品、蛋白質補充劑及已收穫對應於MON87705之大豆植物之田野中所剩餘之生物質)中所含之新穎遺傳組合物。
本發明提供一種大豆植物，其能夠生成具有包含約55-80重量%油酸及小於8重量%飽和脂肪酸之油組合物的種子，其中該油組合物之遺傳決定子可自ATCC寄存編號PTA-9241之大豆獲得。
根據本發明之一態樣，提供由稱為MON87705之新穎大豆植物中檢測轉殖基因/基因組插入區之存在的組合物及方法。提供包含至少一個選自由以下序列組成之群的MON87705之接合序列的DNA序列：SEQ ID NO:1([A]對應於SEQ ID NO:6[F]之位置3449至3468，圖2)、SEQ ID NO:2([B]對應於SEQ ID NO:6[F]之位置10700至10719，圖2)及SEQ ID NO:18(對應於SEQ ID NO:6[F]之位置9266至9371，圖2)及其互補體；其中接合序列為跨過插入基因組之異源性DNA與大豆細胞基因組DNA連接之點的核苷酸序列，且在含有大豆DNA之生物樣本中檢測此序列以診斷該樣本中大豆品系MON87705 DNA之存在(圖2)。該等接合序列可含有至少一個下列序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:18及其互補體。本發明之一態樣為包含此等DNA分子之大豆植物、來自該植物之大豆種子及該植物之子代。
本發明之態樣為來自大豆品系MON87705的包含新穎轉殖基因/基因組插入區之DNA序列，SEQ ID NO:3[C]、SEQ ID NO:4[D]及SEQ ID NO:5[E]或SEQ ID NO:1[A]及SEQ ID NO:2[B](參見圖2)。本發明之態樣亦為包含此等分子之大豆植物、種子及子代。
根據本發明之另一態樣，提供供DNA檢測方法中使用之兩種DNA分子，其中第一DNA分子包含SEQ ID NO:5的DNA分子之任一部分轉殖基因區中的至少11個或11個以上、至少12個或12個以上或至少13個或13個以上連續聚核苷酸及SEQ ID NO:3之任一部分5'側接大豆基因組DNA區中具有類似長度的DNA分子，其中此等DNA分子一起使用時適於用作生成擴增子之DNA擴增法中之DNA引子。當DNA擴增法中使用此等DNA引子所生成之擴增子含有SEQ ID NO:1時，該擴增子可診斷大豆品系MON87705。本發明之一態樣為由與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5之任一部分同源或互補之DNA引子生成的任何擴增子，及包含SEQ ID NO:1之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供供DNA檢測方法中使用之兩種DNA分子，其中第一DNA分子包含SEQ ID NO:5的DNA分子之任一部分轉殖基因區中的至少11個或11個以上連續聚核苷酸及SEQ ID NO:4之任一部分3'側接大豆基因組DNA中具有類似長度的DNA分子，其中此等DNA分子適於用作DNA擴增法中之DNA引子。當DNA擴增法中使用此等DNA引子所生成之擴增子含有SEQ ID NO:2時，該擴增子可診斷大豆品系MON87705。本發明之一態樣為由與SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5之任一部分同源或互補之DNA引子生成的任何擴增子，及包含SEQ ID NO:2之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供供DNA檢測方法中使用之兩種DNA分子，其中第一DNA分子包含SEQ ID NO:5或其互補體的DNA分子之任一部分轉殖基因區中的至少11個或11個以上連續聚核苷酸，其中一個引子源自SEQ ID NO:18之5'的序列且另一個引子源自SEQ ID NO:18之3'的序列，其中此等DNA分子適於用作DNA擴增法中之DNA引子。當DNA擴增法中使用此等DNA引子所生成之擴增子含有SEQ ID NO:18時，該擴增子可診斷大豆品系MON87705。本發明之一態樣為由與任一部分SEQ ID NO:5同源或互補之DNA引子生成的任何擴增子，及包含SEQ ID NO:18之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供檢測樣本中對應於大豆品系MON87705之DNA之存在的方法。該等方法包含：(a)使包含DNA之樣本與引子組接觸，當其與來自大豆品系MON87705之基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時生成可診斷大豆品系MON87705之擴增子；(b)進行核酸擴增反應，從而生成擴增子；及(c)檢測擴增子，其中該擴增子包含一或多種下列序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18。
本發明之另一態樣為MON87705品系之大豆植物或種子，或含有MON87705品系之植物或種子之產品，其中基因組DNA包含基本上由約位置1至3458之SEQ ID NO:3核苷酸序列、約位置1至7251之SEQ ID NO:5核苷酸序列及約位置1至2515之SEQ ID NO:4核苷酸序列(其之連續體(contig)呈現為SEQ ID NO:6)及其互補體組成之DNA分子。本發明之又一態樣為MON87705之大豆植物或種子，或源自MON87705之植物或種子之產品，其中基因組DNA包含基本上由約位置1至13224之SEQ ID NO:6核苷酸序列及其互補體組成之DNA分子。一種MON87705之大豆植物或種子，或源自MON87705之植物或種子之產品，其中當基因組DNA自大豆植物或種子或產品中分離時包含並有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18及其互補體之DNA分子。在本發明之一態樣中，DNA分子含有大豆品系MON87705。在另一態樣中，含有大豆品系MON87705之DNA分子之兩種複本存在於大豆植物中。在另一態樣中，含有大豆品系MON87705之DNA分子之一種複本存在於大豆植物中。
本發明之另一態樣為MON87705品系之大豆植物或種子，或含有MON87705品系之植物或種子之產品，其中當基因組DNA自大豆植物或種子或產品中分離時在DNA擴增法中生成擴增子，其中該擴增子包含至少一種來自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的序列。
在另一態樣中，可將大豆植物之種子置於容器中。如本文所使用，容器為能夠儲存該等種子之任何物件。容器較佳含有大於約500、1,000、5,000或25,000個種子，其中至少約10%、25%、50%、75%或100%種子係源自本發明之植物。本發明亦提供具有超過約10,000個，更佳約20,000個，且甚至更佳約40,000個種子之容器，其中超過約10%，更佳約25%，更佳50%且甚至更佳約75%或90%之種子為源自本發明之植物的種子。本發明亦提供具有超過約10kg，更佳約25kg，且甚至更佳約50kg種子之容器，其中超過約10%，更佳約25%，更佳約50%且甚至更佳約75%或90%之種子為源自本發明之植物的種子。
本發明之另一態樣提供一種檢測生物樣本中大豆基因轉殖品系MON87705存在或不存在的方法，其包含a)自該樣本提取DNA；及b)檢定具有對應於SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18中所示之序列的聚核苷酸存在或不存在，藉此確定該樣本中大豆品系MON87705存在或不存在。
根據本發明之另一態樣，提供檢測樣本中對應於MON87705品系之DNA之存在的方法，其包含：(a)使樣本與探針接觸，該探針與選自由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2及其互補體組成之群之序列在嚴格雜交條件下雜交，且與不包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之大豆植物DNA在嚴格雜交條件下不雜交；(b)使樣本及探針經歷嚴格雜交條件；及(c)檢測探針與該樣本之結合；其中結合可診斷該樣本中該DNA之存在。本發明之另一態樣為包含約11個至約20個連續核苷酸長度之探針，其用於檢測生物樣本中大豆品系MON87705之存在，其中該連續核苷酸係選自由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2及其互補體組成之群。探針可為脫氧核糖核酸、核糖核酸或核苷酸類似物。探針可經至少一個螢光團標記。
本發明之另一態樣為一種測定大豆品系MON87705之子代之接合性的方法，該方法包含：(a)使包含大豆DNA之樣本與引子組SQ21928(SEQ ID NO:11)、SQ20901(SEQ ID NO:12)及經6FAMTM標記之PB10164探針(SEQ ID NO:13)接觸，當其與來自大豆品系MON87705之基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時生成第一擴增子，自引子SQ21928及SQ20901與經6FAMTM標記之引子/PB10164探針之組合釋放螢光信號，其可診斷大豆品系MON87705；(b)進行核酸擴增反應，從而生成第一擴增子；及(c)檢測該第一擴增子；及(d)使包含大豆DNA之樣本與引子組SQ21928(SEQ ID NO:11)及SQ21905(SEQ ID NO:15)及經VICTM標記之PB10335(SEQ ID NO:14)接觸，當其與來自大豆植物之基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時生成第二擴增子，釋放螢光信號，該信號可診斷與經鑑別為大豆品系MON87705之轉殖基因插入之大豆基因組區同源的野生型大豆基因組DNA；(e)進行核酸擴增反應，從而生成第二擴增子；及(f)檢測該第二擴增子；及(g)比較樣本中第一及第二擴增子，其中兩種擴增子皆存在表明該樣本為轉殖基因插入之異型接合子。
本發明之另一態樣為一種測定大豆品系MON87705之子代之接合性的方法，該方法包含：(a)使包含大豆DNA之樣本與引子組SQ21928(SEQ ID NO:11)、SQ20901(SEQ ID NO:12)及SQ21905(SEQ ID NO:15)接觸，當該引子組與來自大豆品系MON87705之基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時，自引子SQ21928與SQ20901之組合生成第一擴增子，其可診斷大豆品系MON87705；(b)進行核酸擴增反應，從而生成第一擴增子；及(c)檢測該第一擴增子；及(d)使包含大豆DNA之樣本與引子組SQ21928及SQ21905接觸，當其與來自大豆植物之基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時，自引子SQ21928與SQ21905之組合生成第二擴增子，其可診斷與經鑑別為大豆品系MON87705之轉殖基因插入之大豆基因組區同源的野生型大豆基因組DNA；(e)進行核酸擴增反應，從而生成第二擴增子；及(f)檢測該第二擴增子；及(g)比較樣本中第一及第二擴增子，其中兩種擴增子皆存在表明該樣本為轉殖基因插入之異型接合子。
本發明亦提供一種組合物，其具有選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的DNA分子，其中該組合物為選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白及植脂奶油(whipped topping)組成之群的商品產品。
本發明之另一態樣為一種檢測生物樣本中用於診斷大豆品系MON87705之存在的核苷酸序列之存在的方法，其包含檢測以下核苷酸序列之存在，其中該序列係選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群，其中該生物樣本係選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白及植脂奶油組成之群。
提供用於檢測大豆樣本中大豆品系MON87705之套組，其包含基於檢測SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18中所示之一或多種序列而設計之核苷酸組件。提供用於檢測大豆品系MON87705之套組，其使用自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5設計之引子。當使用該套組生成之擴增子含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18中所列出之一或多種核苷酸序列時，該擴增子可診斷MON87705。
本發明之另一態樣為一種生成包含改變之脂肪酸含量之大豆植物的方法，其包含使包含大豆品系MON87705之植物與無大豆品系MON87705之大豆植物雜交以獲得包含該大豆品系MON87705及改變之脂肪酸含量之植物，其中包含該品系之種子的代表性樣本係以ATCC寄存編號PTA-9241存放。
本發明亦提供一種生成包含大豆品系MON87705之大豆變種的方法，其包含使大豆品系MON87769回交成該變種，其中包含該品系之種子的代表性樣本係以ATCC寄存編號PTA-9241存放。
本發明之另一態樣為一種大豆植物，其能夠生成具有包含約55-80%油酸及小於8%飽和脂肪酸之油組合物的種子，其中該油組合物之遺傳決定子可自ATCC寄存編號PTA-9241之大豆獲得。本發明亦提供自大豆植物之種子獲得的油組合物及源自選自由以下組成之群之油的商品產品：烹調油、沙拉油、酥油、卵磷脂、無毒塑膠、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品、毛髮護理產品及生物柴油。
本發明之油可能與其他油摻合。在一態樣中，自本發明之植物製造之油或藉由本發明之方法產生之油構成任何產品之以體積或重量計大於0.5%、1%、5%、10%、25%、50%、75%或90%之油組份。在另一態樣中，油製劑可能經摻合且可構成以體積計大於10%、25%、35%、50%或75%之摻合物。自本發明之植物製造之油可與一或多種有機溶劑或石油餾出物混合。
本發明之又一態樣為一種大豆細胞之基因組，其包含序列選自由下列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18之序列組成之群的聚核苷酸。
本發明之另一態樣為MON87705之大豆植物，或種子，或種子後代，或源自MON87705之植物或種子之產品。本發明之一態樣為為種植或製造商品產品而銷售之種子。該等商品產品包括(但不限於)整粒大豆種子或經加工之大豆種子、動物飼料、植物油、粕粉、豆粉、無毒塑膠、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品、毛髮護理產品、豆漿、大豆果仁醬(soy nut butter)、納豆、天貝(tempeh)、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、植脂奶油、烹調油、沙拉油、酥油、卵磷脂、可食用之整粒大豆(未加工、經焙燒或作為毛豆(edamam))、豆漿、大豆酸酪乳、豆腐乳、豆腐、腐竹及生物柴油。
本發明之上述及其他態樣將由以下實施方式變得更顯而易見。
 序列簡單說明
SEQ ID NO:1：表示介於大豆基因組DNA與整合T-DNA之間之5'左邊界接合的20個核苷酸序列。此序列對應於SEQ ID NO:6之位置3413至3432。此外，SEQ ID NO:1(圖2之[A])為對應於SEQ ID NO:3([C]，參見圖2)之位置3432至3422的核苷酸序列，且整合T-DNA之整合5'左邊界對應於SEQ ID NO:5([E]，參見圖2)之位置1至10。
SEQ ID NO:2：表示介於整合T-DNA與大豆基因組DNA之間之3'左邊界接合的20個核苷酸序列。此序列對應於SEQ ID NO:6之位置10664至10683。此外，SEQ ID NO:2([B]，參見圖2)為對應於SEQ ID NO:5([E]，參見圖2)之位置7242至7251的核苷酸序列，且3'側接序列對應於SEQ ID NO:4([D]，參見圖2)之位置1至10。
SEQ ID NO:3：與MON87705之插入DNA側接直至T-DNA插入之5'序列。
SEQ ID NO:4：與MON87705之插入DNA側接直至T-DNA插入之3'序列。
SEQ ID NO:5：插入之T-DNA序列，包括整合之後剩餘之邊界序列。
SEQ ID NO:6：表示與MON87705之插入DNA側接之5'序列、整合表現卡匣(SEQ ID NO:5)之序列及與MON87705之插入DNA側接之3'序列(SEQ ID NO:4)之連續體的13188bp核苷酸序列。
SEQ ID NO:7：表示當由共整合pMON95829 T-DNA而組裝於MON87705中時之aroA-CP4表現卡匣及FAD2-1A/FATB抑制卡匣的6583bp核苷酸序列。
SEQ ID NO:8：用於鑑別MON87705品系之引子SQ20129。引子SQ20129對應於接近3'左邊界之所插入T-DNA的3'中之區，該區對應於SEQ ID NO:6之位置10645至10663。使用引子SQ20129與SQ20130之組合生成之PCR擴增子證實(positive)品系MON87705存在。
SEQ ID NO:9：用於鑑別MON87705之引子SQ20130。引子SQ20130與對應於SEQ ID NO:6之位置10688至10707的T-DNA插入邊界之3'區互補。使用引子SQ20129與SQ20130之組合生成之PCR擴增子證實品系MON87705存在。
SEQ ID NO:10：用於鑑別MON87705品系之探針PB10043。此探針為經6FAMTM標記的序列對應於SEQ ID NO:6之位置10666至10686之合成寡核苷酸。螢光信號在使用引子SQ20129與SQ20130以及經6FAMTM標記之探針PB10043的擴增反應中之釋放可診斷品系MON87705。
SEQ ID NO:11：用於鑑別MON87705品系之引子SQ21928。引子SQ21928與對應於SEQ ID NO:6之位置10675至10699的T-DNA插入邊界之3'區互補。使用引子SQ20901與SQ21928之組合生成之PCR擴增子證實品系MON87705存在。引子SQ21928亦用於測定MON87705品系之接合性。在接合性檢定中使用經6FAMTM標記之探針PB10335以及引子SQ21928及SQ21905檢測PCR擴增子及螢光信號之釋放證實野生型存在。該序列之18個鹼基對對應於SEQ ID NO:6之位置1053至1070，且其餘7個鹼基對對應於展示為SEQ ID NO:17之野生型序列之40個鹼基對區中之7個鹼基對，其在產生MON87705品系時丟失。
SEQ ID NO:12：用於鑑別MON87705品系之引子SQ20901。引子SQ20129對應於接近3'左邊界之所插入T-DNA的3'中之區，該區對應於SEQ ID NO:6之位置10624至10647。由引子SQ21928與SQ20901之組合生成之PCR擴增子證實品系MON87705存在。
SEQ ID NO:13：用於鑑別MON87705品系之探針PB10164。此探針為經6FAMTM標記的序列對應於SEQ ID NO:6之位置10651至10670之合成寡核苷酸。螢光信號在使用引子SQ21928與SQ20901以及經6FAMTM標記之探針PB10164的擴增反應中之釋放可診斷品系MON87705。
SEQ ID NO:14：用於測定MON87705品系之接合性之探針PB10335。此探針為經VICTM標記的序列對應於野生型基因組DNA之區之合成寡核苷酸。在品系MON87705之接合性檢定中使用引子SQ21928與SQ21905所生成之PCR擴增子造成使用探針PB10335之螢光信號之釋放，其證實野生型等位基因存在。此序列對應於列為SEQ ID NO:17之40個鹼基對野生型序列之位置12至31，其在產生MON87705品系時丟失。
SEQ ID NO:15：用於測定MON87705品系之接合性之引子SQ21905。在接合性檢定中使用經6FAMTM標記之探針PB10335以及引子SQ21928與SQ21905檢測PCR擴增子證實野生型存在。序列之16個鹼基對對應於SEQ ID NO:6之位置1037至1052，同時此引子保留列為SEQ ID NO:16之野生型序列之40個鹼基對區中之10個鹼基對，其在產生MON87705品系時丟失。
SEQ ID NO:16：在與串聯重複序列(SEQ ID NO:17)及5'基因組序列之接合處丟失的40個鹼基對序列。此序列係在野生型中所見，且若其未在產生MON87705品系之過程中丟失，則將位於SEQ ID NO:6之鹼基對1052與1053之間。由於產生MON87705品系後基因組序列之複製，因此末端12個鹼基序列亦位於SEQ ID NO:6之位置10670至10681，但其餘28個鹼基對完全自MON87705品系缺失且因此可能在接合性檢定中用於鑑別野生型。
SEQ ID NO:17：此2370bp序列為顯然在產生MON87705品系後複製之野生型基因組序列之一部分。此複製區對應於SEQ ID NO:6之位置1053至3422且幾乎與位置10682至13051一致。當與插入序列之3'端及大豆基因組序列比較時，此區中基於複製GenomewalkerTM之純系在位於插入序列之5'端上之重複序列中具有兩個錯配。5'重複序列中兩個改變之鹼基連同複製序列(SEQ ID NO:16)之5'端上發現之缺失一起引導吾人發現另外之事實：對應於位置1053至3422之串聯序列為新近生成之序列，而對應於位置10682至13051之序列為初始野生型序列。
SEQ ID NO:18：此106bp序列跨過兩個pMON95829 T-DNA共整合後產生之右邊界-右邊界接合，從而獲得品系MON87705。其以抑制標靶FATB之20個鹼基(來自反向重複序列之各臂者)起始及終止，且含有在整合MON87705品系中所見之序列時生成之剩餘邊界序列及插入序列。此序列對應於SEQ ID NO:6之位置9230至9335。儘管此序列位於抑制卡匣內，但由於兩種T-DNA活體內組裝之隨機性，因此該序列組合為MON87705品系所獨有。
SEQ ID NO:19：與AP2組合用於次級(巢式)PCR以擴增源自GenomewalkerTM之5'側接延伸的引子24894。此序列對應於SEQ ID NO:6之位置3722至3748。
SEQ ID NO:20：與AP1組合用於初級PCR以擴增源自GenomewalkerTM之5'側接延伸的引子24895。此序列對應於SEQ ID NO:6之位置3798至3827。
提供以下定義及方法以較佳定義本發明且指導實踐本發明之一般技術者。除非另有說明，否則術語係根據一般技術者所習知之用法來理解。分子生物學中常見術語之定義亦可見於Rieger等人，Glossary of Genetics:Classical and Molecular，第五版，Springer-Verlag:New York,1991；及Lewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994。
如本文中所用，術語「大豆(soybean)」意謂大豆(Glyycine max)，且包括所有可用大豆育種之植物變種，包括野生大豆物種以及屬於允許物種之間育種之野生大豆(Glycine soja)的植物。
「草甘膦(glyphosate)」係指N-膦醯甲基甘胺酸及其鹽。N-膦醯甲基甘胺酸為對廣譜植物物種具有活性之熟知除草劑。
「脫飽和酶」係指可使一或多種脂肪酸不飽和或在一或多種脂肪酸之連續碳之間催化形成雙鍵以生成單不飽和脂肪酸或多不飽和脂肪酸或其前驅體的多肽。可將油酸催化轉化成為亞麻油酸或亞麻油酸催化轉化成為α-次亞麻油酸的多肽尤其引人關注，其包括使12或15位置處不飽和之酶。選擇具有脫飽和酶活性之特異性多肽之考慮因素包括(但不限於)：多肽之最佳pH值；多肽是否為速率限制酶或其組件；所用之脫飽和酶對於所需PUFA之合成是否必不可少；及/或該多肽是否需要輔因子。所述表現多肽較佳具有與其在宿主細胞中之位置之生物化學環境相容之特徵。舉例而言，該多肽可能必須競爭以與受質結合。內源性脫飽和酶亦可為基因抑制之標靶。
「硫酯酶」係指尤其在硫氫基處可水解分子之硫酯鍵(在水存在下分解酯鍵成酸及醇)的多肽。可催化水解醯基醯基載體蛋白(醯基ACP)，尤其硬脂醯基ACP及軟脂醯基ACP受質中所包含之硫酯鍵的多肽尤其引人關注。該水解生成游離脂肪酸及ACP，從而終止位於質體中之植物脂肪酸生物合成且為向細胞質輸出脂肪酸作好準備。選擇具有硫酯酶活性之特異性多肽之考慮因素包括(但不限於)：多肽之最佳pH值；多肽是否為速率限制酶或其組件；及所用之硫酯酶對於增加飽和脂肪酸產量是否必不可少。所述表現多肽較佳具有與其在宿主細胞中之位置之生物化學環境相容之特徵。舉例而言，該多肽可能必須競爭以與受質結合。內源性硫酯酶亦可為基因抑制之標靶。
「商品產品」係指由源自大豆或大豆油之物質構成且銷售給消費者之任何產品。經加工之大豆為世界上蛋白飼料及植物油之最大來源。大豆植物MON87705可用以製造通常自大豆獲得之商品。MON87705大豆可經加工成粕粉、豆粉或油以及用作陸生動物及水生動物動物飼料中之蛋白或油之來源。來自MON87705之大豆及大豆油可用於製造許多不同產品，但不限於無毒塑膠、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品及毛髮護理產品。MON87705之大豆及油可適用於各種由整粒大豆製成之大豆食品中，諸如豆漿、大豆果仁醬、納豆及天貝，及由經加工之大豆及大豆油製成之大豆食品中，包括大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、植脂奶油、烹調油、沙拉油、酥油及卵磷脂。整粒大豆亦可食用，且通常以未加工、經焙燒或作為毛豆之形式銷售給消費者。通常藉由浸泡並研磨整粒大豆而生成之豆漿，可能無需其他加工而消費、可能經噴霧乾燥，或可能加工形成大豆酸酪乳、豆腐乳、豆腐或腐竹。
MON87705之油可用於製造生物柴油。與石油柴油燃料相比較，在習知柴油引擎中使用生物柴油使得污染物(諸如硫酸鹽、一氧化碳及微粒)實質上減少，且用於校車中時可極大減少曝露於毒性柴油機排氣中。生物柴油通常係藉由提取、過濾及精煉大豆油以移除游離脂肪及磷脂，且隨後將該油與甲醇進行轉酯化以形成脂肪酸甲酯而獲得(參見例如美國專利第5,891,203號)。所得大豆甲酯通常稱為「生物柴油」。源自MON87705之油亦可在不形成甲酯之情況下用作柴油，諸如藉由混合縮醛與該油(參見例如美國專利第6,013,114號)。用於製造該等油之MON87705種子可藉由本發明之方法鑑別。預期來自MON87705品系種子或一些或所有種子為MON87705之種子混合物的精煉油將相對不具有可用於測試之DNA。然而，用以提取油之種子可用本發明之方法表徵以鑑別用於製造該等油之種子群體中MON87705品系之存在。來自用於製造該等油之製程的植物廢料(plant waste)亦可用於本發明之方法中以鑑別經加工以製造該等油之種子混合物中MON87705品系之存在。同樣，在製造商品產品之後留下之植物殘體，或繼收集大豆種子之後留下之植物殘體，可藉由本發明之方法表徵以鑑別用於製造該等商品產品之原料中之MON87705品系。
本發明亦包括摻合或未摻合之MON87705大豆油。該油可能與其他油摻合。在一較佳實施例中，自本發明之植物製造之油或藉由本發明之方法生成之油構成任何產品之以體積或重量計大於0.5%、1%、5%、10%、25%、50%、75%或90%之油組份。在另一實施例中，油製劑可能經摻合且可構成以體積計大於10%、25%、35%、50%或75%之摻合物。自本發明之植物製造之油可與一或多種有機溶劑或石油餾出物混合。
基因轉殖「品系」係藉由用異源DNA(亦即包括所關注之轉殖基因的核酸構築體)使植物細胞轉型，使由轉殖基因插入植物之基因組中而產生之植物群體再生，及選擇特徵在於插入特定基因組位置中的特定植物而生成。術語「品系」係指包括異源DNA的初始轉型體及轉型體之子代。術語「品系」亦係指藉由在轉型體與子代包含異源DNA之另一變種之間進行有性異型雜交而產生的子代。甚至在重複回交至輪回親本(recurrent parent)後，來自初始轉型之插入DNA及側接DNA亦可能存在於雜交子代中之相同染色體位置處。術語「品系」亦係指由於包括插入DNA之一個親本系(例如，初始轉型體及由自花授粉產生之子代)與不含插入DNA之親本系的有性雜交，預期將轉移至接受包括所關注之轉殖基因的插入DNA之子代的來自初始轉型體之DNA，其包含插入DNA及直接鄰近於插入DNA之側接基因組序列。本發明係關於品系MON87705 DNA、源自MON87705之植物細胞、組織、種子及加工產品。
亦應瞭解亦可將兩個不同基因轉殖植物或一種基因轉殖植物與一種野生型植物配對以產生含有兩個獨立地分開添加之外源基因的後代。該後代可為該等基因之同型接合子或異型接合子。適當子代之自花授粉可產生對於所添加之兩種外源基因而言為同型接合子的植物。當無性繁殖時亦涵蓋回交至親本植物及與非基因轉殖植物異型雜交。其他常用於不同性狀及作物的育種方法之描述可見於若干參考文獻之一，例如於Fehr之Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.編，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)中。
如本文所使用，當提及「分離之DNA分子」時，意謂該DNA分子為單獨或與其他組合物組合存在，但不在天然環境內。舉例而言，大豆基因組之DNA內天然所見的編碼序列、內含子序列、未轉譯前導序列、啟動子序列、轉錄終止序列及其類似物只要在大豆基因組內，則並不認為彼等與大豆基因組分離。然而，只要該等結構及組件不在大豆基因組內，則在本揭示案之範疇內，此等組件及此等組件之子部分各經「分離」。為本揭示之目的，任何基因轉殖核苷酸序列，亦即插入大豆植物品系MON87705之細胞基因組中的DNA之核苷酸序列皆視為分離之核苷酸序列，無論其是否存在於用於使產生MON87705品系之大豆細胞轉型的質體中，存在於品系MON87705之基因組內，以可檢測量存在於源自品系MON87705之組織、子代、生物樣本或商業產品中。若DNA分子可自植物或種子或植物器官的細胞或組織或勻漿提取；或可以擴增子形式由植物或種子或植物器官(任一源自該等源自品系MON87705之材料)之細胞或組織或勻漿提取的DNA或RNA產生，則該核苷酸序列或由其獲得之任何片段被視為經分離或可分離的。就此而言，如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18所闡明之接合序列及亦含有此等接合序列的源自品系MON87705之核苷酸序列視為經分離或可分離的，無論此等序列是否存在於品系MON87705之細胞基因組內，或以可檢測量存在於源自品系MON87705之組織、子代、生物樣本或商業產品內。
本發明之DNA分子亦可為重組DNA分子。如本文所使用，術語重組體意謂以任何方式間接來自或得自人類操縱核酸分子的任何藥劑(例如DNA、肽等)。
「探針」為一種連接例如放射性同位素、配位體、化學發光劑或酶之習知可檢測標記或報導分子之分離核酸。該探針與標靶核酸鏈互補，在本發明之情況下，與來自大豆品系MON87705(無論來自大豆植物抑或來自包括該品系之DNA之樣本)的基因組DNA鏈互補。根據本發明之探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，且亦包括特異性結合標靶DNA序列的聚醯胺及其他探針材料且該結合可用於檢測彼標靶DNA序列之存在。
「引子」為分離核酸，其藉由核酸雜交而黏接於互補標靶DNA鏈以在引子與標靶DNA鏈之間形成雜交，接著藉由例如DNA聚合酶之聚合酶沿標靶DNA鏈延伸。本發明之引子對係指彼等例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)或其他習知核酸擴增法擴增標靶核酸序列之用途。
一般而言，探針及引子為11個核苷酸或11個以上核苷酸長，較佳15個核苷酸或15個以上核苷酸長，更佳18個核苷酸或18個以上核苷酸長，更佳20個核苷酸或20個以上核苷酸長，更佳24個核苷酸或24個以上核苷酸長，且最佳30個核苷酸或30個以上核苷酸長。該等探針及引子在高嚴格性雜交條件下與標靶序列特異性雜交。儘管可藉由習知方法來設計保留與標靶序列雜交之能力且與標靶序列不同之探針，但根據本發明之探針及引子較佳地與標靶序列具有完全序列相似性。
用於製備且使用探針及引子之方法係描述於例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Sambrook等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989(下文「Sambrook等人，1989」)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)(下文「Ausubel等人，1992」)；及Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press:San Diego,1990中。例如，可藉由使用意欲用於彼目的之諸如Primer(0.5版， 1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)之電腦程式自已知序列產生PCR引子對。
本文揭示之基於側接DNA及插入序列之引子及探針可例如藉由再選殖及定序該等序列之習知方法用於證實(且必要時修正)所揭示之序列。
本發明之核酸探針及引子在嚴格條件下與標靶DNA序列雜交。可使用任何習知核酸雜交或擴增方法來鑑別樣本中來自基因轉殖品系的DNA之存在。核酸分子或其片段能夠在特定情況下與其他核酸分子特異性雜交。如本文所使用，若兩個核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結構，則該兩個分子據稱能夠彼此特異性雜交。若兩個核酸分子顯示完全互補性，則一個核酸分子據稱為另一個核酸分子之「互補體」。如本文所使用，當一個分子之每個核苷酸與另一個分子之核苷酸皆互補時，該等分子據稱顯示「完全互補性」。若兩個分子可在至少習知「低嚴格性」條件下以足以允許其保持彼此黏接之穩定性彼此雜交，則其據稱為「最低互補」。類似地，若該等分子可在習知「高嚴格性」條件下以足以允許其保持彼此黏接之穩定性彼此雜交，則其據稱為「互補」。Sambrook等人，1989及Haymes等人於Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,DC(1985)中描述習知嚴格條件。因此，可允許偏離完全互補性，只要該等偏離並不完全排除分子形成雙鏈結構之能力。為使核酸分子充當引子或探針，其僅需在序列上充分互補以能夠在所採用之特定溶劑及鹽濃度下形成穩定雙鏈結構。
如本文所使用，實質上同源序列為在高嚴格性條件下與其所比較之核酸序列之互補體特異性雜交的核酸序列。熟習此項技術者已知促進DNA雜交之適當嚴格性條件，例如在約45℃下6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50℃下以2.0×SSC洗滌，或該等條件可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley ＆ Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。舉例而言，洗滌步驟中之鹽濃度可選自50℃下約2.0×SSC之低嚴格性至50℃下約0.2×SSC之高嚴格性。另外，洗滌步驟中之溫度可自室溫(約22℃)下之低嚴格性條件增加至約65℃下之高嚴格性條件。溫度與鹽均可變化，或者溫度或鹽濃度之一可保持恆定，而改變另一變數。在一實施例中，本發明之核酸將在中等嚴格條件下(例如，在約2.0×SSC及約65℃下)與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所闡明的一或多個核酸分子或其互補體或任一者之片段特異性雜交。在一尤其較佳實施例中，本發明之核酸將在高嚴格性條件下與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所闡明的一或多個核酸分子或其互補體或任一者之片段特異性雜交。在本發明之一態樣中，本發明之標記核酸分子具有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所闡明之核酸序列或其互補體或任一者之片段。在本發明之另一態樣中，本發明之標記核酸分子與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所闡明之核酸序列或其互補體或任一者之片段具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及100%之序列一致性。在本發明之另一態樣中，本發明之標記核酸分子與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所闡明之序列或其互補體或任一者之片段具有95%、96%、97%、98%、99%及100%之序列一致性。SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2可能用作植物育種方法中之標記以鑑別遺傳雜交之子代，類似於「DNA markers:Protocols,applications,and overviews:(1997)173-185,Cregan等人編，Wiley-Liss NY中關於簡單重複序列DNA標記分析所述之方法，其之所有以引用的方式併入本文中。可藉由熟習此項技術者已知之許多方法來檢測探針與標靶DNA分子之雜交，此等方法可包括(但不限於)螢光標籤、放射性標籤、基於抗體之標籤及化學發光標籤。
關於使用特定擴增引子對來擴增標靶核酸序列(例如藉由PCR)，「嚴格條件」為允許引子對僅與具有對應野生型序列(或其互補體)的引子將結合之標靶核酸序列雜交且較佳地在DNA熱擴增反應中產生獨特擴增產物(擴增子)之條件。
術語「(標靶序列)特異性」指示探針或引子在嚴格雜交條件下僅與包含標靶序列之樣本中的標靶序列雜交。
如本文所使用，「擴增DNA」或「擴增子」係指為核酸模板之一部分之標靶核酸序列之核酸擴增產物。舉例而言，為確定由有性雜交產生之大豆植物是否含有來自本發明大豆植物之基因轉殖品系基因組DNA，使用引子對使自大豆植物組織樣本提取之DNA經歷核酸擴增方法，該引子對包括源自該植物之基因組中的鄰近於插入之異源DNA之插入位點的側接序列之一引子，及源自插入之異源DNA之第二引子，以產生可診斷該品系DNA之存在的擴增子。該擴增子具有一定長度且具有亦可診斷該品系之序列。擴增子之長度可在引子對加上一個核苷酸鹼基對、較佳加上約50個核苷酸鹼基對、更佳加上約250個核苷酸鹼基對、且甚至更佳加上約450個核苷酸鹼基對之組合長度範圍內。或者，引子對可源自於插入之DNA兩側上側接序列，以便產生包括整個插入物核苷酸序列之擴增子。源自植物基因組序列之引子對的成員可能位於距插入之DNA分子一定距離處，該距離可在一個核苷酸鹼基對至多達約兩萬個核苷酸鹼基對之範圍內。使用術語「擴增子」特異性排除可在DNA熱擴增反應中形成之引子二聚體。
可藉由此項技術中已知之各種核酸擴增方法中的任一種，包括聚合酶鏈反應(PCR)來實現核酸擴增。各種擴增方法在此項技術中已知且係描述於美國專利第4,683,195號及第4,683,202號及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人編，Academic Press,San Diego,1990中。已開發PCR擴增方法來擴增多達22kb(千鹼基)之基因組DNA及多達42kb之噬菌體DNA(Cheng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699,1994)。此等方法以及其他在DNA擴增技術中已知之方法可用於實踐本發明。來自種子樣本以ATCC PTA-9241存放之大豆品系MON87705的異源DNA插入序列或側接序列可藉由使用源自本文中提供之序列的引子來擴增該等來自該品系之序列，接著對PCR擴增子或選殖DNA進行標準DNA定序而得以證實(且必要時修正)。
可藉由複數種技術來檢測由該等方法產生之擴增子。一種該方法為Genetic Bit Analysis(Nikiforov等人，Nucleic Acid Res. 22:4167-4175,1994)，其中DNA寡核苷酸經設計與鄰近側接基因組DNA序列及插入DNA序列重疊。將寡核苷酸固定於微孔盤之孔中。在(使用插入序列中之一個引子及鄰近側接基因組序列中之一個引子)使所關注區域PCR後，可使單鏈PCR產物與固定化寡核苷酸雜交且充當使用DNA聚合酶及對預期下一個鹼基具有特異性之經標記三磷酸二脫氧核苷酸(ddNTP)的單鹼基延伸反應之模板。讀出可基於螢光或ELISA。信號指示由於成功擴增、雜交及單鹼基延伸而存在插入/側接序列。
另一方法為如Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24,2000)所述之焦磷酸定序(Pyrosequencing)技術。在此方法中，寡核苷酸經設計與鄰近基因組DNA及插入DNA接合重疊。使寡核苷酸與來自所關注區域之單鏈PCR產物雜交(一個引子在插入序列中且一個引子在側接基因組序列中)，且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5'磷醯硫酸及螢光素存在下培育。單獨添加dNTP且該併入產生所量測之光信號。光信號指示由於成功擴增、雜交及單或多鹼基延伸而存在轉殖基因插入/側接序列。
如Chen等人(Genome Res. 9:492-498,1999)所述之螢光偏振為可用於檢測本發明之擴增子的方法。使用此方法，寡核苷酸經設計與側接基因組及插入DNA接合重疊。使寡核苷酸與來自所關注區域的單鏈PCR產物雜交(一個引子在插入DNA中且一個引子在側接基因組DNA序列中)且在DNA聚合酶及經螢光標記之ddNTP存在下培育。單鹼基延伸引起ddNTP之併入。使用螢光計，可以偏振之變化來量測併入。偏振之變化指示由於成功擴增、雜交及單鹼基延伸而存在轉殖基因插入/側接序列。
TaqMan(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)係描述為檢測且定量DNA序列之存在的方法且於製造商所提供之說明書中充分瞭解。簡言之，FRET(螢光共振能量轉移)寡核苷酸探針經設計與側接基因組及插入DNA接合重疊。在熱穩定聚合酶及dNTP存在下循環FRET探針及PCR引子(一個引子在插入DNA序列中且一個引子在側接基因組序列中)。FRET探針之雜交引起遠離FRET探針上之淬滅部分之螢光部分裂解及釋放。螢光信號指示由於成功擴增及雜交而存在側接/轉殖基因插入序列。
如Tyangi等人(Nature Biotech.14:303-308,1996)中所述，已描述將分子信標(Molecular Beacon)用於序列檢測。簡言之，FRET寡核苷酸探針經設計與側接基因組及插入DNA接合重疊。FRET探針之獨特結構使其含有保持螢光及淬滅部分緊密接近之二級結構。在熱穩定聚合酶及dNTP存在下，使FRET探針及PCR引子(一個引子在插入DNA序列中且一個引子在側接基因組序列中)循環。在成功PCR擴增後，FRET探針與標靶序列之雜交引起探針二級結構之移除及螢光與淬滅部分之空間分離，其產生螢光信號。螢光信號指示由於成功擴增及雜交而存在側接/轉殖基因插入序列。
其他描述方法，諸如微流體(美國專利公開案第2006068398號，美國專利第6,544,734號)，提供分離且擴增DNA樣本之方法及裝置。使用光學染料來檢測且定量特異性DNA分子(WO/05017181)。包含用於檢測DNA分子之電子感應器的奈米管裝置(WO/06024023)或結合特異性DNA分子的奈米珠粒，且隨後可經檢測。
可使用本文中揭示之組合物及DNA檢測技術中熟知之方法來開發DNA檢測套組。該等套組適用於鑑別樣本中之大豆品系MON87705 DNA且可應用於用於育種含有適當品系DNA之大豆植物的方法。該等套組可能含有與SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5同源或互補之DNA引子或探針或與DNA之轉殖基因遺傳元件中所包含之DNA同源或互補之DNA引子或探針。此等DNA序列可用於DNA擴增反應或在DNA雜交方法中用作探針。MON87705大豆基因組中所包含之基因組DNA及轉殖基因遺傳元件之序列係在圖2中說明；T-DNA中所包含之轉殖基因遺傳元件係如下組織：第一T-DNA以章魚鹼(octopine)左邊界序列開始，隨後為由來自玄參嵌紋病毒(FMV)之35S強化子及來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)Tsf1基因之啟動子、內含子及前導序列構成之第一人工基因，該第一人工基因下游為與最佳化aroA-CP4融合之ShkG轉運肽，該ShkG轉運肽下游為來自豌豆(Pisum sativum)之RbcS2(E9)基因之3' UTR，隨後為由來自β-伴大豆球蛋白基因之大豆7S α'初發(prime)次單元之啟動子及前導序列構成之第二卡匣，該第二卡匣下游為含有與大豆FAD2及FATB基因同源之序列之反向重複序列的有義部分(sense half)，該有義部分下游為胭脂鹼右邊界序列。第二T-DNA以胭脂鹼右邊界序列開始，該右邊界序列下游為含有與大豆FAD2及FATB基因同源之序列之反向重複序列的反義部分(antisense half)，該反義部分下游為海島棉(Gossypium barbadense(Sea island cotton))H6基因之3'UTR，該3' UTR下游為章魚鹼左邊界序列。當存在於SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4中時，源自此等序列之引子分子可用作引子組之一部分，該引子組亦包括源自側接品系MON87705之轉殖基因插入物之基因組的DNA引子分子。
本發明包括一種大豆植物，其包含DNA分子，該DNA分子包含序列選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群或與選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的序列互補的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明包括一種大豆植物部分，其中該植物部分包含序列選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群或與選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的序列互補的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明包括大豆植物之子代，其中該子代包含序列選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群或與選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的序列互補的聚核苷酸。
本發明亦包括一種大豆植物，其能夠生成具有包含約55-80%油酸及小於8%飽和脂肪酸之油組合物的種子，其中該油組合物之遺傳決定子可自ATCC寄存編號PTA-9241之大豆獲得。在另一態樣中，本發明包括一種生成包含改變之脂肪酸含量之大豆植物的方法，其包含使包含大豆品系MON87705之植物與無大豆品系MON87705之大豆植物雜交以獲得包含該大豆品系MON87705及改變之脂肪酸含量之植物，其中包含該品系之種子的代表性樣本係以ATCC寄存編號PTA-9241存放。在另一態樣中，本發明亦包括一種生成包含大豆品系MON87705之大豆變種的方法，其包含使大豆品系MON87769回交成該變種，其中包含該品系之種子的代表性樣本係以ATCC寄存編號PTA-9241存放。
本發明亦包括一種油組合物，其自包含DNA分子之種子獲得，該DNA分子包含序列選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群或與選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的序列互補的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明包括一種源自油組合物之商品產品，其選自由以下組成之群：烹調油、沙拉油、酥油、卵磷脂、無毒塑膠、印刷油墨、潤滑劑、蠟、液壓流體、變壓器流體、溶劑、化妝品、毛髮護理產品及生物柴油。
本發明亦包括一種DNA分子，其包含序列選自由下列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18之序列組成之群或與選自由下列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18之序列組成之群的序列互補的聚核苷酸。在另一態樣中，本發明包括一種分離DNA分子，其包含選自由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2組成之群的至少約11個至約20個連續核苷酸。
本發明亦包括一種大豆細胞之基因組，其包含序列選自由下列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18之序列組成之群的聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明包括一種檢測生物樣本中大豆品系MON87705 DNA之存在的方法，其包含：使該樣本與探針接觸，該探針與選自由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2及其互補體組成之群之序列在嚴格雜交條件下雜交，且與不包含選自由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2及其互補體組成之群之序列的大豆植物基因組DNA在嚴格雜交條件下不雜交；使該樣本及探針經歷嚴格雜交條件；及檢測該探針與該樣本之結合；其中結合可診斷該樣本中該DNA之存在。
在另一態樣中，本發明包括一種檢測生物樣本中可診斷大豆品系MON87705之存在的核苷酸序列之存在的方法，其包含檢測核苷酸序列之存在，其中該序列係選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群，其中該生物樣本係選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白及植脂奶油組成之群。
本發明亦包括一種檢測大豆樣本中大豆基因轉殖品系MON87705之存在或不存在之套組，其包含基於檢測SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18中所示之一或多種序列而設計之核苷酸組件。在另一態樣中，本發明亦包括一種組合物，其具有選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18組成之群的DNA分子，其中該組合物為選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白及植脂奶油組成之群的商品產品。
包括以下實例來證實本發明之某些較佳實施例的實例。熟習此項技術者應理解，以下實例中所揭示之技術表示發明者已發現在本發明實踐中作用良好之方法，且因此可將其視為構成用於其實踐之較佳模式的實例。然而，根據本揭示案，熟習此項技術者應瞭解可在不脫離本發明之精神及範疇的情況下，在所揭示之特定實施例中進行許多變化且仍獲得類似結果。
實例 實例1：用pMON95829使大豆A3525轉型及品系選擇
藉由使用源自pMON95829之DNA片段(圖1)進行農桿菌(Agrobacterium)介導之大豆細胞的轉型來產生基因轉殖大豆植物MON87705。二元植物轉型載體pMON95829含有兩個植物轉型T-DNA。每個T-DNA皆在T-DNA末端由右邊界(RB)序列及左邊界(LB)序列側接。MON87705之轉型後篩選鑑別產生一種兩卡匣插入物之兩個T-DNA之右邊界-右邊界共整合，其中一卡匣插入物經設計以表現賦予草甘膦耐受性之來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的aroA-CP4基因，且另一卡匣插入物經設計具有反向重複序列以觸發基於RNAi之內源性FAD2及FATB基因抑制(SEQ ID NO:7)。pMON95829中未見反向重複序列結構，而是經兩個T-DNA之RB-RB共整合形成。此整合組態獲得含有表現卡匣及抑制卡匣之單基因轉殖基因座且藉由剩餘之左邊界序列側接(圖2)。RB:RB整合位點處產生之獨特序列以SEQ ID NO:18列出。
T-DNA係如下組織：第一T-DNA以章魚鹼LB序列開始，隨後為由來自玄參嵌紋病毒(FMV)之35S強化子及來自擬南芥Tsf1基因之啟動子、內含子及前導序列構成之第一人工基因，該人工基因下游為與最佳化aroA-CP4融合之ShkG轉運肽，該轉運肽下游為來自豌豆之RbcS2(E9)基因之3' UTR，隨後為由來自β-伴大豆球蛋白基因之大豆7S α'初發次單元之啟動子及前導序列構成之第二卡匣，該第二卡匣下游為含有與大豆FAD2及FATB基因同源之序列之反向重複序列的有義部分，該有義部分下游為胭脂鹼RB序列。第二T-DNA以胭脂鹼RB序列開始，該胭脂鹼RB序列下游為含有與大豆FAD2及FATB基因同源之序列之反向重複序列的反義部分，該反義部分下游為海島棉H6基因之3' UTR，該3' UTR下游為章魚鹼LB序列。
經由根癌農桿菌介導之轉型獲得經pMON95829轉型之外植體。自經轉型之組織使植物再生。製得約955個R0轉型品系且藉由InvaderR(Third Wave Technologies,Inc.,Madison,WI)測試兩個T-DNA之存在。此外，使用經設計以鑑別RB:RB組態之PCR來選擇適當組裝之候選品系。顯示T-DNA適當共整合之R0品系經自花授粉以產生R1種子。R1種子之脂肪酸組成由FAME-GC分析測定。基於此等分析，推進48個品系至R2代。多複本品系之分離及表現型表徵使候選品系池變窄成由R3代構成之11個品系。
進行詳細南方分析，其經設計以證實複本數、卡匣完整性、基因座及不希望有之載體序列不存在。亦測定後代中田間表現特徵以及其餘品系之側接插入位點的序列。基於整體脂肪酸組成分布(表1)、農藝效能及分子特徵，選擇稱為品系MON87705之一個子代系。
實 例2：使用反向PCR分離側接序列
使用如Ochman等人，1990(PCR Protocols:A guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.)中所述之反向PCR及藉由TAIL(熱不對稱交錯)PCR測定MON87705中側接T-DNA插入物之序列。自野生型A3525及生長於溫室條件下之組織的基因轉殖系中分離植物基因組DNA。藉由研缽及研杵在液氮下研磨或機械研磨來研磨冷凍葉片組織。將22mL體積之提取緩衝液添加至約1g經研磨之葉片組織且在65℃下培育1小時。CTAB提取緩衝液由1.4M NaCl、2% CTAB、20mM EDTA及100mM Tris-HCl pH 8.0組成。在使用之前即刻將0.02% β-巰基乙醇及0.5mg核糖核酸酶A添加至提取緩衝液中。以12mL苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)溶液提取樣本，隨後在4℃下以4000xG離心10分鐘。將上清液轉移至新管中且以15ml異丙醇沈澱DNA。在4000xG下離心10分鐘之後，用5mL 70%乙醇洗滌離心塊。以4000xG最後離心5分鐘；將離心塊空氣乾燥且隨後再懸浮於300μL水中。
使DNA之等分試樣經歷TAIL PCR且分離並定序鄰近於插入位點之序列區。另外，用基於限制性分析T-DNA所選擇之限制性核酸內切酶消化DNA之等分試樣。自身連接限制片段之後，使用由T-DNA序列所設計的使遠離T-DNA之5'及3'端延伸之序列擴增的引子進行PCR。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物並使用QIAGEN凝膠純化套組(Qiagen,Valencia,CA)純化。直接使用標準定序方案使後續產物定序。
使用GenomewalkerTM套組(Clontech,Mountain View,CA)使遠離T-DNA之5'端延伸之初始側接序列延伸。使用標準方案條件且將呈現為SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20之引子連同所提供之AP1及AP2引子一起用於巢式PCR。反應進行兩次，且直接使用標準定序方案選殖且定序產物。將序列與重複運作之先前基因組序列及3'側接序列相比以根據源於PCR之誤差測定實際多形現象。顯然在產生MON87705品系後出現染色體複製。此複製區(SEQ ID NO:17)對應於SEQ ID NO:6之位置1053至3422且幾乎與SEQ ID NO:6之位置10682至13051一致。吾人已確定位於插入物之5'端之重複序列與插入物之3'端之重複序列之間存在兩個多形現象，且插入物之3'端匹配初始基因組序列。
使用此等方法，經鑑別之插入物5'側接序列呈現為SEQ ID NO:3(參見圖2)，且3'側接序列呈現為SEQ ID NO:4(參見圖2)。完全整合於A3525基因組DNA中的來自pMON95829之插入卡匣(SEQ ID NO:7)之一部分呈現為SEQ ID NO:5(參見圖2)。
將分離序列與T-DNA序列相比以鑑別側接序列及共分離T-DNA片段。藉由PCR用基於推斷之側接序列資料及已知之T-DNA序列而設計之引子證實表現卡匣存在。使用由MON87705中之側接序列設計之引子分離對應於T-DNA整合於轉型系中之相同區的A3525野生型序列。針對多種核苷酸及蛋白質資料庫分析MON87705中之側接序列及A3525野生型序列。使用此資訊檢驗轉殖基因與植物基因組之關係且考察插入位點完整性。如實例3中所述，使用側接序列及野生型序列設計用於鑑別該等品系之TaqMan終點檢定之引子且測定接合性。
實例3：品系特異性終點TaqMan及接合性檢定。
用於鑑別樣本中品系MON87705之方法為品系特異性終點TaqMan PCR檢定，其中條件實例係於表2及表3中描述。可用於終點檢定之第一組DNA引子為引子SQ20129(SEQ ID NO:8)、SQ20130(SEQ ID NO:9)及經6FAMTM標記之引子PB10043(SEQ ID NO:10)。可用於終點檢定之第二組DNA引子為引子SQ21928(SEQ ID NO:11)、SQ20901(SEQ ID NO:12)及經6FAMTM標記之引子PB10164(SEQ ID NO:13)。6FAMTM為Applied Biosystems(Foster City,CA)之連接至DNA引子的螢光染料產物。對於TaqMan MGB(小溝結合)探針，Taq DNA聚合酶之5'外切核酸酶活性自介於螢光團與淬滅劑之間之5'端切開探針。當與標靶DNA鏈雜交時，淬滅劑與螢光團之分離足以產生螢光信號。
當SQ20129(SEQ ID NO:8)及SQ20130(SEQ ID NO:9)如所述與PB10043(SEQ ID NO:10)一起使用時產生可診斷品系MON87705 DNA之DNA擴增子。當SQ21928(SEQ ID NO:11)及SQ20901(SEQ ID NO:12)如所述與PB10164(SEQ ID NO:13)一起使用時產生亦可診斷品系MON87705 DNA之DNA擴增子。用於此等分析之對照應包括來自已知含有品系MON87705 DNA的大豆之陽性對照，來自非基因轉殖大豆之陰性對照及不含模板DNA之陰性對照。可對於SEQ ID 18設計類似檢定。
此等檢定已經優化用於Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀。其他產生鑑別品系MON87705 DNA之擴增子的方法及設備可為熟習此項技術者所知。
使用以下循環參數進行Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀、Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或MJ Research DNA Engine PTC-225熱循環儀中之DNA擴增。當在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中進行PCR時，應以計算模式運行熱循環儀。當在Perkin-Elmer 9700中進行PCR時，以設定為最大值之升溫速率運行熱循環儀。
使用條件實例描述於表4及表5中之品系特異性接合性終點TaqMan PCR檢定來測定樣本中品系MON87705之接合性。接合性檢定中所用之DNA引子為引子SQ20901(SEQ ID NO:12)、SQ21928(SEQ ID NO:11)、SQ21905(SEQ ID NO:15)、經6FAMTM標記之引子PB10164(SEQ ID NO:13)及經VICTM標記之引子PB10335(SEQ ID NO:14)。6FAMTM及VICTM為Applied Biosystems(Foster City,CA)之連接至DNA引子的螢光染料產物。
當SQ20901(SEQ ID NO:12)及SQ21928(SEQ ID NO:11)與PB10164(SEQ ID NO:13)一起用於此等反應法時產生可診斷品系MON87705 DNA之DNA擴增子。用於此分析之對照應包括來自含有品系MON87705 DNA的大豆之陽性對照，來自非基因轉殖大豆之陰性對照及不含模板DNA之陰性對照。當SQ21928(SEQ ID NO:11)及SQ21905(SEQ ID NO:15)與PB10335(SEQ ID NO:14)一起用於此等反應法時產生可診斷野生型等位基因且其完整含有SEQ ID NO:16之DNA擴增子。藉由自探針PB10164與PB10335所發出之螢光信號證實兩種擴增子存在來確定異型接合性。
此等檢定已經優化用於Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀。熟習此項技術者所知的產生鑑別品系MON87705 DNA之擴增子的其他方法及設備係在此項技術內。
使用以下循環參數進行Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700、Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀、Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或MJ Research DNA Engine PTC-225熱循環儀中之DNA擴增。當在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中進行PCR時，應以計算模式運行熱循環儀。當在Perkin-Elmer 9700中進行PCR時，以設定為最大值之升溫速率運行熱循環儀。
實 例4：指定大豆樣本中品系MON87705之鑑別
以下實例描述如何鑑別指定大豆樣本中MON87705品系存在或不存在。
使用DNA品系引子對生成可診斷大豆品系MON87705之擴增子。可診斷MON87705之擴增子包含至少一種接合序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18。SEQ ID NO:1(圖2)為對應於5'側接序列(SEQ ID NO:6之位置3413至3422，參見圖2)及插入物之整合邊界(SEQ ID NO:6之位置3423至3433，參見圖2)之接合的核苷酸序列。SEQ ID NO:2(圖2)為對應於插入物之整合邊界(SEQ ID NO:6之位置10664至10673，參見圖2)及3'側接序列(SEQ ID NO:6之位置10674至10683，參見圖2)之接合的核苷酸序列。SEQ ID NO:18為對應於為得到品系MON87705而共整合兩個pMON95829 T-DNA之後產生之右邊界-右邊界接合(SEQ ID NO:6之位置9230至9335)的核苷酸序列。
可產生MON87705之診斷擴增子的品系引子對包括基於側接序列及插入卡匣之引子對。為獲得可見SEQ ID NO:1之至少11個核苷酸之診斷擴增子，可設計基於SEQ ID NO:3之鹼基1至3448的正向引子及基於插入卡匣SEQ ID NO:5之位置10至7251的反向引子。為獲得可見SEQ ID NO:2之至少11個核苷酸之診斷擴增子，可設計基於插入卡匣SEQ ID NO:5之位置1至7241的正向引子及基於3'側接序列SEQ ID NO:4之鹼基10至2515的反向引子。為實踐目的，應設計產生限制尺寸範圍(較佳介於200至1000個鹼基之間)之擴增子的引子。較小尺寸之擴增子通常較可靠地產生於PCR反應中，允許較短循環時間，易於分離，可顯現於瓊脂糖凝膠上，或適合用於終點TaqMan類似檢定。此外，使用該等引子對產生之擴增子可選殖於載體中、繁殖、分離且定序，或可直接用此項技術中已確立之方法定序。本發明之一態樣為源自SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:5之組合或SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:5之組合的任何引子對，其適用於DNA擴增法以產生可診斷MON87705或其子代之擴增子。本發明之一態樣為包含SEQ ID NO:3或其互補體之至少11個連續核苷酸的任何單一分離DNA聚核苷酸引子分子，其適用於DNA擴增法以產生可診斷MON87705或其子代之擴增子。本發明之一態樣為包含SEQ ID NO:4或其互補體之至少11個連續核苷酸的任何單一分離DNA聚核苷酸引子分子，其適用於DNA擴增法以產生可診斷MON87705或其子代之擴增子。本發明之一態樣為包含SEQ ID NO:5或其互補體之至少11個連續核苷酸的任何單一分離DNA聚核苷酸引子分子，其適用於DNA擴增法以產生可診斷MON87705或其子代之擴增子。
此分析之擴增條件之實例在表6及表7中說明。然而，此等方法之任何改進或使用與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或產生可診斷MON87705之擴增子的MON87705之轉殖基因插入物(SEQ ID NO:5)中所包含之遺傳元件的DNA序列同源或互補之DNA引子皆在該技術內。診斷擴增子包含與下列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:18中之至少一種轉殖基因/基因組接合DNA同源或互補之DNA分子，或其一實質部分。
用於品系MON87705植物組織樣本之分析應包括來自品系MON87705之陽性組織對照、來自非MON87705品系之大豆植物之陰性對照(例如但不限於A3525)及不含大豆基因組DNA之陰性對照。擴增內源性大豆DNA分子之引子對將用作DNA擴增條件之內部對照。熟習DNA擴增法之技術者可自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5選擇其他引子序列，且所選擇之藉由表6及表7中所示之方法生成擴增子之條件可能不同，但得到可診斷品系MON87705 DNA之擴增子。使用此等DNA引子序列對表6及表7之方法加以改進係在本發明之範疇內。本發明之一態樣為由至少一種源自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之DNA引子序列產生且可診斷MON87705的擴增子。
本發明之一態樣為含有至少一種源自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之DNA引子的DNA檢測套組，當該DNA引子用於DNA擴增法中時產生可診斷MON87705或其子代之擴增子。本發明之一態樣為一種大豆植物或種子，其中當在DNA擴增法中測試時，其基因組將產生可診斷MON87705之擴增子。可使用Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700、Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀或可用於產生診斷MON87705之擴增子的任何其他擴增系統來進行MON87705擴增子之檢定(如表7中所示)。
上文所揭示及申請專利範圍中所述之大豆品系MON87705之種子已在布達佩斯條約(Budapest Treaty)下存放於美國菌種保存中心(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA. 20110中。ATCC寄存編號為PTA-9241。該寄存物將在寄存中心保存達30年時期、或最後請求期之後5年、或專利有效期(其中任何較長者)，且將在該期間根據需要進行替換。
已說明且描述本發明之原理，熟習此項技術者應顯而易見可在不脫離該等原理之情況下改進本發明之配置及細節。吾人主張隨附申請專利範圍之精神及範疇內之所有改進。
圖1.用於產生大豆植物MON87705之二元轉型載體pMON95829之圖；
圖2.大豆品系MON87705之基因組中基因轉殖插入物之組織；[A]對應於SEQ ID NO:1之相對位置，其形成介於SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:5之間之接合；[B]對應於SEQ ID NO:2之相對位置，其形成介於SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:5之間之接合；[C]對應於SEQ ID NO:3之相對位置，該大豆基因組序列與整合於品系MON87705中之基因組內的表現卡匣之任意指定/選定之5'端側接；[D]對應於SEQ ID NO:4之相對位置，該大豆基因組序列與整合於品系MON87705中之基因組內的表現卡匣之任意指定/選定之3'端側接；[E]表示包含SEQ ID NO:5之各種元件，且為插入品系MON87705之基因組內之表現卡匣之序列；且[F]表示連續序列，其包含如圖中自左至右所表示之SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:4，其中如上文所闡明並有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2，因為此等序列存在於品系MON87705中之基因組中。
(無元件符號說明)

Claims (12)

  1. 一種DNA分子，其包含聚核苷酸，該聚核苷酸具有SEQ ID NO：1、2及18所列序列或具有與SEQ ID NO：1、2及18所列序列互補的序列。
  2. 一種分離之DNA分子，其包含聚核苷酸，該聚核苷酸具有SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之序列，或具有與SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2互補之序列。
  3. 一種大豆細胞之基因組，其中該基因組包含異源DNA分子，該異源DNA分子包含聚核苷酸，該聚核苷酸具有包含SEQ ID NO：1、2及18或其互補體之序列，其中該SEQ ID NO：1及2為接合序列，其係跨過該異源性DNA插入該細胞之該基因組連接之點。
  4. 一種檢測生物樣本中大豆品系MON87705 DNA之存在的方法，該大豆品系MON87705 DNA包含具有SEQ ID NO：5之核酸之多核苷酸序列，該方法包含：i.使該樣本與探針接觸，該探針與選自由SEQ ID NO：1及2及其互補體所組成之群之序列在嚴格雜交條件下雜交，且不與不包含選自由SEQ ID NO：1及2及其互補體所組成之群之序列的大豆植物基因組DNA在嚴格雜交條件下雜交；ii.使該樣本及探針經歷嚴格雜交條件；及iii.檢測該探針與該樣本之結合；其中結合可診斷該樣本中該DNA之存在。
  5. 如請求項4之方法，其中 (i)該探針進一步包含第二探針，其包含SEQ ID NO：3或其互補體之至少11個連續核苷酸；或(ii)該探針進一步包含第二探針，其包含SEQ ID NO：4或其互補體之至少11個連續核苷酸；或(iii)該探針為SEQ ID NO：5或其互補體之至少11個連續核苷酸，且係SEQ ID NO：18之5'序列或與SEQ ID NO：18之5'序列互補，且進一步包含第二探針，其係SEQ ID NO：5或其互補體之至少11個連續核苷酸，且係SEQ ID NO：18之3'序列或與SEQ ID NO：18之3'序列互補。
  6. 一種檢測生物樣本中大豆品系MON87705之存在的方法，該大豆品系MON87705包含具有SEQ ID NO：5之核酸之多核苷酸序列，該方法包含：i.使該生物樣本與探針接觸，該探針與SEQ ID NO：5之序列及其互補體在嚴格雜交條件下雜交，且不與不包含SEQ ID NO：5之序列或其互補體的大豆植物基因組DNA在嚴格雜交條件下雜交；ii.使該樣本及探針經歷嚴格雜交條件；及iii.檢測該探針與該樣本之結合；其中結合可診斷該樣本中該DNA之存在，且該生物樣本係選自由大豆粕(soybean meal)、大豆粉(soy flour)、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、及植脂奶油(whipped topping)組成之群。
  7. 一種檢測大豆樣本中大豆基因轉殖品系MON87705之存 在或不存在之套組，該該大豆品系MON87705包含具有SEQ ID NO：5之核酸之多核苷酸序列，該套組包含基於檢測SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：18所示之至少兩種序列而設計之核苷酸組件，其中該核苷酸組件包含SEQ ID NO：1、2及18或其互補體之至少11個連續核苷酸。
  8. 一種檢測大豆樣本中大豆基因轉殖品系MON87705之存在或不存在之套組，該該大豆品系MON87705包含具有SEQ ID NO：5之核酸之多核苷酸序列，該套組包含基於檢測SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：18或其互補體所示之至少兩種序列而設計之核苷酸組件，其中該套組採用包含以下之方法：i.使該樣本與DNA引子對接觸；ii.進行核酸擴增反應產生擴增子；iii.偵測該擴增，其中該擴增子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：18所列之至少兩種序列，且該DNA引子對為(a)由以下序列構成：具有SEQ ID NO：3之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸及具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸；或(b)由以下序列構成：具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸及具有SEQ ID NO：4之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核 苷酸；或(c)由具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸或與其互補之序列之聚核苷酸構成，其中一引子為SEQ ID NO：18之5'序列，或其互補物，且另一引子為SEQ ID NO：18之3'序列，或其互補物。
  9. 如請求項8之套組，其中該DNA引子對係由具有SEQ ID NO：3之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸及具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸構成。
  10. 如請求項8之套組，其中該DNA引子對係由具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸及具有SEQ ID NO：4之至少11個連續核苷酸或具有與其互補之序列之聚核苷酸構成。
  11. 如請求項8之套組，其中該DNA引子對係由具有SEQ ID NO：5之至少11個連續核苷酸序列或與其互補之聚核苷酸構成，其中一個引子係SEQ ID NO：18之5'序列之至少11個連續核苷酸或與其互補，且另一個引子係SEQ ID NO：18之3'序列之至少11個連續核苷酸或與其互補。
  12. 一種組合物，其包含一個DNA分子，其包含具有SEQ ID NO：1、2及18或具有與其互補之序列之聚核苷酸，其中該組合物為一種選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、組織化大豆蛋白濃縮物、水解大豆蛋白、及植脂奶油組成之群的商品。
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