CN110373488A

CN110373488A - 一种检测转基因成分的dna标准样品及其应用

Info

Publication number: CN110373488A
Application number: CN201910507717.8A
Authority: CN
Inventors: 付伟; 朱鹏宇; 王晨光; 朱水芳
Original assignee: China inspection and Quarantine Research Institute
Current assignee: China inspection and Quarantine Research Institute; Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2019-10-25

Abstract

本申请公开了一种检测转基因成分的DNA标准样品及其应用。所述DNA标准样品中含有SEQ ID No.1—7所示DNA片段，分别为元件T‑E9、T‑NOS、P‑CaMV35S(P‑35S)、PAT、T‑PinII、P‑Rbcs4、T‑CaMV35S(T‑35S)的特异性片段。通过检测这7个靶标可以覆盖目前商业化的绝大部分转基因品种(至少63个)，只有3个不含有外源元件的转基因玉米DAS40278转化体、转基因大豆DP305423和CV127转化体会漏检。经检测，所述标准样品的均匀性、稳定性及定值等检测均符合要求，可用于相应外源元件日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动等，可商业化推广应用。

Description

一种检测转基因成分的DNA标准样品及其应用

技术领域

本发明涉及转基因检测技术领域，具体说是一种检测转基因成分的DNA标准样品及其应用。

背景技术

近20多年来，全球转基因生物研发及商业化迅猛发展，产生了巨大的经济效益和社会效益。与此同时，转基因生物的安全性问题一直备受社会各界关注，为此，包括中国、欧盟、美国、日本和韩国等在内60多个国家和地区纷纷颁布实施转基因生物安全管理法律法规，以规范转基因生物的研发和产业化应用。

随着转基因产业的迅速发展，不断有新的转化事件推出，而且田间试验的频次也在逐年攀升，在实际检测和执法工作中，检测机构首先利用筛查检测方法对样品进行筛查检测，做有无转基因成分的判断。检测工作的开展、检测结果的质量控制和溯源都离不开标准样品。无论是目前在研的标准样品还是在售的标准样品，无论是基体标准样品还是质粒标准样品，绝大部分都是基于转化事件特异性检测的需要研制的，没有满足所有转基因筛查检测需求的标准样品。在转基因筛查检测中，要根据检测的靶标选用含有相应靶标的转基因材料作为阳性对照，通常针对多个检测靶标要设置多个阳性对照，增大了提取DNA的工作量，而且为了考察DNA质量，还要多设置内标准基因的反应，进一步推高了检测成本，增大了检测的工作量，为检测工作造成不便。目前转基因筛查检测阳性对照(标准样品)的缺乏阻碍了转基因检测工作的开展。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测转基因成分的DNA标准样品及其应用，本发明通过前期的信息检索和生物信息学分离，确定了转基因筛查检测的7个常用检测靶标(T-E9、T-NOS、P-CaMV35S(即P-35S)、PAT、T-PinII、P-Rbcs4、T-CaMV35S(即T-35S))，通过检测这7个靶标可以覆盖目前商业化的绝大部分转基因品种(至少63个)，只有3个不含有外源元件的转基因玉米DAS40278转化体、转基因大豆DP305423和CV127转化体会漏检。为了达到对商业化转基因品种全覆盖检测的目的，本发明将7个筛查检测靶标和1个转基因玉米转化体、2个转基因大豆转化体特异性检测靶标聚合构建到一个质粒分子上，获得了稳定可靠的质粒标准样品。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明首先提供一种检测转基因成分的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品包括SEQ ID No.1—7所示DNA片段；

其中，SEQ ID No.1为豌豆核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基E9基因终止子(T-E9)上的特异性片段；

SEQ ID No.2为胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)上的特异性片段；

SEQ ID No.3为花椰菜花叶病毒启动子(P-35S)上的特异性片段；

SEQ ID No.4为绿产色链霉菌编码膦丝菌素乙酰转移酶基因(PAT)上的特异性片段；

SEQ ID No.5为马铃薯蛋白酶抑制剂II终止子(T-PINII)上的特异性片段；

SEQ ID No.6为拟南芥RbcS4基因启动子(P-RbcS4)上的特异性片段；

SEQ ID No.7为花椰菜花叶病毒终止子(T-35S)上的特异性片段。

在一种优选的实施方式中，所述SEQ ID No.1—7所示DNA片段按照SEQ ID No.1—7的顺序依次连接。

在一种优选的实施方式中，所述DNA标准样品中还包括SEQ ID No.8—10所示DNA片段；

优选的，所述SEQ ID No.8—10所示DNA片段按照SEQ ID No.8—10的顺序依次连接；

其中，SEQ ID No.8为转基因玉米DAS40278转化体上的特异性片段；

SEQ ID No.9为转基因大豆DP305423转化体上的特异性片段；

SEQ ID No.10为转基因大豆CV127转化体上的特异性片段。

在一种优选的实施方式中，所述DNA标准样品中所述SEQ ID No.1—7所示DNA片段和所述SEQ ID No.8—10所示DNA片段连接后的序列如SEQ ID No.56所示。

本发明还提供了一种包含以上任一所述的DNA标准样品的重组载体，优选的，所述重组载体的骨架载体选自pUC18、pUC19、pUC57中的一种或多种，更优选，pUC57，更优选，将所述DNA标准样品连接于pUC57平端酶EcoRV的酶切位点处。

本发明还提供了一种检测转基因成分的PCR试剂盒，所述试剂盒包括以上任一所述DNA标准样品或所述重组载体。

在一种优选的实施方式中，所述试剂盒还包括分别检测SEQ ID No.1—7所示DNA片段的引物组合；

优选的，所述试剂盒还包括分别检测SEQ ID No.8—10所示DNA片段的引物组合。

在一种优选的实施方式中，所述检测SEQ ID No.1所示DNA片段的引物组合为引物组合1和/或引物组合2，

所述引物组合1包括引物对1，所述引物对1的上游引物如SEQ ID No.11所示，下游引物如SEQ ID No.12所示，优选的，所述引物组合1还包括检测所述引物对1扩增产物的探针1，所述探针1如SEQ ID No.13或其互补序列所示；

所述引物组合2包括引物对2，所述引物对2的上游引物如SEQ ID No.14所示，下游引物如SEQ ID No.15所示，优选的，所述引物组合2还包括检测所述引物对2扩增产物的探针2，所述探针2如SEQ ID No.16或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.2所示DNA片段的引物组合为引物组合3和/或引物组合4，

所述引物组合3包括引物对3，所述引物对3的上游引物如SEQ ID No.17所示，下游引物如SEQ ID No.18所示，优选的，所述引物组合3还包括检测所述引物对3扩增产物的探针3，所述探针3如SEQ ID No.19或其互补序列所示；

所述引物组合4包括引物对4，所述引物对4的上游引物如SEQ ID No.20所示，下游引物如SEQ ID No.21所示，优选的，所述引物组合2还包括检测所述引物对4扩增产物的探针4，所述探针4如SEQ ID No.22或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.3所示DNA片段的引物组合为引物组合5和/或引物组合6，

所述引物组合5包括引物对5，所述引物对5的上游引物如SEQ ID No.23所示，下游引物如SEQ ID No.24所示，优选的，所述引物组合5还包括检测所述引物对5扩增产物的探针5，所述探针5如SEQ ID No.25或其互补序列所示；

所述引物组合6包括引物对6，所述引物对6的上游引物如SEQ ID No.26所示，下游引物如SEQ ID No.27所示，优选的，所述引物组合2还包括检测所述引物对6扩增产物的探针6，所述探针6如SEQ ID No.28或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.4所示DNA片段的引物组合为引物组合7和/或引物组合8，

所述引物组合7包括引物对7，所述引物对7的上游引物如SEQ ID No.29所示，下游引物如SEQ ID No.30所示，优选的，所述引物组合7还包括检测所述引物对7扩增产物的探针7，所述探针7如SEQ ID No.31或其互补序列所示；

所述引物组合8包括引物对8，所述引物对8的上游引物如SEQ ID No.32所示，下游引物如SEQ ID No.33所示，优选的，所述引物组合2还包括检测所述引物对8扩增产物的探针8，所述探针8如SEQ ID No.34或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.5所示DNA片段的引物组合为引物组合9，

所述引物组合9包括引物对9，所述引物对9的上游引物如SEQ ID No.35所示，下游引物如SEQ ID No.36所示，优选的，所述引物组合9还包括检测所述引物对9扩增产物的探针9，所述探针9如SEQ ID No.37或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.6所示DNA片段的引物组合为引物组合10，

所述引物组合10包括引物对10，所述引物对10的上游引物如SEQ ID No.38所示，下游引物如SEQ ID No.39所示，优选的，所述引物组合10还包括检测所述引物对10扩增产物的探针10，所述探针10如SEQ ID No.40或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.7所示DNA片段的引物组合为引物组合11和/或引物组合12，

所述引物组合11包括引物对11，所述引物对11的上游引物如SEQ ID No.41所示，下游引物如SEQ ID No.42所示，优选的，所述引物组合11还包括检测所述引物对11扩增产物的探针11，所述探针11如SEQ ID No.43或其互补序列所示；

所述引物组合12包括引物对12，所述引物对12的上游引物如SEQ ID No.44所示，下游引物如SEQ ID No.45所示，优选的，所述引物组合12还包括检测所述引物对12扩增产物的探针12，所述探针12如SEQ ID No.46或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.8所示DNA片段的引物组合为引物组合13，

所述引物组合13包括引物对13，所述引物对13的上游引物如SEQ ID No.47所示，下游引物如SEQ ID No.48所示，优选的，所述引物组合13还包括检测所述引物对13扩增产物的探针13，所述探针13如SEQ ID No.49或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.9所示DNA片段的引物组合为引物组合14，

所述引物组合14包括引物对14，所述引物对14的上游引物如SEQ ID No.50所示，下游引物如SEQ ID No.51所示，优选的，所述引物组合14还包括检测所述引物对14扩增产物的探针14，所述探针14如SEQ ID No.52或其互补序列所示；

所述检测SEQ ID No.10所示DNA片段的引物组合为引物组合15，

所述引物组合15包括引物对15，所述引物对15的上游引物如SEQ ID No.53所示，下游引物如SEQ ID No.54所示，优选的，所述引物组合15还包括检测所述引物对15扩增产物的探针15，所述探针15如SEQ ID No.55或其互补序列所示。

本发明还提供了以上任一所述DNA标准样品、所述重组载体或以上任一所述试剂盒在检测转基因成分中的应用。

本发明还提供了一种检测转基因成分的PCR方法，所述方法包括利用以上任一所述DNA标准样品或所述重组载体为阳性对照进行PCR的步骤，

在一种优选的实施方式中，所述PCR使用以上任一所述试剂盒进行。

在上述产品、应用和方法中，优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；

所述转基因植物包括但不限于如下植物：玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻；

所述基因包括T-E9、T-NOS、P-35S、PAT、T-PINII、P-RbcS4、T-35S、转基因玉米DAS40278转化体特异性片段、转基因大豆DP305423转化体上的特异性片段、转基因大豆CV127转化体上的特异性片段。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明的质粒标准样品覆盖全面，含有7个筛选元件T-E9、T-NOS、P-CaMV35S(即P-35S)、PAT、T-PinII、P-Rbcs4和T-CaMV35S(即T-35S)，即SEQ ID No.1—7所示DNA片段，以及SEQ ID No.8—10所示DNA片段，覆盖了市面上包含玉米DAS40278品系、大豆DP305423品系和大豆CV127品系的三个品系之内的所有商业化的转基因品系(至少66种)的特异性外源片段或发生转基因插入的特异性片段，减少了转基因成分检测中阳性标准样品的使用数量，降低了漏检的可能性。

(2)本发明的质粒标准样品经实际检测，均匀性、稳定性及定值等检测均符合要求，可用于10种外源元件日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动等，可商业化推广应用。

(3)本发明还提供了检测(1)中所述特异性外源片段或发生转基因插入的特异性片段的特异性引物对及探针和PCR检测方法，可同时对7个筛选元件和/或玉米DAS40278和/或大豆DP305423和/或大豆CV127的品系特异性序列进行定性和定量检测，且重复性好、高通量、灵敏、准确和快速的优点，在转基因成分检测方面具有很好的应用前景。

本发明对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国转基因产品检测标准样品的研制，填补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

附图说明

图1为聚合10种外源元件的标准质粒分子结构示意图，其中，bla代表质粒上bla基因片段，MSC Feature 1代表质粒上的MSC特征序列1，Rep orgigin 1代表报告基因片段1，Protein Bind 1代表蛋白结合区域1，Protein Bind 2代表蛋白结合区域2，箭头方向代表质粒序列方向。

图2为pUC57-Exo质粒DNA电泳图谱，其中，左起第一泳道为DNAmarker，从上到下片段大小依次为10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp、250bp，左起第二泳道为pUC57-Exo质粒DNA。

图3为酶切线性化pUC57-Exo质粒DNA电泳图谱。

图4为pUC57-Exo质粒混合24小时后荧光定量PCR扩增图，其中，图A和图B分别为以T-E9和CV127基因(元件)为测试靶标。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中，pUC57质粒载体由上海生工生物技术科技有限公司公司提供，产品目录号为B522201。

实施例1、质粒标准样品的构建

1、十种外源基因序列的确定

根据大量的市场调研数据，先确定市面上所有真正商业化种植的转基因品系，再确定如下7种筛选元件作为覆盖除玉米DAS40278、大豆DP305423和大豆CV127品系外的筛选元件：T-E9、T-NOS、P-35S、PAT、T-PinII、P-Rbcs4、T-35S；最后再查询并确定三种转基因品系：玉米DAS40278、大豆DP305423和大豆CV127的品系特异性序列。

通过大量的转基因信息检索、序列比对、序列拼接和序列稳定性分析预测，解决了不同外源基因之间潜在存在的序列互补问题，使最终的重组质粒中的所有外源序列可以实现稳定扩增，最终确定了上述7种筛选元件和上述3种品系特异性序列中可以用于构建质粒标准样品的DNA片段片段，具体如下：

T-E9上的特异性片段如SEQ ID No.1所示；

T-NOS上的特异性片段如SEQ ID No.2所示；

P-35S上的特异性片段如SEQ ID No.3所示；

PAT上的特异性片段如SEQ ID No.4所示；

T-PINII上的特异性片段如SEQ ID No.5所示；

P-RbcS4上的特异性片段如SEQ ID No.6所示；

T-35S上的特异性片段如SEQ ID No.7所示；

转基因玉米DAS40278上的特异性片段如SEQ ID No.8所示；

转基因大豆DP305423上的特异性片段如SEQ ID No.9所示；

转基因大豆CV127上的特异性片段如SEQ ID No.10所示。

2、序列合成及质粒标准样品制备

将SEQ ID No.1—10所示DNA片段按顺序依次拼接到一起，长1298bp(SEQ IDNo.56)，委托上海生工生物工程有限公司采用基因合成技术，人工合成长1298bp的外源特异性序列并克隆到pUC57质粒上(pUC57质粒用平端酶EcoRV酶切，通过平端连接克隆)，将构建的标准质粒分子命名为pUC57-Exo(图1)。

将构建的标准质粒分子pUC57-Exo转化到大肠杆菌中，筛选阳性克隆。提取质粒，将质粒送给三家不同的测序公司分别进行测序。三家测序公司分别为上海生工生物工程有限公司、武汉擎科创新生物科技有限公司、北京华大基因科技股份有限公司。三家测序公司的测序结果完全一致，并与预期序列吻合，证明构建的标准质粒分子中含有预期的外源特异性序列。

实施例2、标准质粒分子pUC57-Exo的标准样品的制备

1、质粒DNA的提取

将pUC57-Exo质粒的阳性菌种划平板挑取单克隆菌落，在1ml含有抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养16-18h。吸取100μL培养液到100mL含有抗生素的LB培养液中扩大培养，37℃振荡培养16-18h(OD值在0.8以上)，共收集100mL菌液。4℃6000g离心15min以收集菌体。采用QIAfilter Plasmid Midi Kits试剂盒进行质粒分子的大量提取和纯化。

2、质粒DNA质量评价和浓度测定

取1μL提取的质粒DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带清晰明亮，说明提取的质粒DNA质量很好。电泳图见图2，条带大小与预期相符，质量符合要求。

采用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度与纯度(A260/A280值应在1.8到2.0之内，A260/A230值应该大于2.0)。通过紫外分光光度法利用Nanodrop2000(ThermoScientific,Wilmington,USA)测定的pUC57-Exo质粒DNA的A260/A280值为1.85±0.01，介于1.8至2.0之间，表明其纯度符合要求，其浓度为92.5±0.5ng/μL。

3、质粒DNA的酶切线性化与纯化

根据质粒的核苷酸序列，选取单酶切位点BamHI(NEB BamHI-HF，货号R3136V)对环状质粒DNA进行酶切线性化。酶切体系如下：

采用QIAquick Gel Extraction Kit对酶切后的产物进行切胶回收。

4、线性质粒分子质量评价和浓度测定

取1μL酶切纯化后的质粒DNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带清晰明亮，条带单一，无杂带和RNA条带，说明提取的质粒DNA质量很好。电泳图见图3，质量符合要求。

采用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度与纯度。(A260/A280值应在1.8到2.0之间，A260/A230值应该大于2.0)。同时使用Picogreen荧光法测定DNA浓度。

通过紫外分光光度法利用Nanodrop2000(Thermo Scientific,Wilmington,USA)测定的pUC57-Exo质粒标准物质的A260/A280值为1.88±0.01，介于1.8至2.0之间(表1)，表明其纯度符合要求，其浓度为76.1±0.2。两种方法所测的质粒浓度相近，表明利用QIAfilter Plasmid Midi Kits试剂盒提取的质粒DNA浓度和纯度高，能够满足大批量制备质粒标准物质。

表1、pUC57-Exo质粒分子的浓度和纯度测定结果

pUC57-Exo	1	2	3	4	5	6	平均值	SD
									OD260/OD230	2.15	2.13	2.16	2.15	2.14	2.13	2.14	0.01
OD260/OD280	1.90	1.87	1.89	1.88	1.87	1.88	1.88	0.01
									紫外法浓度	76.2	76.0	75.8	76.0	76.2	76.3	76.1	0.2
Picogreen荧光法浓度	78.3	78.5	78.8	78.1	78.5	78.9	78.5	0.3

5、质粒DNA的稀释与混匀

(1)质粒DNA的稀释

以紫外分光光度法测定的质粒分子浓度为依据，按下面公式对质粒质量浓度和拷贝数浓度进行换算:

Cc＝(Cm×NA×10^-9)/(M×2×S)

式中：

Cc——质粒拷贝数浓度，copies/μL；

Cm——质粒质量浓度，mg/L；

NA——阿伏伽德罗常数,6.02×10²³copies/mol；

M——核苷酸的平均分子量，g/mol；

S——质粒分子的大小，bp。

用T₁E_0.01(1.0mmol/L Tris-Hcl，0.01mM EDTA，pH8.0)将粉末状大肠杆菌tRNA(Sigma，货号R1753-500UN)稀释至50ng/μL，以50ng/μL大肠杆菌tRNA为稀释剂将质粒分子稀释至约1×10⁶copies/μL。

(2)质粒DNA的均匀性初检

将稀释后的质粒利用摇床以150rpm的转速进行混匀。混匀过程中每隔8小时取样一次，共取样4次。每次选不同的部位进行取样，取样9份，每份取样10μL。先用实时荧光PCR以T-E9和CV127基因(元件)为测试靶标检测抽取样品的Ct值(方法与实施例3中的步骤2相同)，结果显示当混匀24小时后，抽取样品的扩增曲线基本重合(图4)，Ct值大小也非常接近，T-E9Ct值平均值22.35，SD值0.07，CV127Ct值平均值22.13，SD值0.09(表2)。推测混合24小时后，质粒DNA已充分混匀。

表2、均匀性初检pUC57-Exo质粒分子的荧光定量PCR测定Ct值

然后用微滴数字PCR检测不同时间点抽取样品的拷贝数浓度。选取PAT和NOS作为微滴数字PCR的检测靶标(扩增体系与扩增程序与实施例6中的相同)，取其平均值作为质粒的拷贝数浓度值。检测结果如表3所示，对测试结果进行F检验。均匀性初检结果表明，在样品混匀24小时后，不同部位抽取的DNA样品拷贝数浓度无显著差异，均匀性良好，可进行分装。

表3、均匀性初检pUC57-Exo质粒分子浓度的数字PCR测定结果

6、质粒DNA的分装

将经过质量评估及浓度测定，以及均匀性初检的质粒DNA在生物安全柜中进行人工分装。分装的质粒DNA每管100μL，共分装500管。将分装的质粒DNA置于100格冷冻盒中，保存于-70℃超低温冰箱中，即标准样品。

实施例3、标准样品的均匀性检测

1、抽样数量

从实施例2步骤6中分装成最小包装单元的候选标准样品中随机抽取15管进行均匀性检测。

2、采用荧光定量PCR方法进行均匀性检测

对10个外源元件分别进行荧光定量PCR检测，所用引物和探针如表4所示，荧光定量PCR的工作原理是：PCR反应中的Taq DNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性，能够水解荧光色素标记的杂交探针，从而将报告基团释放出来并产生荧光，而报告基团发射出来的荧光信号强弱与指数增加的靶标DNA片段成一定比例。通过检测荧光信号便可以对每个反应阶段的PCR产物进行实时监测。在CFX96荧光PCR仪(Bio-rad,HercμLes,CA,USA)上进行10种外源元件的PCR扩增，25μL PCR反应体系主要包括：2×TaqMan Universal Master Mix12.5μL，上下游引物各1.0μL(10μmol/L)，荧光标记探针溶液0.5μL(10μmol/L)，DNA模板2.0μL。PCR反应程序如下：50℃预消化2min；95℃变性、UNG酶失活10min；50个循环(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)。

表4、10种外源元件的引物/探针及检测靶标信息

注：表4中上游引物、下游引物和探针后的编号相同，表示为一组引物组合，即该探针用于检测该上游引物和该下游引物的扩增产物；所述探针均为TaqMan探针，5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA。

3、均匀性检验

本批质粒标准样品共抽取15管样品，每管样品设置3个子样,共45个子样。采用荧光定量PCR技术以质粒标准样品为模板，检测10个外源元件的有无。经荧光定量PCR分析测定，45个子样中的10种外源元件均产生典型扩增曲线，Ct值在20左右(18—21)，结果为阳性。

为了考察特性量值的均匀性性，将标准样品进行梯度稀释，绘制10个外源元件的标准曲线，定量标准样品的拷贝数浓度。绘制标准曲线的各项技术参数都在可接受的范围内，标准曲线的斜率在-3.3～-3.6之间，截距在38～42之间，决定系数在0.999～1.000之间，扩增效率在90％到110％之间，结果表明采用实施例2制备得到的标准样品绘制标准曲线，可用于转基因产品成分的定量检测。依据绘制的标准曲线，定量质粒标准样品中各个元件的拷贝数浓度，取10个元件拷贝数浓度的平均值作为质粒标准样品的拷贝数浓度。采用方差分析法(F检验法)进行均匀性检验(表5)，统计分析结果均表明F<F0.05(14,30)，实施例2制备得到的标准样品的拷贝数浓度量值在管间具有良好的均匀性。

表5、瓶间均匀性检验结果

4、均匀性不确定度评估

均匀性检验结果表明，质粒DNA标准物质在瓶间具有良好的均匀性。由于(表11)，转化体特异性序列与内标准基因拷贝数比值这一特性量值的均匀性引入的不确定度采用下面公式进行计算：

相对不确定度

5、最小取样量

使用该标准样品制作标准曲线时需要进行梯度稀释，本项目在进行管间均匀性实验时，取2μL溶液进行梯度稀释，绘制的标准曲线具有良好的线性。在进行管间均匀性检验时，每个反应管的加样量为2μL。因此确定了进行样品稀释时最小取样量为2μL，进行PCR反应时最小取样量为2μL。

实施例4、标准样品稳定性检测

1、长期稳定性试验

长期稳定性检验是将样品分别存储在4℃和-20℃，分别在第0月、第1月、第2月、第4月、第6月、第12月后取样并储存于-70℃，每次每个贮存温度随机选取3管，每管重复取样3次(N＝3，n＝3)。采用实时荧光PCR方法，对不同时间点/不同温度抽取的实施例2制备得到的标准样品进行定性测试，测试结果显示，在4℃和-20℃条件下，所有子样的10种外源元件都有典型扩增曲线，Ct值在20左右，检测结果为阳性。实施例2制备得到的样品可以稳定的用作10种外源元件检测的阳性对照。

为了考察标准样品拷贝数浓度的长期稳定性，采用荧光定量PCR方法分别定量10种外源元件的拷贝数浓度，考察其平均值的长期稳定性。以梯度稀释的质粒DNA作为标准品，进行实时荧光定量PCR扩增，绘制10种外源元件的标准曲线，根据绘制的标准曲线，定量不同时间点(0月、1月、2月、4月、6月)/不同温度(4℃、-20℃)抽取的标准样品的拷贝数浓度。对各靶标的平均值数据进行T检验，通过检测标准样品拷贝数浓度随时间变化情况，考察其长期稳定性。结果如表6所示。

表6、长期稳定性检验结果

目前长期稳定性考察时间为12个月，稳定性评估基本模型为Y＝β₀+β₁X。通过数据分析显示在4℃和-20℃下，|β₁|＜t_0.95，n-2s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。因此可判定质粒DNA标准物质在12个月内均处于稳定状态。

2、短期稳定性检验

短期稳定性检验旨在考察标准样品的运输稳定性。本批质粒标准样品是质粒DNA溶液，在运输过程中通常采用冷链运输。经长期稳定性检验，标准样品在4℃条件下具有良好的稳定性，因此在冷链运输条件下，可以保证标准样品的量值稳定性。

3、稳定性不确定度评估

＝6个月的长期稳定性不确定度＝14582*6＝87492，为3.355E+06，u_rel(S)为0.026。拷贝数比值稳定性的不确定度贡献采用公式：u_s＝s(β₁)·X。-20℃条件下，有效期t。

实施例5、标准样品定值及不确定度评定

1、定值方法及结果

实施例2制备得到的标准样品由一家实验室采用数字PCR方法进行定值。在质粒标准样品混匀过程中，每隔一段时间从上中下3个不同部位取样，每个部位取3个子样，共取9个子样，用微滴数字PCR进行拷贝数浓度测定。根据数字PCR对质粒拷贝数浓度测量结果，当混匀时间超过24小时后，质粒DNA完全混匀。取24h和32h测量结果的平均值作为质粒DNA的浓度值。质粒DNA的浓度为3.217E+06，SD值为4.382E+04，RSD值为0.0136。

2、不确定度评价

标准样品定值的不确定度由三个部分组成，第一部分是标准物质定值过程带来的不确定度u_c；第二部分是物质不均匀性所引起的标准不确定度u_bb；第三部分是物质在有效期内的不稳定性所引起的标准不确定度u_s。

合成相对标准不确定度为：

基因组DNA标准物质拷贝数浓度值的相对扩展不确定度为：U_rel＝2×0.031＝0.062(k＝2，置信概率95％)，扩展不确定度U＝0.062×3.217E+06＝2.0×10⁵。

3、定值结果表示

根据步骤2，实施例2制备得到的标准样品的量值及不确定度为(3.22±0.20)×10⁶copies/μL。

实施例6、标准样品的协同定值

实施例2制备得到的标准样品经8家具备检测条件的不同实验室进行协同定值验证，验证方法采用数字PCR的方法(具体使用表4所示元件305423的引物组合进行)，10种外源元件组合质粒标准样品相关基因扩增均为阳性，质粒拷贝数均在2×10⁶以上，与实施例5的检测结果相一致，表明实施例2制备得到的标准样品可用于10种外源元件日常检测中的质量控制、检测试剂的验证和评价，实验室能力验证活动。

上述数字PCR的方法的扩增体系如表7和扩增程序如表8所示。

表7、10种外源元件组合质粒标准样品协同定值数字PCR扩增体系

体系组分	上样量/μL	终浓度
			2×数字PCR扩增预混液	11	1×
上游引物(10μmol/L)	1.1	0.5μmol/L
			下游引物(10μmol/L)	1.1	0.5μmol/L
探针(10μmol/L)	0.55	0.25μmol/L
			模板(质粒标准样品)	2.2
ddH<sub>2</sub>O	6.05
			总体积	22

表8、10种外源元件组合质粒标准样品协同定值数字PCR扩增程序

实施例7、标准样品在检测转基因成分中的应用

待测样品：取转基因品种如表9所示，提取待测样品的基因组DNA；

检测方法：

模板为待测样品的基因组DNA，以非转基因的相应植物的基因组DNA为阴性对照，以实施例2制备得到的质粒标准样品为阳性对照；

同一模板分别使用表4所示15种引物组合进行实时荧光PCR检测(按照实施例3步骤2的方法进行)，

若待测样品的基因组DNA的PCR扩增结果中含有所述阳性对照的PCR扩增结果中一种以上的PCR产物(如表4所示)，则判断待测样品中含有转基因成分，否则判断待测样品中不含有转基因成分。

结果：如表9所示，检测结果与实际情况完全相符，说明实施例2制备得到的质粒标准样品和实施例3步骤2的方法可以用于转基因成分检测。

表9、待测样品的检测结果

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种检测转基因成分的DNA标准样品及其应用

<130> JH-CNP190132

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcttgtacca tttgttgtgc ttgtaattta ctgtgttttt tattcggttt tcgctatcga 60

actgtgaaat ggaaatggat ggagaagagt taatgaatga tatggtcctt ttgttcattc 120

tca 123

<210> 2

<211> 193

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 60

tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 120

tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 180

cgatagaaaa caa 193

<210> 3

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 60

gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta 120

agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cc 162

<210> 4

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagaggaga ccagttgaga ttaggccagc tacagcagct gatatggccg cggtttgtga 60

tatcgttaac cattacattg agacgtctac agtgaacttt aggacagagc cacaaacacc 120

acaagagtgg attgatgatc tagagaggtt gcaagataga tacccttggt tggttgc 177

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacttgtcca tcttctggat tggccaactt aattaatgta tgaaataaaa ggatgcacac 60

atagtgacat gctaatcact ataatgtggg catcaaagtt gtgtg 105

<210> 6

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccactccacc atcacacaat ttcactcata gataacgata agattcatgg aattatcttc 60

cacgtggcat tattccagcg gttcaagccg ataagggtct caacacctct cc 112

<210> 7

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggtttctt atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata agaaccctaa tttcccttat 60

cgggaaacta ctcacacatt atttatggag aaaatagaga gatgatagat ttgtagagag 120

agactggtga 130

<210> 8

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cacgaaccat tgagttacaa tcaacagcac cgtaccttga agcggaatac aatgaaggtt 60

agctacgatt tacagcaaag ccagaataca atgaacca 98

<210> 9

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtgttctct ttttggctag ctagtgtttt tttctcgact tttgtatgaa aatcatttgt 60

gtcaatagtt tgtgttatgt attcattggt cac 93

<210> 10

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgttgagctt taagacgttt ggggaagctg tcccatgccc atcaaagaag acagtacacg 60

atccgagcta cgaatgggta ggcccaataa ggcgagaagg gccac 105

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgagaatgaa caaaaggacc atatca 26

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tttttattcg gttttcgcta tcg 23

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcattaactc ttctccatcc atttccattt cacagt 36

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcttgtacca tttgttgtgc ttgt 24

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggaccatatc attcattaac tcttctcc 28

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cggttttcgc tatcgaactg tgaaatggaa atgg 34

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catgtaatgc atgacgttat ttatg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttgttttcta tcgcgtatta aatgt 25

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgggttttt atgattagag tcccgcaa 28

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atcgttcaaa catttggca 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

attgcgggac tctaatcata 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catcgcaaga ccggcaacag g 21

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gcctctgccg acagtggt 18

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aagacgtggt tggaacgtct tc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

caaagatgga cccccaccca cg 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ttccaaccac gtcttcaaag c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaagggtct tgcgaaggat a 21

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccactgacgt aagggatgac gcacaatcc 29

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

agttgagatt aggccagcta 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gcaaccaacc aagggtatc 19

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tggccgcggt ttgtgatatc gttaa 25

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggagaggaga ccagttgaga ttag 24

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gtgtttgtgg ctctgtccta aag 23

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atcacaaacc gcggccatat cagctgc 27

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gacttgtcca tcttctggat tgg 23

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cacacaactt tgatgcccac at 22

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agtgattagc atgtcactat gtgtgcatcc 30

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

ccactccacc atcacacaat ttc 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggagaggtgt tgagaccctt atc 23

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

acgtggcatt attccagcgg ttcaagcc 28

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ggggtttctt atatgctcaa cacatg 26

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tcaccagtct ctctctacaa atctatcat 29

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

aaaccctata agaaccctaa ttcccttatc tggga 35

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tcaccagtct ctctctacaa atctatc 27

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

caacacatga gcgaaaccct ataa 24

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tgtgtgagta gtttcccgat aagggaaatt agggt 35

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cacgaaccat tgagttacaa tc 22

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tggttcattg tattctggct ttg 23

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

cgtagctaac cttcattgta ttccg 25

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cgtgttctct ttttggctag c 21

<210> 51

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gtgaccaatg aatacataac acaaacta 28

<210> 52

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tgacacaaat gattttcata caaaagtcga ga 32

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

cgttgagctt taagacgttt gg 22

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gtggcccttc tcgccttat 19

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

agctgtccca tgcccatcaa agaagacagt 30

<210> 56

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tcttgtacca tttgttgtgc ttgtaattta ctgtgttttt tattcggttt tcgctatcga 60

actgtgaaat ggaaatggat ggagaagagt taatgaatga tatggtcctt ttgttcattc 120

tcaatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 180

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 240

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 300

acgcgataga aaacaagcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 360

gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 420

tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttccgg 480

agaggagacc agttgagatt aggccagcta cagcagctga tatggccgcg gtttgtgata 540

tcgttaacca ttacattgag acgtctacag tgaactttag gacagagcca caaacaccac 600

aagagtggat tgatgatcta gagaggttgc aagatagata cccttggttg gttgcgactt 660

gtccatcttc tggattggcc aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt 720

gacatgctaa tcactataat gtgggcatca aagttgtgtg ccactccacc atcacacaat 780

ttcactcata gataacgata agattcatgg aattatcttc cacgtggcat tattccagcg 840

gttcaagccg ataagggtct caacacctct ccggggtttc ttatatgctc aacacatgag 900

cgaaacccta taagaaccct aatttccctt atcgggaaac tactcacaca ttatttatgg 960

agaaaataga gagatgatag atttgtagag agagactggt gacacgaacc attgagttac 1020

aatcaacagc accgtacctt gaagcggaat acaatgaagg ttagctacga tttacagcaa 1080

agccagaata caatgaacca cgtgttctct ttttggctag ctagtgtttt tttctcgact 1140

tttgtatgaa aatcatttgt gtcaatagtt tgtgttatgt attcattggt caccgttgag 1200

ctttaagacg tttggggaag ctgtcccatg cccatcaaag aagacagtac acgatccgag 1260

ctacgaatgg gtaggcccaa taaggcgaga agggccac 1298

Claims

1.一种检测转基因成分的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品包括SEQ IDNo.1—7所示DNA片段。

2.如权利要求1所述的DNA标准样品，其特征在于：所述SEQ ID No.1—7所示DNA片段按照SEQ ID No.1—7的顺序依次连接。

3.如权利要求1或2所述的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品中还包括SEQID No.8—10所示DNA片段；

优选的，所述SEQ ID No.8—10所示DNA片段按照SEQ ID No.8—10的顺序依次连接。

4.如权利要求3所述的DNA标准样品，其特征在于：所述DNA标准样品中所述SEQ IDNo.1—7所示DNA片段和所述SEQ ID No.8—10所示DNA片段连接后的序列如SEQ ID No.56所示。

5.包含权利要求1—4中任一所述的DNA标准样品的重组载体，优选的，所述重组载体的骨架载体选自pUC18、pUC19、pUC57中的一种或多种，更优选，pUC57，更优选，将所述DNA标准样品连接于pUC57平端酶EcoRV的酶切位点处。

6.一种检测转基因成分的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1—4中任一所述DNA标准样品或权利要求5所述重组载体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括分别检测SEQ IDNo.1—7所示DNA片段的引物组合；

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测SEQ ID No.1所示DNA片段的引物组合为引物组合1和/或引物组合2，

所述检测SEQ ID No.5所示DNA片段的引物组合为引物组合9，

所述检测SEQ ID No.6所示DNA片段的引物组合为引物组合10，

所述检测SEQ ID No.8所示DNA片段的引物组合为引物组合13，

所述检测SEQ ID No.9所示DNA片段的引物组合为引物组合14，

所述检测SEQ ID No.10所示DNA片段的引物组合为引物组合15，

9.权利要求1—4中任一所述DNA标准样品、权利要求5所述重组载体或权利要求6—8中任一所述试剂盒在检测转基因成分中的应用；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；

所述转基因植物包括但不限于如下植物：玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿、和/或水稻。

10.一种检测转基因成分的PCR方法，其特征在于：所述方法包括利用权利要求1—4中任一所述DNA标准样品或权利要求5所述的重组载体为阳性对照进行PCR的步骤；

优选的，所述PCR使用权利要求6—8中任一所述试剂盒进行；

优选的，所述转基因成分来源于转基因植物和/或其加工品；