TWI604056B - 對應於基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０１之大豆植物及種子及其檢測方法 - Google Patents

對應於基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０１之大豆植物及種子及其檢測方法 Download PDF

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Description

對應於基因轉殖品系MON87701之大豆植物及種子及其檢測方法
本發明係關於基因轉殖大豆品系MON87701及其植物部分及種子。該品系展現對來自鱗翅目(Lepidoptera)之昆蟲之昆蟲侵襲的抗性。本發明亦係關於檢測在生物樣本中該大豆品系存在之方法，且提供對該品系而言獨特之核苷酸序列。
本申請案主張2007年11月15日申請之美國臨時申請案第60/988,349號之優先權益，該臨時申請案以引用之方式全部併入本文中。
大豆為重要作物且為世界許多地區之主要食物來源。生物技術方法已應用於大豆以改良農藝學性狀及產品品質。一種此類農藝學性狀為抗昆蟲性。
能夠檢測特定植物之轉殖基因/基因組DNA之存在以確定有性雜交之後代是否含有所關注之轉殖基因/基因組DNA將為有利的。另外，當遵守要求來源於重組作物植物之食物在銷售前需經批准及標記的法規時，檢測特定植物之方法將為有益的。
表現蘇力芽孢桿菌(B.thuringiensis )δ-內毒素之基因轉殖作物使種植者能顯著降低與應用化學殺蟲劑相關之時間及成本且與在非基因轉殖商業植物種類中嚴重降低之產率相比，增加在嚴重昆蟲壓力下生長之基因轉殖植物之作物產率。雖然有此成功應用，但仍預期昆蟲可演化出對基因轉殖植物中表現之蘇力芽孢桿菌δ-內毒素之抗性。該抗性在其變得廣泛分布時，將明顯限制含有編碼一些蘇力芽孢桿菌δ-內毒素之基因之胚質的商業價值。
增加基因轉殖殺蟲劑針對標靶害蟲之有效性且同時減少抗殺蟲劑害蟲之產生的一種可能方式將為確保基因轉殖作物表現高含量之蘇力芽孢桿菌δ-內毒素(McGaughey及Whalon(1992),Science 258:1451-55；Roush Roush(1994),Biocontrol. Sci. Technol. 4:501-516)。在自蘇力芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)鑑別出之許多殺蟲蛋白質中，已測試諸如Cry1's、Cry3's、VIP3A、Cry34、Cry35及Cry2Ab之相對少量個別殺蟲蛋白質在植物中之表現。在Cry2Ab之狀況下，為達成高植物內(in planta )表現量，該殺蟲蛋白質(Cry2Ab)須經靶向葉綠體以避免不當植物毒性效應。
已知外來基因在植物中之表現受其染色體位置影響，此或許歸因於染色質結構(例如，異染色質)或接近於整合位點之轉錄調控元件(例如強化子)之接近性(Weising等人(1988),Ann. Rev. Genet 22:421-477)。因此，通常必需篩選大量品系以鑑別特徵為最佳表現所引入之所關注基因的品系。舉例而言，已在植物及其他生物體中觀察到，所引入基因之表現量在品系之間存在寬泛變化。表現之空間或時間模式亦可存在差異，例如，在各種植物組織中存在轉殖基因相對表現之差異，該等模式可不對應於由存在於所引入基因構築體中之轉錄調控元件所預期之模式。因此，通常產生數百至數千種不同品系且篩選品系以便得到具有用於商業目的之所要轉殖基因表現量及模式之單一品系。具有所要轉殖基因表現量或模式之品系適用於藉由有性異型雜交，使用習知育種方法將轉殖基因趨中雜交至其他遺傳背景中。該雜交之後代維持原始轉型體之轉殖基因表現特徵。該策略用以在許多針對特定局部生長條件經適當改適之種類中確保可靠基因表現。
藉由任何熟知核酸檢測方法，諸如聚合酶鏈反應(PCR)或使用核酸探針之DNA雜交，有可能檢測出轉殖基因之存在。該等檢測方法通常集中於頻繁使用之遺傳元件上，諸如啟動子、終止子、標記基因等。因此，該等方法可能不適用於不同品系(尤其使用相同DNA構築體產生之彼等品系)之間的區別，除非已知與所插入DNA相鄰之染色體DNA序列("側接DNA")。品系特異性PCR檢定(例如)由Taverniers等人(J. Agric. Food Chem.,53:3041-3052,2005)論述，其中例示用於基因轉殖玉米株系Bt11、Bt176及GA21及用於菜籽品系GT73之品系特異性追蹤系統。在該研究，基於各品系之基因組/轉殖基因接點之序列來設計品系特異性引子及探針。基因轉殖植物品系特異性DNA檢測方法已描述於美國專利第6,893,826號；第6,825,400號；第6,740,488號；第6,733,974號；第6,689,880號；第6,900,014號及第6,818,807號中。
本發明係關於命名為MON87701之基因轉殖大豆植物，其種子已以寄存編號PTA-8194寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。本發明之另一態樣為大豆品系MON87701之後代植物或種子，或植物及種子之部分。植物部分包括(但不限於)花粉、胚珠、花、枝、根、莖、葉、豆莢、種子及分生組織。大豆植物MON87701尤其對鱗翅目家族之昆蟲有抗性，尤其諸如藜豆毛蟲(Velvetbean caterpillar)(藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis ))、大豆尺蠖(Soybean looper)(大豆尺蠖蛾(Pseudoplusia includens ))、大豆葉腋穿孔蟲(Soybean axil borer)(夜小卷蛾(Epinotia aporema ))、黃色穿孔蛾(Yellow Bear Moth)(維吉尼亞燈蛾(Spilosoma virginica ))、玉米穗夜蛾(Corn earworm)(穀實夜蛾(Helicoverpa zea ))、秋天行軍蟲(Fall armyworm)(草地黏蟲(Spodoptera frugiperda ))及向日葵尺蠖(Sunflower looper)薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu )，其全部為農業上重要之害蟲。
本發明亦係關於大豆植物MON87701之DNA構築體及對大豆MON87701及其後代中轉殖基因/基因組插入區之檢測。
本發明之其他態樣為MON87701之基因組中所含之新穎遺傳組成，及來自MON87701之產品，諸如粕、麵粉、食物產品、蛋白質補充物，及田間剩餘之對應於MON87701之大豆植物已自其收穫之生物質。
根據本發明之一態樣，提供用於檢測來自命名為MON87701之新穎大豆植物之轉殖基因/基因組插入區的存在之組合物及方法。提供包含至少一個選自由以下序列組成之群之MON87701的接點序列之DNA序列：SEQ ID NO:1([A]對應於SEQ ID NO:6[F]之位置5748至5767，圖2)及SEQ ID NO:2([B]對應於SEQ ID NO:6[F]之位置12,174至12,193，圖2)及其互補序列。接點序列為跨越插入至基因組中之異源DNA與大豆細胞基因組DNA連接之點的核苷酸序列。在含有大豆DNA之生物樣本中檢測該序列可供診斷大豆品系MON87701 DNA在該樣本中之存在。本發明之一態樣為包含該等DNA分子之大豆品系MON87701及大豆種子。
包含來自大豆品系MON87701之新穎轉殖基因/基因組插入區SEQ ID NO:3[C]、SEQ ID NO:4[D]及SEQ ID NO:5[E]或SEQ ID NO:1[A]、SEQ ID NO:2[B]及SEQ ID NO:5[E](參見圖2)之DNA序列亦為本發明之態樣。本發明之其他態樣為包含該等分子之大豆植物及種子。
根據本發明之另一態樣，提供兩種適用於DNA檢測方法中之DNA分子。該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其互補序列之連續核苷酸，以充當可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針。舉例而言，第一DNA分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其互補序列之轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續聚核苷酸，且第二DNA分子具有相似長度之SEQ ID NO:3或其互補序列之5'側接大豆基因組DNA區的任何部分，其中該等DNA分子當一起使用時適用作產生擴增子之DNA擴增方法中的DNA引子。在DNA擴增方法中使用該等DNA引子產生之擴增子在擴增子含有SEQ ID NO:1時可供診斷大豆品系MON87701。本發明之一態樣為由與SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5之任何部分同源或互補之DNA引子產生之任何擴增子，及包含SEQ ID NO:1之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供兩種適用於DNA檢測方法之DNA分子。該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互補序列之連續核苷酸，以充當可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針。舉例而言，第一DNA分子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互補序列之DNA分子的轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續聚核苷酸，且第二DNA分子具有相似長度之SEQ ID NO:4或其互補序列之3'側接大豆基因組DNA的任何部分，其中該等DNA分子當一起使用時適用作DNA擴增方法中之DNA引子。在DNA擴增方法中使用該等DNA引子產生之擴增子在擴增子含有SEQ ID NO:2時可供診斷大豆品系MON87702。本發明之一態樣為由與SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5之任何部分同源或互補之DNA引子產生之任何擴增子，及包含SEQ ID NO:2之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供兩種適用於DNA檢測方法之DNA分子。DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO:6或其互補序列之連續核苷酸，以充當可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針。當在DNA擴增方法中一起用作DNA引子時，產生包含SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之擴增子。所產生之擴增子可供診斷大豆品系MON87701。本發明之一態樣為由與SEQ ID NO:6之任何部分同源或互補之DNA引子產生之任何擴增子，及包含SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之任何擴增子。
根據本發明之另一態樣，提供檢測生物樣本中對應於大豆品系MON87701之DNA存在之方法。該等方法包含：(a)使生物樣本與引子組接觸，該引子組在用於使用來自大豆品系MON87701之基因組DNA之核酸擴增反應中時，產生可供診斷大豆品系MON87701之擴增子；(b)執行核酸擴增反應，由此產生擴增子；及(c)檢測擴增子，其中該擴增子包含SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2，其中對該擴增子之檢測指示對應於大豆品系MON87701之DNA之存在。
根據本發明之另一態樣，提供檢測生物樣本中對應於MON87701品系之DNA存在之方法，該等方法包含：(a)使生物樣本與探針接觸，該探針在嚴格雜交條件下與來自大豆品系MON87701之基因組DNA雜交且在嚴格雜交條件下不與對照大豆植物雜交；(b)使生物樣本及探針經受嚴格雜交條件；及(c)檢測探針與大豆品系MON87701 DNA之雜交，其中對該雜交之檢測指示對應於MON87701品系之DNA之存在。較佳地，探針選自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其互補序列組成之群。
生物樣本可包含來源於大豆細胞或組織之任何有機材料，該等細胞或組織包括莖、根、葉、花或花部分、種子或種子豆莢及其類似物，該有機材料含有可檢測量之對應於該有機材料之核苷酸序列。來源於大豆品系MON87701之生物樣本包含本發明之轉殖基因/基因組插入區，且尤其包含如序列表中所述，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6及其互補序列中所示之轉殖基因/基因組插入區。
提供用於檢測大豆品系MON87701之套組，其使用自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6設計之引子。使用該套組產生之擴增子在擴增子(1)含有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述之核苷酸序列或(2)含有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2時可供診斷MON87701。套組可作為僅特異性檢測生物樣本中之當前品系MON87701 DNA之方式提供，或套組可作為檢測來自任何數量之不同生物樣本之多種不同基因轉殖品系的方式提供。在後一狀況下，亦即，在用於檢測多種不同基因轉殖品系之套組之狀況下，套組可提供呈微陣列或任何陣列類型形式之探針或引子，其對該套組之使用者提供區別基因轉殖與非基因轉殖樣本之間的差異、基因轉殖品系之接合子型式及甚至品系之存在或不存在之能力，無論是否經批准或未經批准用於商業化。使用該套組檢測或計分特定品系之存在或不存在可藉由螢光、比色、同位素或發光方式進行。
本發明之另一態樣為大豆植物或種子，或來源於MON87701之植物或種子之產品，其中當自大豆植物或種子或產品分離時，基因組DNA包含併有SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之DNA分子。較佳地，其基因組DNA包含基本上由SEQ ID NO:3自約位置1至5757之核苷酸序列、SEQ ID NO:5自約位置1至6426之核苷酸序列及SEQ ID NO:4自約位置379至2611之核苷酸序列組成之DNA分子(其重疊群呈現為SEQ ID NO:6)。
本發明之另一態樣為大豆植物或種子，或來源於MON87701之植物或種子之產品，其中基因組DNA包含基本上由SEQ ID NO:6自約位置1至14,416之核苷酸序列組成之DNA分子。
本發明之另一態樣為大豆植物或種子，或來源於MON87701之植物或種子之產品，其中當自大豆植物或種子或產品分離時，基因組DNA在DNA擴增方法中產生擴增子，其中該擴增子包含SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2。
本發明之另一態樣為產生抗昆蟲大豆植物之方法。該方法包含：(a)將MON87701之大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一個來源於(a)之雜交之後代植物；及(c)選擇包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之核苷酸序列之後代。該選擇包括使至少一個自(b)獲得之後代植物經受核酸擴增反應，其中選擇產生包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中之至少一個核苷酸序列之擴增子的後代，或使至少一個自(b)獲得之後代植物經受核酸雜交反應，其中選擇與在嚴格條件下與一或多個選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之DNA序列雜交之探針雜交的後代。如此選擇之後代為抗昆蟲大豆植物。
本發明之另一態樣為保護大豆植物免受昆蟲侵襲之方法。該方法包含在大豆之鱗翅目害蟲之餌料中提供殺蟲有效量之大豆植物MON87701之細胞或組織。鱗翅目害蟲係選自由飛蛾(Anticarsia )、尺蠖蛾(Pseudoplusia )、卷葉蛾(Epinotia )、燈蛾(Spilosoma )、鈴夜蛾(Helicoverpa )、夜蛾(Spodoptera )及灰夜蛾(Rachiplusia )組成之群。
本發明之另一態樣為來源於大豆植物或種子或MON87701之種子後代之商品。該等商品包括(但不限於)，完整或經加工大豆種子、動物蛋白質飼料、植物油、粕、粉、無毒塑膠、印刷墨水、潤滑劑、蠟、液壓液、變壓器液、溶劑、化妝品、毛髮護理產品、豆漿、大豆堅果醬、納豆、丹貝(tempeh)、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質、發泡奶油(whipped topping)、烹飪用油、色拉油、酥油、卵磷脂、可食用完整大豆(未加工、經烘烤或作為鹽水鮮豆)、豆漿、大豆優格、豆腐乳、豆腐、豆皮及生質柴油。
本發明之另一態樣為測定大豆品系MON87701之後代之接合子型式的方法。該方法包含(a)使大豆樣本與引子對SQ3443(SEQ ID NO:12)及SQ3445(SEQ ID NO:13)接觸，該引子對在用於使用來自大豆品系MON87701之基因組DNA之核酸擴增反應中時，自引子SQ3443及SQ3445之組合產生可供診斷大豆品系MON87701之擴增子；(b)執行核酸擴增反應；(c)檢測所產生之第一擴增子；(d)使相同樣本與引子對SQ3445(SEQ ID NO:13)及SQ3446(SEQ ID NO:14)接觸，該引子對在用於使用來自大豆植物之基因組DNA之核酸擴增反應中時，自引子SQ3445及SQ3446之組合產生可供診斷與鑑別為大豆品系MON87701之轉殖基因插入物之大豆基因組區同源的野生型大豆基因組DNA之擴增子；(e)執行核酸擴增反應，及(f)檢測所產生之第二擴增子；其中對兩種擴增子之檢測均指示大豆樣本對大豆品系MON87701 DNA而言為異型接合的。
本發明之另一態樣為進一步使用經螢光團標記之探針測定大豆品系MON87701之後代之接合子型式的方法。該方法包含(a)使大豆樣本與引子對SQ3443(SEQ ID NO:12)、SQ3445(SEQ ID NO:13)及探針經6FAMTM 標記之PB1111(SEQ ID NO:15)接觸，該引子對及該探針在用於使用來自大豆品系MON87701之基因組DNA之核酸擴增反應中時，自引子SQ3443及SQ3445及探針經6FAMTM 標記之PB1111之組合產生可供診斷大豆品系MON87701並釋放螢光信號之擴增子；(b)執行核酸擴增反應；(c)檢測所產生之第一擴增子；(d)使相同樣本與引子對SQ3445(SEQ ID NO:13)及SQ3446(SEQ ID NO:14)及經VICTM 標記之PB1112(SEQ ID NO:16)接觸，該引子對及該經VICTM 標記之PB1112在用於使用來自大豆植物之基因組DNA之核酸擴增反應中時，自引子SQ3445及SQ3446及探針經VICTM 標記之PB1112之組合產生可供診斷與鑑別為大豆品系MON87701之轉殖基因插入物之大豆基因組區同源的野生型大豆基因組DNA並釋放螢光信號之擴增子；(e)執行核酸擴增反應；及(f)檢測所產生之第二擴增子；其中對兩種擴增子之檢測均指示大豆樣本包含對鑑別為大豆品系MON87701之轉殖基因插入物而言為異型接合之DNA。
本發明之上述及其他態樣將自以下實施方式變得更明顯。
序列簡單描述
SEQ ID NO:1-表示大豆基因組DNA與經整合表現序列盒之間的接點(參見圖2)之20核苷酸序列。該序列對應於SEQ ID NO:6之位置5748至5767。另外，SEQ ID NO:1([A])為對應於SEQ ID NO:3([C])之位置5748至5757之核苷酸序列，及對應於SEQ ID NO:5([E])位置1至10之TIC107表現序列盒之整合右邊界。SEQ ID NO:1亦對應於5'側接序列SEQ ID NO:3([C])之位置5748至5767。
SEQ ID NO:2-表示經整合表現序列盒與大豆基因組DNA之間的接點(參見圖2)之20核苷酸序列。該序列對應於SEQ ID NO:6([F])之位置12174至12193。另外，SEQ ID NO:2([B])為對應於SEQ ID NO:5([E])之位置6417至6426之核苷酸序列，及對應於SEQ ID NO:4([D])之位置379至388之3'側接序列。SEQ ID NO:2([B])亦對應於3'側接序列SEQ ID NO:4([D])之位置369至388。
SEQ ID NO:3(圖2之[C])-側接至多且包括轉型DNA(T-DNA)插入物之區域之所插入MON87701 DNA之5'序列。
SEQ ID NO:4(圖2之[D])-側接至多且包括T-DNA插入物之區域之所插入MON87701 DNA之3'序列。
SEQ ID NO:5(圖2之[E])-經整合TIC107表現序列盒之序列，其包括整合後之右邊界及左邊界序列。
SEQ ID NO:6(圖2之[F])-表示側接所插入MON87701 DNA之5'序列(SEQ ID NO:3)、經整合表現序列盒之序列(SEQ ID NO:5)及側接所插入MON87701 DNA之3'序列(SEQ ID NO:4)的重疊群之14,416bp核苷酸序列。
SEQ ID NO:7-pMON53570之TIC107表現序列盒。
SEQ ID NO:8-編碼TIC107之DNA之序列，其包括編碼葉綠體轉運肽之核苷酸。
SEQ ID NO:9-用以鑑別MON87701品系之引子SQ1135。引子SQ1135與接近對應於SEQ ID NO:6之位置5790至5766及SEQ ID NO:5之位置33至9之右T-DNA插入物邊界的所插入表現序列盒之5'區互補。
SEQ ID NO:10-用以鑑別MON87701品系之引子SQ1136。引子SQ1136對應於接近對應於SEQ ID NO:6之位置5705至5732及SEQ ID NO:3之位置5705至5732之右T-DNA插入物邊界的側接所插入表現序列盒之5'區。使用引子SQ1135與SQ1136之組合產生之約86bp的PCR擴增子關於品系MON87701之存在為陽性的。
SEQ ID NO:11-用以鑑別MON87701品系之探針PB63。該探針為經6FAMTM 標記之合成寡核苷酸，其序列與SEQ ID NO:6之位置5763至5748互補。在使用引子SQ1135及SQ1136與經6FAMTM 標記之探針PB63組合之擴增反應中，螢光信號之釋放可供診斷品系MON87701。
SEQ ID NO:12-用以測定MON87701品系之接合子型式之引子SQ3443。引子SQ3443對應於接近對應於SEQ ID NO:6之位置12145至12168及SEQ ID NO:5之位置6388至6411之左T-DNA邊界的所插入表現序列盒之區域。
SEQ ID NO:13-用以測定MON87701品系之接合子型式之引子SQ3445。引子SQ3445與接近對應於SEQ ID NO:6之位置12215至12188及SEQ ID NO:4之位置410至383之左T-DNA的側接所插入表現序列盒之3'區互補。在接合子型式檢定中使用引子SQ3443及SQ3445，在有或無經6FAMTM 標記之探針PB1111情況下，檢測PCR擴增子關於品系MON87701之存在為陽性的。
SEQ ID NO:14-用以測定MON87701品系之接合子型式之引子SQ3446。引子SQ3446對應於發生MON87701之表現序列盒插入的野生型基因組DNA之區域。使用引子SQ3445及SQ3446，在有或無經VICTM 標記之探針PB1112情況下，檢測PCR擴增子關於野生型等位基因之存在為陽性的。
SEQ ID NO:15-用以測定MON87701品系之接合子型式之探針PB1111。該探針為經6FAMTM 標記之合成寡核苷酸，其序列對應於SEQ ID NO:6之位置12172至12187。使用引子SQ3443及SQ3445產生之PCR擴增子在使用探針PB1111時引起螢光信號之釋放，其在MPN87701品系之接合子型式檢定中關於品系MPN87701之存在為陽性的。
SEQ ID NO:16-用以測定MON87701品系之接合子型式之探針PB1112。該探針為經VICTM 標記之合成寡核苷酸，其序列對應於緊接於品系MON87701之表現序列盒之插入點處與引子SQ3446同源之區域後的野生型基因組DNA之區域。使用引子SQ3445及SQ3446產生之PCR擴增子在使用探針PB1112時引起螢光信號之釋放，其在MON87701品系之接合子型式檢定中關於野生型等位基因之存在為陽性的。MON87701品系之異型接合性藉由在使用引子SQ3443、SQ3445及SQ3446之擴增反應中使用探針PB1111及PB1112螢光檢測兩種不同擴增子來證明。
提供以下定義及方法以更好地界定本發明且指導一般技術者實施本發明。除非另作說明，否則應根據一般技術者之習知用法理解該等術語。分子生物學中常用術語之定義亦可見於Rieger等人，Glossary of Genetics:Classical and Molecular ，第5版，Springer-Verlag:New York,1991；及Lewin,Genes V, Oxford University Press:New York,1994中。
如本文中所用，術語"大豆(soybean)"意謂大豆(Glycine max )且包括可用大豆繁殖之所有植物品種，包括野生大豆(wild soybean)種，以及屬於野生大豆(Glycine soja )可在種間繁殖的植物。
如本文中所用，術語"包含"意謂"包括，但不限於"。
術語"草甘膦(glyphosate)"係指N-膦酸基甲基甘胺酸及其鹽。N-膦酸基甲基甘胺酸為對廣泛範圍之植物種類具有活性之熟知除草劑。
"商品"係指任何包含來源於大豆或大豆油之材料且出售給消費者之產品。經加工之大豆為世界上蛋白質飼料及植物油之最大來源。大豆植物MON87701可用於製造通常自大豆獲得之商品。MON87701之大豆可加工成粕、粉，以及用作陸地動物及水產動物之動物飼料之蛋白質來源。來自MON87701之大豆及大豆油可用於製造許多不同產品，不限於無毒塑膠、印刷墨水、潤滑劑、蠟、液壓液、變壓器液、溶劑、化妝品及毛髮護理產品。MON87701之大豆及大豆油適用於多種自完整大豆製得之豆類食品，諸如豆漿、大豆堅果醬、納豆(natto)及丹貝(tempeh)；及自加工大豆及大豆油製得之豆類食品，包括大豆粕、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質、發泡奶油、烹飪用油、沙拉油、酥油(shortening)及卵磷脂。完整大豆亦可食用，且通常以原料、烘烤或毛豆(edamam)形式售給消費者。通常由浸泡及研磨完整大豆所產生之豆漿可無需其他加工而消費，經噴霧乾燥，或經加工形成大豆優格、豆腐乳、豆腐或豆皮(yuba)。
MON87701之大豆油可用於製造生質柴油。生質柴油在習知柴油引擎中之使用與石油柴油燃料相比使得諸如硫酸鹽、一氧化碳及顆粒之污染物實質減少，且在校車中之使用可大大降低對毒性柴油機廢氣之暴露。生質柴油通常藉由萃取、過濾及精加工大豆油以移除游離脂肪及磷脂，且隨後用甲醇對油進行酯交換以形成脂肪酸之甲酯來獲得(參見(例如)美國專利第5,891,203號)。所得大豆甲酯通常稱為"生質柴油"。來源於MON87701之油亦可用作柴油燃料而無需諸如藉由將縮醛與油混合形成甲酯(參見(例如)美國專利第6,013,114號)。用以製造該等油之MON87701之種子可藉由本發明之方法鑑別。預期來自MON87701品系種子或種子混合物(其中一些或全部均為MON87701)之經純化油將相對不具有可用於測試之DNA。然而，油自其萃取之種子可用本發明之方法表徵以鑑別用以製造該等油之種子群體內MON87701品系之存在。同樣，來自用以製造該等油之方法之工廠廢水可用於本發明之方法中以鑑別在經加工以製造該等油之種子混合物內MON87701品系的存在。同樣地，製造商品後留下或在收穫大豆種子後留下之植物碎片可藉由本發明之方法表徵以鑑別用以製造該等商品之原材料內之MON87701品系。
基因轉殖"品系"係藉由如下過程產生：用異源DNA(亦即，包括所關注轉殖基因之核酸構築體)轉型植物細胞，再生藉由將轉殖基因插入植物之基因組中所產生之植物群體，且選擇特徵為插入特定基因組位置中之特定植物。術語"品系"係指原始轉型體及包括異源DNA之轉型體之後代。術語"品系"亦指藉由轉型體與包括異源DNA之另一種類之間的有性異型雜交所產生之後代。甚至在與輪迴親本反覆回交後，來自經轉型親本之所插入DNA及側接DNA仍存在於雜交後代之相同染色體位置處。術語"品系"亦指來自包含所插入DNA及緊鄰於所插入DNA之側接基因組序列之原始轉型體的DNA，其預期由於一種包括所插入DNA之親本系(例如，原始轉型體及由自花授粉產生之後代)及一種不含所插入DNA之親本系的有性雜交而轉移至接受包括所關注轉殖基因之所插入DNA之後代中。本發明係關於品系MON87701 DNA、植物細胞、組織、種子及來源於MON87701之經加工產品。
亦應瞭解，兩種不同基因轉殖植物亦可交配以產生含有兩種獨立分離添加之外源基因的子代。適當後代之自花授粉可產生對兩種所添加之外源基因而言為同型接合之植物。亦涵蓋與親本植物之回交及與非基因轉殖植物之異型雜交，同樣涵蓋無性繁殖。通常用於不同性狀及作物之其他育種方法之描述可見於若干參考文獻之一中，例如，Fehr,inBreeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J.編，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。
如本文中所使用，當提及"經分離DNA分子"時，希望DNA分子為單獨存在或與其他組合物組合存在，但不在其天然環境內之DNA分子。舉例而言，天然存在於大豆基因組之DNA中之編碼序列、內含子序列、非轉譯前導序列、啟動子序列、轉錄終止序列及其類似物不視為與大豆基因組分離，只要其在大豆基因組中。然而，該等組分中之每一者及該等組分之子部分將在本揭示案之範疇內為"經分離的"，只要該等結構及組分不在大豆基因組中。相似地，編碼蘇力芽孢桿菌殺蟲蛋白質或彼蛋白質之任何殺蟲變異體之核苷酸序列將為經分離核苷酸序列，只要該核苷酸序列不在首先觀察到該結構之蘇力芽孢桿菌細菌之DNA中。出於本揭示案之目的，編碼與天然蘇力芽孢桿菌核苷酸序列相同之胺基酸序列或大體上相同之胺基酸序列的人工核苷酸序列將視為經分離的。出於本揭示案之目的，任何基因轉殖核苷酸序列，亦即，插入大豆植物品系MON87701之細胞之基因組中的DNA之核苷酸序列將視為經分離核苷酸序列，無論其是否存在於用以轉型產生MON87701品系之大豆細胞之質體中、品系MON87701之基因組中，以可檢測量存在於來源於品系MON87701之組織、後代、生物樣本或商品中。若DNA分子可自來自植物或種子或植物器官之細胞或組織或勻漿萃取，則核苷酸序列或自其來源之任何片段將因此視為經分離或可分離的；或可作為擴增子，自來自植物或種子或植物器官之細胞或組織或勻漿之經萃取DNA或RNA產生，該植物或種子或植物器官中之任一者係係來源於自品系MON87701得到之此類材料。因此，如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所陳述之接點序列及來源於亦含有該等接點序列之品系MON87701之核苷酸序列視為經分離或可分離的，無論該等序列是否存在於品系MON87701之細胞之基因組中或以可檢測量存在於來源於品系MON87701之組織、後代、生物樣本或商品中。
"探針"為連接有習知可檢測標記或報導體分子(例如，放射性同位素、配位基、化學發光劑或酶)之經分離核酸。該探針與標靶核酸鏈互補，在本發明狀況下，與來自大豆品系MON87701之基因組DNA鏈互補，無論來自大豆植物還是來自包括來自該品系之DNA之樣本。根據本發明之探針不僅包括去氧核酸或核糖核酸而且亦包括與標靶DNA序列特異性結合之聚醯胺及其他探針材料，且該結合可用於檢測彼標靶DNA序列之存在。
"引子"為藉由核酸雜交與互補標靶DNA鏈黏接形成引子與標靶DNA鏈之間的雜交物，且隨後藉由例如DNA聚合酶之聚合酶沿標靶DNA鏈延伸之經分離核酸。本發明之引子對涉及其(例如)藉由聚合酶鏈反應(PCR)或其他習知核酸擴增方法用於擴增標靶核酸序列之用途。
探針及引子長度通常為11個核苷酸或11個核苷酸以上，較佳18個核苷酸或18個核苷酸以上，更佳24個核苷酸或24個核苷酸以上且最佳30個核苷酸或30個核苷酸以上。該等探針及引子在高嚴格度雜交條件下與標靶序列特異性雜交。較佳地，根據本發明之探針及引子具有與標靶序列完全的序列相似性，儘管可藉由習知方法設計不同於標靶序列且保留與標靶序列雜交之能力的探針。
製備及使用探針及引子之方法描述於(例如)Molecular Cloning:A Laboratory Manual， 第2版，第1-3卷，Sambrook等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989(在下文為"Sambrook等人，1989")；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人編，Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)(在下文為"Ausubel等人，1992")；及Innis等人，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Academic Press:San Diego,1990中。PCR引子對可(例如)藉由使用欲用於彼目的之諸如Primer(Version 0.5,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)之電腦程式自已知序列獲得。
基於本文中揭示之側接DNA及插入序列之引子及探針可用於藉由例如藉由將該等序列再選殖及定序之習知方法來確認(且必要時校正)所揭示序列。
本發明之核酸探針及引子在嚴格條件下與標靶DNA序列雜交。任何習知核酸雜交或擴增方法均可用於鑑別樣本中之來自基因轉殖品系之DNA的存在。核酸分子或其片段能夠在某些情況下與其他核酸分子特異性雜交。如本文中所使用，若兩個分子能夠形成反平行、雙鏈核酸結構，則稱該兩個核酸分子能夠與彼此特異性雜交。若核酸分子展現完全互補性，則稱該等核酸分子為另一核酸分子之"互補序列"。如本文中所使用，當分子中之一者之每一核苷酸與另一者之核苷酸互補時，則稱該等分子展現"完全互補性"。若兩個分子可以在至少習知"低嚴格度"條件下允許其保留與彼此黏接之足夠穩定性彼此雜交，則稱該兩個分子"最小互補"。相似地，若分子可以在習知"高嚴格度"條件下允許其保留與彼此黏接之足夠穩定性彼此雜交，則稱該等分子"互補"。習知嚴格度條件由Sambrook等人，1989及Haymes等人，In:Nuc1eic Acid Hybridization,A Practica1 Approach, IRL Press,Washington,DC(1985)描述。因此可允許自完全互補性之偏離，只要該等偏離不完全排除分子形成雙鏈結構之能力即可。為使核酸分子用作引子或探針，僅需要在序列中充分互補以能夠在所使用之特定溶劑及鹽濃度下形成穩定雙鏈結構。
如本文中所使用，"大體上同源序列"為將在高嚴格度條件下與所比較之核酸序列之互補序列特異性雜交之核酸序列。熟習此項技術者已知促進DNA雜交之適當嚴格度條件，例如，在約45℃下6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50℃下2.0×SSC洗滌，或適當嚴格度條件可見於Current Protocols in Mo1ecu1ar Biology, John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。舉例而言，在洗滌步驟中之鹽濃度可選自在50℃下約2.0×SSC之低嚴格度至在50℃下約0.2×SSC之高嚴格度。另外，洗滌步驟中之溫度可自在室溫下(約22℃)之低嚴格度條件增加至約65℃下之高嚴格度條件。溫度及鹽均可變化，或溫度或鹽濃度中之任一者可保持恆定而改變另一變數。在一較佳實施例中，本發明之核酸將在適度嚴格度條件下，例如在約2.0×SSC及約65℃下，與SEQ ID NO:1及2中所述之核酸分子或其互補序列或任一者之片段中之一或多者特異性雜交。在一尤其較佳實施例中，本發明之核酸將在高嚴格度條件下，與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所述之核酸分子或互補序列或任一者之片段中之一或多者特異性雜交。在本發明之一態樣中，本發明之一較佳標記核酸分子具有SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所述之核酸序列或其互補序列或任一者之片段。在本發明之另一態樣中，本發明之一較佳標記核酸分子與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所述之核酸序列或其互補序列或任一者之片段共有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及100%序列一致性。在本發明之另一態樣中，本發明之一較佳標記核酸分子與SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2中所述之序列或其互補序列或任一者之片段共有95%、96%、97%、98%、99%及100%序列一致性。SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2可用作植物育種方法中之標記以鑑別遺傳雜交之後代，其與"DNA markers:Protocols,applications,and overviews:(1997)173-185,Cregan，等人，編，Wiley-Liss NY"中關於簡單序列重複DNA標記分析所述之方法相似；該等文獻全部均以引用之方式併入本文中。探針與標靶DNA分子之雜交可藉由任何數量之熟習此項技術者已知之方法來檢測，該等方法可包括(但不限於)螢光標籤、放射性標籤、基於抗體之標籤及化學發光標籤。
關於使用特定擴增引子對來擴增標靶核酸序列(例如藉由PCR)，"嚴格條件"為僅允許引子對與具有相應野生型序列(或其互補序列)之引子將結合之標靶核酸序列雜交且較佳在DNA熱擴增反應中產生獨特擴增產物(亦即擴增子)之條件。
術語"對(標靶序列)具特異性"指示探針或引子在嚴格雜交條件下僅與包含標靶序列之樣本中之標靶序列雜交。
如本文中所使用，"經擴增DNA"或"擴增子"係指為核酸模板之部分之標靶核酸序列的核酸擴增產物。舉例而言，為確定自有性雜交產生之大豆植物是否含有來自本發明之大豆植物之基因轉殖品系基因組DNA，可使自大豆植物組織樣本萃取之DNA經受使用包括來源於植物基因組中與所插入異源DNA之插入位點相鄰的側接序列之引子及來源於所插入異源DNA的第二引子之引子對的核酸擴增方法以產生可供診斷品系DNA之存在之擴增子。該擴增子具有一定長度且具有亦可供診斷品系之序列。擴增子之長度可在引子對加一個核苷酸鹼基對、較佳加約50個核苷酸鹼基對、更佳加約250個核苷酸鹼基對且甚至更佳加約450個核苷酸鹼基對之組合長度範圍內。或者，引子對可來源於所插入DNA之兩側上之側接序列以便產生包括整個插入核苷酸序列之擴增子。來源於植物基因組序列之引子對之成員可離所插入DNA分子一定距離定位，該距離可在1個核苷酸鹼基對至約2萬個核苷酸鹼基對之範圍內。術語"擴增子"之使用特別排除可在DNA熱擴增反應中形成之引子二聚體。
核酸擴增可藉由此項技術中已知之各種核酸擴增方法中之任一者(包括聚合酶鏈反應(PCR))來完成。此項技術中已知多種擴增方法且其尤其描述於美國專利第4,683,195號及第4,683,202號及PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis等人編，Academic Press,San Diego,1990中。已開發出擴增至多22kb之基因組DNA及至多42kb之噬菌體DNA之PCR擴增方法(Cheng等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699,1994)。該等方法以及DNA擴增技術中已知之其他方法可用於實施本發明。來自種子樣本已以ATCC PTA-8194寄存之大豆品系MON87701的異源DNA插入或側接序列之序列可藉由使用來源於本文中提供之序列之引子來擴增來自該品系之該等序列，接著對PCR擴增子或所選殖DNA進行標準DNA定序來驗證(及必要時校正)。
藉由該等方法產生之擴增子可藉由複數種技術檢測。一種此類方法為遺傳位元分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov等人Nucleic Acid Res. 22:4167-4175,1994)，其中設計重疊相鄰側接基因組DNA序列及所插入DNA序列兩者之DNA寡核苷酸。將寡核苷酸固定於微孔板之孔中。在對所關注區域進行PCR後(使用一個所插入序列中之引子及一個相鄰側接基因組序列中之引子)，可使單鏈PCR產物與經固定寡核苷酸雜交且用作單一鹼基延伸反應之模板，該單一鹼基延伸反應使用DNA聚合酶及對預期之下一鹼基具特異性的經標記ddNTP。讀數可基於螢光或ELISA。信號由於成功擴增、雜交及單一鹼基延伸而指示插入/側接序列之存在。
另一方法為如由Winge(Innov. Pharma. Tech. 00:18-24,2000)所述之焦磷酸定序技術(Pyrosequencing technique)。在該方法中，設計重疊相鄰基因組DNA及插入DNA接點序列之寡核苷酸。使該寡核苷酸與來自所關注區域之單鏈PCR產物雜交(一引子在所插入序列中且一引子在側接基因組序列中)且在DNA聚合酶、ATP、硫醯基酶(sulfurylase)、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5'磷醯硫酸(adenosine 5'phosphosulfate)及螢光素存在下培養。個別地添加dNTP且併入產生光信號，量測該光信號。光信號由於成功擴增、雜交及單一或多鹼基延伸而指示轉殖基因插入/側接序列之存在。
如藉由Chen等人(Genome Res. 9:492-498,1999)描述之螢光偏振為可用於檢測本發明之擴增子之方法。使用該方法，設計重疊基因組側接序列及所插入DNA接點序列之寡核苷酸。使寡核苷酸與來自所關注區域之單鏈PCR產物雜交(一引子在所插入DNA中且一引子在側接基因組DNA序列中)且在DNA聚合酶及經螢光標記之ddNTP存在下培養。單一鹼基延伸產生ddNTP之併入。併入可使用螢光計量測為偏振之改變。偏振改變由於成功擴增、雜交及單一或多鹼基延伸而指示轉殖基因插入/側接序列之存在。
TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)經描述為檢測及定量DNA序列之存在之方法且在由製造商提供之說明書中完全理解。簡言之，設計重疊基因組側接序列及插入DNA接點序列之FRET寡核苷酸探針。在熱穩定聚合酶及dNTP存在下使FRET探針及PCR引子(一引子在所插入DNA序列中且一引子在側接基因組序列中)循環。FRET探針之雜交使得螢光部分裂解且釋放離開FRET探針上之淬滅部分。螢光信號由於成功擴增及雜交而指示側接/轉殖基因插入序列之存在。
已描述適用於序列檢測之分子信標，如Tyangi，等人(Nature Biotech. 14:303-308,1996)中所述。簡言之，設計重疊側接基因組及插入DNA接點序列之FRET寡核苷酸探針。該FRET探針之獨特結構使其含有保持螢光及淬滅部分呈緊密接近之二級結構。在熱穩定聚合酶及dNTP存在下使FRET探針及PCR引子(一引子在所插入DNA序列中且一引子在側接基因組序列中)循環。成功PCR擴增後，FRET探針與標靶序列之雜交使得探針二級結構移除且螢光及淬滅部分在空間上分離，此又造成螢光信號之產生。螢光信號由於成功擴增及雜交而指示側接/轉殖基因插入序列之存在。
諸如微流體(美國專利公開案2006068398、美國專利第6,544,734號)之其他已描述方法提供分離及擴增DNA樣本之方法及裝置。使用光學染料來檢測及定量特定DNA分子(WO/05017181)。奈米管裝置(WO/06024023)包含用於檢測結合特定DNA分子且可隨後加以檢測之DNA分子或奈米珠粒之電子感應器。
可開發出使用本文中揭示之組合物及DNA檢測技術中熟知之方法的DNA檢測套組。該等套組適用於鑑別樣本中之大豆品系MON87701 DNA，且可應用於育種包含適當品系DNA之大豆植物之方法。該等套組可包含與SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6同源或互補之DNA引子或探針，或與轉殖基因插入物中所含之遺傳元件之DNA序列同源或補充的DNA引子或探針。該等DNA序列可用作DNA擴增反應中之引子或用作DNA雜交方法中之探針。如圖2中所說明含於MON87701大豆基因組中之基因組DNA及轉殖基因遺傳元件之序列由以下各元件組成：來自根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )之右邊界區(RB)之部分；來源於芥菜屬(Arabidopsis)核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小子單元基因之啟動子序列(本文中稱為位於SEQ ID NO:5上之位置155至1850之P-RbcS4)，其可與來源於芥菜屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小子單元基因之非轉譯前導序列(本文中稱為位於SEQ ID NO:5上之位置1851至1877之L-RbcS4)可操作性連接，該非轉譯前導序列可與昆蟲毒素編碼序列TIC107可操作性連接，該TIC107包含來源於芥菜屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小子單元基因之轉運肽序列之葉綠體轉運肽及來源於Cry1Ac之昆蟲毒素(本文中稱為位於轉運肽之位置1889至2141及毒素編碼序列之位置2142至5678之TIC107，該等位置分別在SEQ ID NO:5上)，且其與來源於大豆7Sα'β伴大豆球蛋白組儲存蛋白基因(conglycinin storage protein gene)之3'終止區(本文中稱為位於SEQ ID NO:5上之位置5688至6126之T-Sphas)可操作性連接；及來自根癌農桿菌之左邊界(LB)區之部分。適用作DNA擴增方法中之引子之DNA分子可來源於MON87701品系中所含之轉殖基因插入物之遺傳元件的序列。該等引子分子可用作引子組之部分，該引子組亦包括來源於側接如以SEQ ID NO:3鹼基1至5747及SEQ ID NO:4鹼基389至2611呈示之品系MON87701的轉殖基因插入物之基因組的DNA引子分子。
大豆植物MON87701係藉由使用質體構築體pMON53570(如圖1中所示)對近親配種大豆系進行土壤桿菌介導轉型方法產生。所用轉型方法類似於美國專利5,914,451中所述之彼方法。質體構築體pMON53570包含具有TIC107蛋白在大豆植物細胞中表現所必需之調控遺傳元件之經連接植物表現序列盒。使大豆細胞再生為完整大豆植物且個別植物係選自展示植物表現序列盒之完整性及對鱗翅目昆蟲幼蟲進食損傷之抗性且損失未經連接之草甘膦抗性選擇序列盒的植物群體。在基因組中含有pMON53570之經連接植物表現序列盒之大豆植物為本發明之一態樣。
插入大豆植物MON87701之基因組中之質體DNA藉由詳細分子分析來表徵。該等分析包括：插入數量(大豆基因組內整合位點之數量)、複本數(一個基因座內T-DNA之複本數)及所插入基因序列盒之完整性。使用包括完整TIC107編碼區及其各別調控元件、啟動子、內含子及植物表現序列盒之聚腺苷酸化序列以及質體pMON53570主鏈DNA區之DNA分子探針。資料展示，MON87701含有具有一個TIC107表現序列盒複本之單一T-DNA插入。未在MON87701之基因組中檢測到連接或未連接於完整基因序列盒之來自轉型載體pMON53570的額外元件。最終，執行反向PCR及DNA序列分析以確定插入物至植物基因組接點序列之5'及3'，確認插入物(圖2)中元件之構成，且確定大豆植物MON87701中插入物之完整DNA序列(SEQ ID NO:5)。
本發明係針對包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其互補序列之核苷酸序列之DNA分子。DNA分子較佳包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或其互補序列之核苷酸序列。較佳地，DNA分子基本上由SEQ ID NO:3位置1至5757之核苷酸序列、SEQ ID NO:5位置1至6426之核苷酸序列及SEQ ID NO:4位置379至2611之核苷酸序列或其互補序列組成，或基本上由SEQ ID NO:6或其互補序列之核苷酸序列組成。
本發明亦針對包含該DNA分子之大豆植物或其部分或種子。
本發明亦提供包含該DNA分子之組合物，諸如選自大豆粕、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質、大豆油及發泡奶油之商品。
本發明另外針對產生抗昆蟲大豆植物之方法。該方法包含：(a)使MON87701之大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一個來源於(a)之雜交之後代植物；及(c)選擇包含SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之核苷酸序列之後代。該選擇包括使自(b)獲得之至少一個後代植物經受核酸擴增反應，其中選擇產生包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中之至少一種核苷酸序列之擴增子的後代，或使自(b)獲得之至少一個後代植物經受核酸雜交反應，其中選擇與在嚴格條件下與選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2之一或多個DNA序列雜交的探針雜交之後代。如此選擇之後代為抗昆蟲大豆植物。
本發明另外針對保護大豆植物免受昆蟲侵襲之方法。該方法包含在大豆之鱗翅目害蟲之餌料中提供殺蟲有效量的大豆植物MON87701之細胞或組織。鱗翅目害蟲係選自由飛蛾、尺蠖蛾、卷葉蛾、燈蛾、鈴夜蛾、夜蛾及灰夜蛾組成之群。
本發明中另外提供包含第一DNA分子及第二DNA分子之DNA分子對，其中該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其互補序列；或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互補序列；或SEQ ID NO:6或其互補序列之連續核苷酸；以充當可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針。
舉例而言，該對之第一DNA分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其互補序列之轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續聚核苷酸，且該對之第二DNA分子包含相似長度之SEQ ID NO:3或其互補序列之5'側接大豆基因組DNA區。一特定實例為第一DNA分子包含SEQ ID NO:9且第二DNA分子包含SEQ ID NO:10。
另一實例為，該對之第一DNA分子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或其互補序列之轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續聚核苷酸，且該對之第二DNA分子包含相似長度之SEQ ID NO:4或其互補序列之3'側接大豆基因組DNA區。一特定實例為第一DNA分子包含SEQ ID NO:12且第二DNA分子包含SEQ ID NO:13。
本發明另外針對檢測生物樣本中選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之DNA分子存在之方法。該方法包含：(a)使生物樣本與DNA引子對接觸，該DNA引子對包含具有足夠長度之SEQ ID NO:3或其互補序列、SEQ ID NO:4或其互補序列、SEQ ID NO:5或其互補序列，或SEQ ID NO:6或其互補序列之連續核苷酸以充當可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針的DNA引子分子；(b)提供核酸擴增反應條件；(c)執行核酸擴增反應，由此產生DNA擴增子分子；及(d)檢測如此產生之DNA擴增子分子。檢測包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及其互補序列中之至少一者之擴增子指示生物樣本中存在該DNA分子。
生物樣本可包含來源於大豆細胞或組織之任何有機物質，包括莖、根、葉、花或花部分、種子或種子莢及其類似物，其含有可檢測量之對應於該有機物質之核苷酸序列。來源於大豆品系MON87701之生物樣本包含本發明之轉殖基因/基因組插入區，尤其如序列表中所述，如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6及其互補序列中所示者。舉例而言，適於本發明之生物樣本可為大豆粕、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質及發泡奶油。所測試之樣本可為自大豆植物萃取之DNA樣本。
本發明另外關於一種檢測生物樣本中一個選自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6組成之群之DNA分子存在之方法。該方法包含：(a)使生物樣本與DNA探針接觸，該探針在嚴格條件下與該DNA分子雜交且在嚴格雜交條件下不與不含該DNA分子之生物樣本雜交；(b)使生物樣本及DNA探針經嚴格雜交條件；及(c)檢測DNA探針與生物樣本之雜交。雜交之檢測指示生物樣本中該DNA分子之存在。舉例而言，所測試之生物樣本可為自大豆植物萃取之DNA樣本。
上述檢測方法中所用之探針可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列，或包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15。該探針之特定實例包括SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15。該探針可另外用至少一種螢光團標記。
本發明另外關於一種DNA檢測套組，其包含：至少一種DNA分子具有足夠長度之與SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6同源或互補之連續核苷酸以用作對大豆品系MON87701及/或後代具特異性之DNA引子或探針。至少一種DNA分子可包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其互補序列。該DNA分子之一個特定實例為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其互補序列。
本發明另外針對測定大豆樣本中包含大豆品系MON87701之大豆植物基因組之DNA的接合子型式之方法。該方法包含：(a)使樣本與SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13之第一引子對接觸，該第一引子對當與大豆品系MON87701 DNA一起用於核酸擴增反應中時，產生可供診斷大豆品系MON87701之擴增子；(b)執行核酸擴增反應；(c)檢測如此產生之第一擴增子；(d)使樣本與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14之第二引子對接觸，該第二引子對當與不同於大豆品系MON87701 DNA之大豆基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時，產生可供診斷不同於大豆品系MON87701 DNA之大豆基因組DNA之擴增子；(e)執行核酸擴增反應；及(f)檢測如此產生之第二擴增子。對可供診斷大豆品系MON87701之擴增子及可供診斷不同於大豆品系MON87701 DNA之大豆基因組DNA之擴增子的檢測指示樣本對大豆品系MON87701 DNA而言為異型接合的。較佳地，第一引子對另外與具有SEQ ID NO:15之探針一起使用，及/或第二引子對另外與具有SEQ ID NO:16之探針一起使用。
包括下列實例以例示本發明之某些較佳實施例之實例。熟習此項技術者應瞭解，下文實例中揭示之技術代表本發明者所發現在本發明之實施中良好起作用之方法，且因此可視為其較佳實施模式之構成實例。然而，熟習此項技術者將根據本揭示案瞭解，許多改變可在所揭示之特定實施例中進行且仍獲得相同或相似之結果而不悖離本發明之精神及範疇。
實例 實例1：用pMON53570轉型大豆A5547及品系選擇
基因轉殖大豆植物MON87701係藉由使用來源於pMON53570(圖1)之DNA片段對大豆細胞進行土壤桿菌介導轉型來產生。二元植物轉型載體pMON53570含有兩個植物轉型序列盒或T-DNA。各序列盒分別在轉型序列盒之5'及3'末端處側接有右邊界及左邊界序列。如SEQ ID NO:7所呈示之表現序列盒係用於表現昆蟲毒素。表現序列盒包含來源於芥菜屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小子單元基因之啟動子及前導序列(P-RbcS4，Krebbers等人，(1988)PlantMol. Biol. 11:745-759)，其直接選殖於昆蟲毒素編碼序列TIC107之上游，該昆蟲毒素編碼序列又直接選殖於來源於大豆7S a'β伴大豆球蛋白組儲存蛋白基因之終止子序列上游(T-Sphas,see for example,Schuler等人，(1982)NucleicAcids Res. 10:8225-8244)。昆蟲毒素編碼序列TIC107如SEQ ID NO:8所呈示。如SEQ ID NO:8所述之核酸序列為編碼來源於Cry1Ac(美國專利5,880,275)之殺蟲毒素之合成或人工序列，其中來源於芥菜屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小子單元基因之葉綠體轉運肽編碼序列係直接選殖於該昆蟲毒素編碼序列之上游。
藉由電穿孔使植物轉型載體pMON53570移動至卸甲(disarmed)根癌農桿菌菌株ABI中且以觀黴素(spectino-mycin)及氯黴素(chloramphenicol)加以選擇。使用類似於美國專利5,914,451中所述之彼方法之方法用pMON53570轉型來自Asgrow大豆種類A5547的外植體。在自種子萌芽開始之時間的14小時內，將大豆外植體及含有pMON53570之經誘導根癌農桿菌混合且藉由超音波處理製造傷口。製造傷口後，將外植體置放於培養物中2至5天，之後將其轉移至含有用於經轉型植物細胞選擇之草甘膦及抗生素之選擇培養基。
使基因轉殖枝之選擇及形成進行6至8週。將正在發育之枝取樣且使用基於TIC107表現序列盒序列之引子，藉由PCR來分析TIC107序列盒之存在。產生約100個R0轉型品系且測試轉殖基因序列盒之單一複本之存在。用作第一遍篩選之南方分析(Southern analysis)使用裂解表現序列盒一次之限制性核酸內切酶。將單一EcoRV位點恰好插入表現序列盒之右邊界中。關於通常解離多複本品系中緊密連接之轉殖基因複本，該酶以足夠頻率在大豆基因組中裂解。如下所述，亦執行TAQMAN分析以確認R0代中之複本數。42個R0品系顯示轉殖基因序列盒之單複本插入且使其自我授粉以產生F1後代。自來自所選42個R0品系中之每一者的種子生長出75株F1植物。將草甘膦之非致死噴霧施用於所有F1後代。草甘膦抗性序列盒未經連接之彼等F1後代變黃，證明不存在草甘膦選擇序列盒。150株植物鑑別為未連接品系。將150株F1植物自草甘膦施用回收，且隨後測試在R1及R7生長階段，對針對藜豆夜蛾及大豆尺蠖蛾之進食之昆蟲抗性。所有品系通過針對飛蛾及尺蠖蛾之小於10%進食之生物檢定標準。
對150株所選F1植物執行南方分析以確認存在表現序列盒且不存在來自轉型載體之非所要核苷酸序列。自150個品系之池選出12個品系作為用於藉由南方分析進行複本數之進一步F1評估的最適當品系。如下所述，亦對所選F1品系執行TAQMAN及接合子型式檢定。在12個F1所選品系中，9個藉由初步南方分析證明毒素表現序列盒之單一複本。使來自9個品系之若干株系轉入F2及F3代以用於進一步昆蟲試驗及遺傳表徵。僅自各株系選擇單一F1植物來產生供連續傳代之種子。
在F3代，對4個所選株系執行更詳細南方分析以建立所插入表現序列盒之更詳細限制酶圖。在9個品系中，一個品系完全不含主鏈、草甘膦抗性序列盒及質體複製起點。稍後發現該品系具有兩個未連接昆蟲毒素表現序列盒且產生若干後代株系。在F3代，基於效能特徵及分子表徵選出亦稱為品系MON87701之一個後代株系。如下所述，使用反向PCR產生所選F3代株系中之每一者之側接序列。如下所述，使用經由經轉型及野生型株系之反向PCR推斷之序列，執行R0品系選擇及F1接合子型式分析。
實例2：使用反向PCR分離側接序列
如Ochman等人，1990(PCR Protocols:A guide to Methods and Applications,Academic Press，Inc.)中所述，使用反向PCR測定側接MON87701中T-DNA插入物之序列。自來自在溫室條件下生長之組織之Asgrow A5547及基因轉殖株系分離植物基因組DNA以供南方及TAQMAN分析。將約1公克幼小三葉組織與液氮組合且使用研缽及研杵研磨成精細粉末。根據製造商之方案，使用核子植物DNA萃取套組(RPN8511,Amersham,Piscataway,NJ)萃取DNA。在最終沈澱步驟後，將DNA再懸浮於0.5ml之TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)中。該方法可由熟習此項技術者修改以自包括(但不限於)種子之任何大豆組織萃取DNA。
用基於T-DNA之限制分析選出之限制性核酸內切酶消化DNA之等分試樣。使限制片段自我連接後，使用由T-DNA序列設計之引子執行PCR，該等引子將擴增自T-DNA之5'及3'末端伸展開來之序列。藉由瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物且使用QIAGEN凝膠純化套組(Qiagen,Valencia,CA)純化。使用標準定序方案，將所得產物直接定序。延伸至TIC107表現序列盒T-DNA之右邊界序列中之5'側接序列係以SEQ ID NO:3([C]，參見圖2)呈示。延伸至TIC107表現序列盒T-DNA之左邊界序列中之3'側接序列係以SEQ ID NO:4([D]，參見圖2)呈示。完全整合至A5547基因組DNA中之TIC107表現序列盒DNA(SEQ ID NO:7)之部分係以SEQ ID NO:5([E]，參見圖2)呈示。
將所分離序列與T-DNA序列相比較以鑑別側接序列及共同分離之T-DNA片段。表現序列盒存在之確認係藉由PCR，使用基於所推斷側接序列資料及已知T-DNA序列來設計之引子實現。使用由MON87701中之側接序列設計之引子，分離對應於T-DNA整合於經轉型株系中之相同區的A5547野生型序列。使用Elongase擴增系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)執行PCR反應。針對多個核苷酸及蛋白質資料庫來分析MON87701中之側接序列及A5547野生型序列。該資訊用以檢查轉殖基因與植物基因組之關係及檢查插入位點完整性。使用側接序列及野生型序列來設計用於TAQMAN端點檢定之引子，該等檢定係如實例3中所述，用以鑑別品系及測定接合子型式。
實例3：品系特異性端點TAQMAN及接合子型式檢定。
用以鑑別樣本中品系MON87701之方法描述於品系特異性端點TAQMANPCR中，其條件實例描述於表1及表2中。端點檢定中所用之DNA引引子為引子SQ1135(SEQ ID NO:9)、SQ1136(SEQ ID NO:10)及經6FAMTM 標記之引子PB63(SEQ ID NO:11)。6FAMTM 為連接於DNA引子之Applied Biosystems(Foster City,CA)之螢光染料產品。對TAQMANMGB探針而言，Taq DNA聚合酶之5'外切核酸酶活性自螢光團與淬滅劑之間的5'末端裂解探針。當與標靶DNA鏈雜交時，淬滅劑及螢光團充分分離以產生螢光信號，因此釋放螢光。
SQ1135(SEQ ID NO:9)及SQ1136(SEQ ID NO:10)當與PB63(SEQ ID NO:11)一起用於該等反應方法中時，產生可供診斷品系MON87701 DNA之DNA擴增子。該分析之對照應包括來自含有品系MON87701 DNA之大豆之正對照、來自非基因轉殖大豆之負對照及不含模板DNA之負對照。
將該等檢定優化以供Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或Stratagene Robocycler,MJ Engine,Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環器使用。熟習此項技術者已知產生鑑別品系MON87701 DNA之擴增子之其他方法及設備在此項技術之技術範圍內。
在Stratagene Robocycler，或MJ Engine，或Perkin-Elmer 9700，或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環器或Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或MJ Research DNA Engine PTC-225熱循環器中，使用以下循環參數進行DNA擴增。當在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中進行PCR時，熱循環器應以所計算出之模式來操作。當在Perkin-Elmer 9700中進行PCR時，以設定在最大值之斜坡速度操作熱循環器。
使顯示存在TIC107表現序列盒之R0植物發育為完全成熟植物。使用南方分析，用已知不在質體PacI中之兩個序列盒及各序列盒之間的區域中切割之DNA限制酶，評估R0植物之TIC107表現序列盒與草甘膦抗性表現序列盒之間的連接發生率。使用基於草甘膦抗性序列盒、TIC107序列盒及位於pMON53570中兩個表現序列盒之間的複製起點(OR-Ec.oriV-RK2)的序列所設計之探針來探測南方墨點以確定連接。亦使用南方分析及端點TAQMAN之組合來評估R0植物中TIC107表現序列盒之複本數。使顯示草甘膦抗性序列盒與TIC107表現序列盒之間的未連接關係之R0植物自我授粉且產生F1後代。
就歸因於在來自未連接自我授粉R0轉型品系之F1群體中發生之分離而使草甘膦抗性序列盒不存在來分析F1植物。將草甘膦之非致死應用施用於F1個體。抗性序列盒由於分離而喪失之彼等植物顯示因施用草甘膦導致之損傷。將該等植物回收且正常發育。如下所述，對F1植物使用TAQMAN端點檢定執行關於TIC107表現序列盒之接合子型式檢定。
用以測定樣本中品系MON87701的接合子型式之方法描述於品系特異性接合子型式端點TAQMAN PCR中，其條件實例描述於表3及表4中。該接合子型式檢定中所用之DNA引子為引子SQ3443(SEQ ID NO:12)、SQ3445(SEQ ID NO:13)、SQ3446(SEQ ID NO:14)、經6FAMTM 標記之引子PB1111(SEQ ID NO:15)及經VICTM 標記之引子PB1112(SEQ ID NO:16)。6FAMTM 及VICTM 為連接於DNA引子之Applied Biosystems(Foster City,CA)之螢光染料產品。對TAQ MAN MGB探針而言，Taq DNA聚合酶之5'外切核酸酶活性自螢光團與淬滅劑之間的5'末端裂解探針。當與標靶DNA鏈雜交時，淬滅劑及螢光團充分分離以產生螢光信號，因此釋放螢光。
SQ3443(SEQ ID NO:12)及SQ3445(SEQ ID NO:13)當與PB1111(SEQ ID NO:15)一起用於該等反應方法中時，產生可供診斷品系MON87701 DNA之DNA擴增子。該分析之對照應包括來自含有品系MON87701 DNA之大豆之正對照、來自非基因轉殖大豆之負對照及不含模板DNA之負對照。
SQ3445(SEQ ID NO:13)及SQ3446(SEQ ID NO:14)當與PB1112(SEQ ID NO:16)一起用於該等反應方法中時，產生可供診斷野生型等位基因之DNA擴增子。
藉由由來自兩個探針PB1111及PB1112之螢光信號之釋放所證明的兩個擴增子之存在來確定異型接合性。
將該等檢定優化以供Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或Stratagene Robocycler,MJ Engine,Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環器使用。熟習此項技術者已知產生鑑別品系MON87701 DNA之擴增子之其他方法及設備在此項技術之技術範圍內。
在Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700，或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環器或Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或MJ Research DNA Engine PTC-225熱循環器中，使用以下循環參數進行DNA擴增。當在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中進行PCR時，熱循環器應以所計算出之模式來操作。當在Perkin-Elmer 9700中進行PCR時，以設定在最大值之斜坡速度操作熱循環器。
亦測試品系MON87701 F1植物對飛蛾及尺蠖蛾之抗性。抗性定義為在R1及R7生長階段中小於10%之進食。另外對所選F1個體，使用南方分析及已知在TIC107表現序列盒中之一個單一位置EcoRV中切割之限制性核酸內切酶執行複本數分析。TIC107蛋白質在F1群體中之表現使用蛋白質測試條(EnviroLogix，用於CrylAc棉花葉及種子之QuickStixTM 套組，目錄號AS 003(Portland,Maine 04103))，按照製造商之方案來確認。對F3群體中之所選品系執行南方分析以確認單一完整T-DNA插入物之存在。最終株系選擇係基於田間測試中之效能特徵、蛋白質表現及分子表徵。
實例4：鑑別任何MON87701育種品系中之品系MON87701
以下實例描述可如何鑑別使用MON87701大豆之任何育種品系之後代中的MON87701品系。
使用DNA品系引子對來產生可供診斷大豆品系MON87701之擴增子。可供診斷MON87701之擴增子包含至少一個接點序列，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2([A]及[B]，分別如圖2中所說明)。SEQ ID NO:1(圖2之[A])為對應於5'側接序列(SEQ ID NO:3[C]之位置5748至5757，參見圖2)及TIC107表現序列盒之整合右邊界(SEQ ID NO:5[E]之位置1至10，參見圖2)之接點的核苷酸序列。SEQ ID NO:1亦對應於5'側接序列SEQ ID NO:3([C]，參見圖2)之位置5748至5767。SEQ ID NO:2([B]，參見圖2)為對應於TIC107表現序列盒之整合左邊界(SEQ ID NO:5[E]之位置6417至6426，參見圖2)及3'側接序列(SEQ ID NO:4[D]之位置379至388，參見圖2)之接點的核苷酸序列。SEQ ID NO:2([C]，參見圖2)亦對應於3'側接序列SEQ ID NO:4([D]，參見圖2)之位置369至388。
將產生MON87701之診斷性擴增子之品系引子對包括基於側接序列及所插入TIC107表現序列盒之引子對。為獲得存在SEQ ID NO:1之至少11個核苷酸之診斷性擴增子，基於SEQ ID NO:3鹼基1至5747設計正向引子且基於TIC107插入表現序列盒(亦即SEQ ID NO:5位置10至6416)設計反向引子。為獲得存在SEQ ID NO:2之至少11個核苷酸之診斷性擴增子，基於TIC107插入表現序列盒(亦即SEQ ID NO:5位置10至6416)設計正向引子，且基於3'側接序列(亦即SEQ ID NO:4鹼基389至2611)設計反向引子。出於實施目的，設計產生具有有限尺寸範圍，較佳在200至1000個鹼基之間的擴增子之引子。較小尺寸擴增子通常在PCR反應中更可靠地產生，允許更短之循環時間，且可容易地分離及以瓊脂糖凝膠觀測或適用於類似端點TAQMAN之檢定。另外，使用該等引子對產生之擴增子可被選殖至載體中、繁殖、分離且定序，或可直接用此項技術中充分建立之方法定序。來源於SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5之組合或SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5之組合之適用於DNA擴增方法中產生可供診斷MON87701或其後代之擴增子的任何引子對為本發明之一態樣。包含SEQ ID NO:3或其互補序列之至少11個連續核苷酸之適用於DNA擴增方法中產生可供診斷MON87701或其後代之擴增子的任何單一經分離DNA聚核苷酸引子分子為本發明之一態樣。包含SEQ ID NO:4或其互補序列之至少11個連續核苷酸之適用於DNA擴增方法中產生可供診斷MON87701或其後代之擴增子的任何單一經分離DNA聚核苷酸引子分子為本發明之一態樣。包含SEQ ID NO:5或其互補序列之至少11個連續核苷酸之適用於DNA擴增方法中產生可供診斷MON87701或其後代之擴增子的任何單一經分離DNA聚核苷酸引子分子為本發明之一態樣。
用於該分析之擴增條件之一實例說明於表5及表6中。然而，該等方法之任何修改形式或與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或MON87701的轉殖基因插入物(SEQ ID NO:5)中所含之遺傳元件之DNA序列同源或互補的產生可供診斷MON87701之擴增子之DNA引子的使用係在此項技術之範圍內。診斷性擴增子包含與至少一個轉殖基因/基因組接點DNA(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或其實質部分同源或互補之DNA分子。
對品系MON87701植物組織樣本之分析應包括來自品系MON87701之正組織對照、來自不為品系MON87701之大豆植物(例如(但不限於)A5547)的負對照及不含大豆基因組DNA之負對照。將擴增內源性大豆DNA分子之引子對將用作DNA擴增條件之內部對照。其他引子序列可由熟習DNA擴增方法之技術者選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，且選用於藉由表5及表6中所示之方法產生擴增子之條件可不同，但均產生可供診斷品系MON87701 DNA之擴增子。使用該等DNA引子序列與表5及表6之方法之修改形式在本發明之範疇內。藉由至少一個來源於SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之DNA引子序列產生之可供診斷MON87701的擴增子為本發明之一態樣。
含有至少一個來源於SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5之DNA引子之DNA檢測套組為本發明之一態樣，當該DNA引子用於DNA擴增方法中時，產生MON87701或其後代之診斷性擴增子。當在DNA擴增方法中測試時基因組將產生可供診斷MON87701之擴增子之大豆植物或種子為本發明之一態樣。對MON87701擴增子之檢定可藉由使用Applied Biosystems GeneAmp PCR系統9700或Stratagene Robocycler，或MJ Engine，或Perkin-Elmer 9700，或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環器或可用於產生可供診斷MON87701之擴增子之任何其他擴增系統，如表6中所示來執行。
上文所揭示及申請專利範圍中所述之大豆品系MON87701種子之寄存已在布達佩斯條約(Budapest Treaty)下，由美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA. 20110)進行。ATCC寄存編號為PTA-8194。將寄存物維持在儲藏室歷時30年之時期，或最後要求後5年，或歷時專利之有效期(無論何者更長)，且在該時期內將在必要時替換。
已說明及描述本發明之原理，對熟習此項技術者而言顯而易見，本發明可在不悖離該等原理之情況下對配置及細節加以修改。吾人主張在隨附申請專利範圍之精神及範疇內之所有修改。
圖1說明用以產生大豆植物MON87701之二元轉型載體pMON53570之圖。
圖2說明大豆品系MON87701基因組中之基因轉殖插入物之構成：[A]對應於SEQ ID NO:1之相對位置，其形成SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:5之間的接點；[B]對應於SEQ ID NO:2之相對位置，其形成SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:5之間的接點；[C]對應於SEQ ID NO:3之相對位置，側接整合至品系MON87701之基因組中之表現序列盒的任意指定/命名5'末端的大豆基因組序列；[D]對應於SEQ ID NO:4之相對位置，側接整合至品系MON87701之基因組中之表現序列盒的任意指定/命名3'末端的大豆基因組序列；[E]表示包含SEQ ID NO:5之各種元件且為插入品系MON87701之基因組中之表現序列盒的序列；且[F]表示如圖中自左至右所表示，包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:4之連續序列，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2如上所述併入其中，因為該等序列存在於品系MON87701之基因組中。
(無元件符號說明)

Claims (33)

  1. 一種DNA分子，其包含SEQ ID NO：1或其完全互補序列之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之DNA分子，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或其完全互補序列之核苷酸序列。
  3. 一種DNA分子，其包含SEQ ID NO：2或其完全互補序列之核苷酸序列。
  4. 如請求項3之DNA分子，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或其完全互補序列之核苷酸序列。
  5. 如請求項2或4之DNA分子，其基本上由SEQ ID NO：3之位置1至5757之核苷酸序列、SEQ ID NO：5之位置1至6426之核苷酸序列、及SEQ ID NO：4之位置379至2611之核苷酸序列、或其完全互補序列組成。
  6. 如請求項2或4之DNA分子，其基本上由SEQ ID NO：6之核苷酸序列或其完全互補序列組成。
  7. 一種製備大豆植物或其部分之方法，其包含將含有SEQ ID NO：5之序列之TIC107表現序列盒併入大豆植物基因組中，以及獲得含有如請求項1至6中任一項之DNA分子之大豆植物或其部分。
  8. 一種製備大豆種子之方法，其包含將含有SEQ ID NO：5之序列之TIC107表現序列盒併入大豆植物基因組中，獲得含有如請求項1至6中任一項之DNA分子之大豆植物，以及自該大豆植物獲得大豆種子。
  9. 一種包含如請求項1至6中任一項之DNA分子之組合物， 其中該組合物為衍生於如請求項7或8之方法所製備之大豆植物或其部分或其種子之大豆粕(soybean meal)、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化(texturized)大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質、大豆油或發泡奶油(whipped topping)。
  10. 一種產生抗昆蟲大豆植物之方法，其包含：(a)使由如請求項7之方法所製備之大豆植物與另一大豆植物雜交；(b)獲得至少一種來源於(a)之雜交之後代植物；及(c)選擇包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之核苷酸序列之後代，其中該所選後代為抗昆蟲大豆植物。
  11. 如請求項10之方法，其中該選擇步驟(c)包括使自(b)所獲得之該至少一種後代植物經核酸擴增反應，其中選擇產生包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中之至少一個核苷酸序列之擴增子(amplicon)的後代，或使自(b)所獲得之該至少一種後代植物經核酸雜交反應，其中選擇與一種在嚴格條件下與選自SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2之一或多個DNA序列雜交的探針雜交之後代。
  12. 一種保護大豆植物免受昆蟲侵襲之方法，其包含在大豆之鱗翅目(Lepidopteran)害蟲之餌料中提供殺昆蟲有效量之如請求項7之方法所製備之大豆植物或其部分的細胞或組織。
  13. 如請求項12之方法，其中該鱗翅目害蟲係選自由飛蛾 (Anticarsia)、尺蠖蛾(Pseudoplusia)、卷葉蛾(Epinotia)、燈蛾(Spilosoma)、鈴夜蛾(Helicoverpa)、夜蛾(Spodoptera)及灰夜蛾(Rachiplusia)組成之群。
  14. 一對DNA分子，其包含：第一DNA分子及第二DNA分子，其中該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或其完全互補序列之連續核苷酸，以用作可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針，其中該DNA引子或探針係用於診斷含有SEQ ID NO：1或其完全互補序列之核苷酸序列之擴增子。
  15. 一對DNA分子，其包含：第一DNA分子及第二DNA分子，其中該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或其完全互補序列之連續核苷酸，以用作可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針，其中該DNA引子或探針係用於診斷含有SEQ ID NO：2或其完全互補序列之核苷酸序列之擴增子。
  16. 一對DNA分子，其包含：第一DNA分子及第二DNA分子，其中該等DNA分子具有足夠長度之SEQ ID NO：6或其完全互補序列之連續核苷酸，以用作可供診斷自大豆植物MON87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針，其中該DNA引子或探針係用於診斷含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其完全互補序列之核苷酸序列之擴增子。
  17. 如請求項14或16之DNA分子對，其中該第一DNA分子包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或其完全互補序列之轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續核苷酸，且該第二DNA分子包含相似長度之SEQ ID NO：3或其完全互補序列之5'側接大豆基因組DNA區。
  18. 如請求項17之DNA分子對，其中該第一DNA分子包含SEQ ID NO：9且該第二DNA分子包含SEQ ID NO：10。
  19. 如請求項15或16之DNA分子對，其中該第一DNA分子包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或其完全互補序列之轉殖基因區之任何部分的11個或11個以上連續核苷酸，且該第二DNA分子包含相似長度之SEQ ID NO：4或其完全互補序列之3'側接大豆基因組DNA區。
  20. 如請求項19之DNA分子對，其中該第一DNA分子包含SEQ ID NO：12且該第二DNA分子包含SEQ ID NO：13。
  21. 一種檢測生物樣本中選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6組成之群之DNA分子存在之方法，該方法包含：(a)使該生物樣本與一對DNA引子接觸，該對DNA引子包含DNA引子分子具有足夠長度之SEQ ID NO：3或其完全互補序列、SEQ ID NO：4或其完全互補序列，或SEQ ID NO：6或其完全互補序列之連續核苷酸以用作可供診斷自大豆植物MPN87701或其後代萃取之DNA之DNA引子或探針，其中該DNA引子或探針係用於診斷含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其完全互補 序列之核苷酸序列之擴增子；(b)提供核酸擴增反應條件；(c)執行該核酸擴增反應，由此產生DNA擴增子分子；及(d)檢測該DNA擴增子分子，其中檢測一種包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及其完全互補序列中之至少一者之擴增子指示該生物樣本中該DNA分子之存在。
  22. 如請求項21之方法，其中該生物樣本為自大豆植物萃取之DNA樣本。
  23. 一種檢測生物樣本中選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6組成之群之DNA分子存在之方法，該方法包含：(a)使該生物樣本與如請求項14至20中任一項所界定之DNA探針接觸，該DNA探針在嚴格條件下與該DNA分子雜交且在嚴格雜交條件下不與不含該DNA分子之生物樣本雜交；(b)使該生物樣本及DNA探針經嚴格雜交條件；及(c)檢測該DNA探針與該生物樣本之雜交，其中雜交之檢測指示該生物樣本中該DNA分子之存在。
  24. 如請求項23之方法，其中該生物樣本為自大豆植物萃取之DNA樣本。
  25. 如請求項23或24之方法，其中該DNA探針包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其完全互補序列。
  26. 如請求項23或24之方法，其中該DNA探針包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：15。
  27. 如請求項23至26之方法，其中該DNA探針係經至少一種螢光團標記。
  28. 如請求項21或23之方法，其中該生物樣本係選自由大豆粕、大豆粉、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質分離物、組織化大豆蛋白質濃縮物、水解大豆蛋白質及發泡奶油組成之群。
  29. 一種DNA檢測套組，其包含：至少兩種DNA分子，其具有足夠長度之與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6同源或完全互補之連續核苷酸以用作對大豆品系MON87701及/或其後代具特異性之DNA引子或探針，其中該DNA引子或探針係用於診斷含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其完全互補序列之核苷酸序列之擴增子。
  30. 如請求項29之DNA檢測套組，其中該至少一種DNA分子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其完全互補序列。
  31. 如請求項30之DNA檢測套組，其中該至少一種DNA分子為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其完全互補序列。
  32. 一種測定大豆樣本中包含大豆品系MON87701之大豆植物基因組的DNA之接合子型式(zygosity)之方法，其包含：(a)使該樣本與SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13之第一對引子接觸，當該第一對引子與大豆品系MON87701 DNA一起用於核酸擴增反應中時，產生一種可供診斷大豆品系MON87701之擴增子； (b)執行核酸擴增反應；(c)檢測所產生之第一擴增子；(d)使該樣本與SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之第二對引子接觸，當該第二對引子與非大豆品系MON 87701 DNA之大豆基因組DNA一起用於核酸擴增反應中時，產生一種可供診斷非大豆品系MON87701 DNA之大豆基因組DNA之擴增子；(e)執行核酸擴增反應；及(f)檢測所產生之第二擴增子；其中檢測可供診斷大豆品系MON87701之該擴增子及可供診斷非大豆品系MON87701 DNA之大豆基因組DNA之該擴增子指示該樣本對大豆品系MON87701 DNA為異型接合(heterozygous)。
  33. 如請求項32之方法，其中該第一對引子另與SEQ ID NO：15之探針一起使用，及/或其中該第二對引子另與SEQ ID NO：16之探針一起使用。
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