KR101820048B1 - 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자변형 식물체의 검정을 위한 표준 플라스미드 및 표준 플라스미드를 이용한 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법 및 표준 플라스미드를 포함한 유전자변형 식물체 정량 분석용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의한 표준 플라스미드는 cry3Bb1 유전자를 함유한 유전체의 검정에 활용이 가능하며, 특히 옥수수 MON863과 같은 품종에 대한 혼입여부 또는 혼입률을 분석할 수 있는 표준물질로서 매우 유용하다.

Description

유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트{STANDARD PLASMID FOR DETECTING OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME}

본 발명은 유전자변형 식물체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 특히 cry3Bb1 유전자를 함유하고 있는 유전자변형 식물체의 검정을 위한 표준 플라스미드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 이용한 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법 및 상기 표준 플라스미드를 포함한 유전자변형 식물체 검정용 키트에 관한 것이다.

유전자변형 식품은 GMO(Genetically Modified Organism, 유전자 변형체)에서 유래한 식품 산물로 식품의 저장수명, 영양소 함량, 색상, 풍미, 식감을 향상시키고자 하는 최신 기술의 산물이다. GMO란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가되도록 한 생물체를 총칭하는 것으로, 즉 전통적인 교배나 자연적인 재조합을 통해서가 아니라 현대 생명공학 기술을 이용하여 기준 생물체의 유전물질에 외부 유래 유전자를 삽입함으로써 새로운 유전형질을 획득하게 된 생물체를 말한다. 그리고 유전자재조합 식품은 이러한 유전자 변형체를 원료로 제조된 식품을 말한다.

일반적으로 유전자변형 농산물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다. 오늘날 시장에는 많은 GMO 식품이 유통되고 있으며, 그 중 높은 비중을 차지하는 것은‘대두(soybean)’이며, 그 외에도 옥수수, 파파야, 호박 등 종류가 다양하다. 한편, 현재 GMO의 인체 유해성 관련 논란이 있어 전 세계적으로 GMO에 대한 소비자와 농민들의 우려가 높아지고 있다. 이에 따라 유전자변형 작물의 상업화를 위해서는 환경 위해성, 인체 및 식품안정성 평가가 요구되고 있으며, 유전자변형 농산물을 수입하는 관련 국가에서는 GMO 의무 표시제를 포함한 규제제도를 수립하고 있다. 우리나라의 경우 유전자변형 식물이 3%이상 혼입된 경우 유전자변형 식물이라고 표기하도록 하는 표시제를 시행하고 있고, 다른 나라들도 혼입허용치의 차이는 있으나 비슷한 실정이다. 따라서 GMO의 혼입 여부를 측정하는 정성적인 분석법 이외에도, 혼입률을 정량적으로 측정하는 정확한 분석기술을 요구하게 되었다.

GMO의 정량 분석법은 크게 단백질 분석법과 DNA 분석법 두 가지로 분류된다. 일반적으로 유전자변형 식물에 도입된 유전자로부터 발현되는 단백질을 대상으로 하는 ELISA법은 검출강도가 PCR법에 비해 떨어지며 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있어 한계가 있다. 이에 유전자의 증폭과 함께 증폭산물의 양을 정량적으로 모니터링해주는 실시간 PCR(Real-Time PCR)법을 이용하여 유전자변형 식물에 도입된 유전자를 정량하는 기술이 현재 주로 이용되고 있다. 정성 PCR에 필요한 프라이머 세트 외에도 형광 프로브(probe)를 사용하고 CRM(인증표준물질)이나 표준 플라스미드를 표준물질로 사용하여 실시간 PCR법으로 표준물질에 대하여 내재유전자와 외래유전자의 비율로서 데이터를 얻을 수 있다.

GMO 표시제의 시행에 따라 유전자변형식물의 혼입허용치에 대한 분석의 정확도, 정밀성 등이 매우 중요해졌으며, 혼입허용치에 대한 정확하고 정밀한 분석을 위해서는 무엇보다 분석에 사용한 표준물질이 매우 중요하다. 표준물질은 장기간 보존 가능성과 그 자체의 안정성(stability) 및 균질성(homogeneity)도 보장되어야 한다.

현재 표준물질로는 재래적인 방식에 의거하여 각 작물 별 유전자변형식물 및 유전자비변형식물(non-GMO)의 종자 분쇄물을 일정량씩 중량에 따라 혼합하여 만든 표준물질 또는 유전자변형식물 및 유전자비변형식물이 일정량 혼입된 시료로부터 추출한 내재유전자 및 도입유전자의 앰플리콘(amplicon)을 삽입하여 만든 표준플라스미드가 사용되고 있다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 표준 플라스미드를 이용하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합된 유전자 MON863 옥수수의 양을 측정하여 GM옥수수 정성 및 정량 분석용 플라스미드 DNA 표준물질 개발하고, 표준 플라스미드를 포함하는 유전자 변형체 검정용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명은 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드를 제공하며, 보다 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 유전자는 ssIIb 유전자이고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자는 cry3Bb1 유전자이다.

상기 ssIIb 유전자는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 cry3Bb1 유전자는 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 ssIIb 유전자는 식물체의 내재 유전자이고, 상기 cry3Bb1 유전자는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 ssIIb 유전자는 옥수수의 내재 유전자로 전분합성효소 starch synthase IIb (ssIIb) 유전자이다. 본 발명에서는 옥수수의 내재 유전자로 ssIIb를 선택하여 사용하였으며, 식품의약품안전처에서도 유전자재조합 옥수수의 공인검사법으로서 내재 유전자로 ssIIb를 사용하도록 권장하고 있다. 상기 cry3Bb1 유전자는 Bacillus thuringiensis subsp . Kumamotoensis (B.t.k.) 유래로, Cry3Bb1 delta-endotoxin 단백질을 발현하는 유전자이다.

본 발명의 일 구체예는 상기 cry3Bb1 유전자가 5′ 영역의 인접서열(5′ flanking sequence) 및 3′ 영역의 인접서열(3′ flanking sequence)을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드를 제공하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어, "유전자변형 식물체"란 특정 생물로부터 유용한 유전자를 취해 이를 기존의 생물체에 도입함으로써 그 유전자 기능을 발휘하도록 조작한 생물체를 말하는 유전자변형 생물체(genetically modified organism, GMO)의 하위개념에 속한다. 즉, 유전자변형 생물체 중 식물에 해당하는 경우를 유전자변형 식물체라고 할 수 있다.

본 발명에 따른 표준 플라스미드의 검정 대상인 상기 유전자변형 식물체는 옥수수 MON863 품종일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 "옥수수 MON863"은 Monsanto, USA가 유전자재조합 기술을 이용하여 개발된 해충저항성을 가지는 옥수수로, PV-ZMIRI13을 이용하여 2개의 유전자인 cry3Bb1과 nptII를 삽입하여 옥수수 뿌리벌레 등 초시목 (Coleopteran) 해충에 저항성을 나타내도록 변형된 것이다. cry3Bb1은 Bacillus thuringiensis subsp . Kumamotoensis (B.t.k) 유래로, Cry3Bb1 delata-endotoxin 단백질을 발현함으로서 옥수수 뿌리벌레를 포함한 딱정벌레목(Coleopteran) 곤충에 저항성을 나타내는 유전자이다. 이와 같이 옥수수 MON863 품종은 cry3Bb1 유전자를 함유하고 있어, 본 발명의 표준 플라스미드를 이용한 정량분석의 유전자 변형체로서 적합하다. 다만, 반드시 이에 한정될 필요는 없으며, cry3Bb1 유전자를 함유하고 있는 어떠한 유전자 변형체도 본 발명에 따른 검정 대상이 될 수 있음은 자명하다.

상기 표준 플라스미드는 도 1의 개열지도를 가지는 pBlunt-11kbMS인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 pBlunt-11kbMS 플라스미드는 본 발명에 따른 유전자 변형체의 유전자 혼입률을 산출하는 정량적 검정방법을 위한 표준 플라스미드로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 표준 플라스미드는 옥수수의 내재 유전자(ssIIb) 및 GM 유전자(cry3Bb1)에 대한 PCR 산물을 연결하여 이를 pCR-Blunt 벡터(미국 Invitrogen사)에 삽입하여 표준 플라스미드를 제작하였다(pBlunt-11bMS). 구체적으로, 서열번호 6 및 7의 프라이머 세트에 의해 증폭된 cry3Bb1 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, 이를 pCR-Blunt 벡터에 삽입하였다. 이후, ssIIb 삽입 유전자를 확보하기 위해, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트에 의해 증폭된 ssIIb 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, pCR-Blunt 벡터에 Zero PCR cloning 키트(미국 Invitrogen사)를 사용하여 표준 플라스미드 pBlunt-11kbMS를 제작하였다.

또한, 본 발명의 표준 플라스미드를 이용하여 유전자변형 식물체의 이벤트(event)를 판별할 수 있다. 동일한 변형유전자라도 염색체에 그 유전자가 삽입된 위치가 다르면, 그러한 품종마다 하나의 "이벤트(event)"라고 한다. 따라서 본 발명의 표준 플라스미드는 유전자 변형체의 품종 뿐만 아니라 유전자 변형체의 다수 이벤트를 검정할 수 있게 하기 때문에, GMO 검출용 표준물질로서 더욱 적합하다.

또한, 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 이용하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 정량 분석방법은

ⅰ) 상기 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;

ⅱ) 상기 농도별로 희석한 표준 플라스미드와 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 각각 주형으로 해서 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;

ⅲ) 상기 희석한 표준 플라스미드를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량 곡선을 산출하는 단계; 및

ⅳ) 상기 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량 곡선에 도입하여 외래 도입 유전자의 혼입률을 산출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "PCR(Polymerase Chain Reaction)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로, 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "실시간 PCR(real-time PCR)"이란 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCRMethods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질 및 3'-말단에 퀀처(예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프로브를 이용한다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다.

TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.

TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 실시간 PCR을 이용할 경우, 내재 유전자 및 도입 유전자의 DNA에 특이적으로 결합하는 양방향 프라이머와 검출용 프로브를 이용하여 PCR 증폭과정에서 발색되는 형광의 양을 측정함으로써 내재 및 도입 유전자의 양을 산출할 수 있다. 즉, 상기 정량 분석방법은 해당 품종의 식물이 반드시 가지고 있는 내재 유전자에 대한 외래 도입 유전자의 상대적인 비율을 통하여 유전자변형 식물이 몇 % 함유되어 있는지를 분석해내는 방법이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 표준물질을 검출용 프로브와 도입 유전자 검출용 프라이머 및 내재 유전자 검출용 프라이머로 실시간 PCR하여 형광을 측정함으로써 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 나타내는 표준곡선을 산출하고 이를 분석시료로부터 얻은 실시간 PCR 산물과 비교함으로써 유전자변형 식물의 시료 내 혼입률을 분석할 수 있다.

바람직하게, 상기 정량 분석방법에서 ⅱ) 단계의 상기 PCR 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 5 및 8의 염기서열로 이루어지는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 ssIIb 유전자를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 cry3Bb1 유전자를 특이적으로 검출하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 프로브는 ssIIb 유전자 검출용 프로브일 수 있다.

상기 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 프로브는 cry3Bb1 유전자 검출용 프로브일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "프로브"는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함하는 단일쇄 핵산 분자이다. 상기 본 발명에서 사용된 프로브는 실시간 PCR 수행시 정량분석을 위해 형광물질이 염기서열에 도입되어 있는 검출용 프로브를 의미한다. 검출용 프로브의 종류는 내재 유전자 및 도입 유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

상기 정량 분석방법의 ⅲ) 단계에서 표준 정량 곡선은 표준 플라스미드 DNA를 소정의 비율로 희석하여 서로 다른 유전자 카피수를 갖는 복수개의 표준시료에 대해 실시간 PCR을 수행하고 이로부터 얻은 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 적용하여 산출될 수 있다. 구체적으로, 혼입률을 알고 있는 표준물질의 DNA를 적절히 희석하여 카피수를 일정한 간격으로 만들거나, 유전자변형 식물과 유전자비변형 식물의 DNA를 소정비율로 혼합하여 일정한 혼입률을 갖도록 제조한 수개의 시료에 대해 실시간 PCR을 수행하면, PCR 사이클수에 따른 형광의 정도를 측정할 수 있다. 이때 표준액의 형광시그널이 지수함수적으로 증폭하고 있는 부위를 선택하여 Threshold line(Th. line)을 설정하고, 설정된 Th. line과 표준액의 증폭 곡선이 교차하는 점의 사이클수를 Ct(threshold cycle)라고 하는데, 이 값은 시료의 초기농도(유전자 카피수)와 가장 재현성 있는 상관관계를 나타내는 시점으로서, 실시간 PCR을 이용한 정량적인 분석에 있어서 가장 중요한 수치이다. 실시간 PCR에서 표준곡선은 Ct 값에서의 표준물질의 유전자 카피수를 로그(log)값으로 환산한 값을 X축, 상기 유전자 카피수에 대한 PCR 사이클수를 Y축으로 하여 작성한다. 이후 분석시료의 형광량을 이 표준곡선에 적용하면 분석시료의 유전자 카피수를 알 수 있다.

상기 정량 분석방법에서 유전자변형 식물체는 옥수수 MON863 품종인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공한다.

상기 검정용 키트의 대상인 유전자변형 식물체는 MON863 품종의 유전자변형 옥수수인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 상기 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공함으로써, cry3Bb1 유전자를 함유하는 유전자변형 식물체 검정을 위해 실시간 PCR에 의한 정량분석을 가능하게 한다.

상기 키트는 전사, 증폭, 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 전사효소, 데옥시뉴클레오티드, DNA 증폭 반응에 적합한 열 안정성 폴리머라제 및 핵산의 표지화 및 검출용 시약을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트를 제공한다.

본 발명의 표준 플라스미드는 T7 프로모터를 포함하고 있으며, 표준 플라스미드에 도입된 외래 유전자인 cry3Bb1 유전자 및 내재 유전자인 ssIIb 유전자가 T7 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서 적당한 단백질의 발현환경에서 본 발명의 표준 플라스미드로부터 Cry3Bb1 단백질 및 SsIIb 단백질이 발현될 수 있다. 이러한 상기 발현된 단백질들을 표준 단백질로 하여, ELISA(Enyzme Linked Immunusorbent Assay) 방법 등을 이용하여 정량분석 또는 정성분석에 이용할 수 있다.

상기 검정용 키트의 대상인 유전자변형 식물체는 MON863 품종의 유전자변형 옥수수인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 의한 표준 플라스미드는 cry3Bb1 유전자를 함유한 유전체의 검정에 활용이 가능하며, 이에 따라 유전자변형 식물체의 품종 또는 이벤트를 판별할 수 있다. 특히 옥수수 MON863과 같은 품종에 대한 혼입여부 또는 혼입률을 분석할 수 있는 표준물질로서 매우 유용하다. 따라서 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 유전자 변형체인 옥수수 MON863에 대한 정확하고 신뢰도가 개선된 정량분석 방법 및 검출용 키트를 제공할 수 있으며, 유전자 변형체의 혼입률을 정확하게 검출하는데 매우 적합하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구체예에 따른 표준 플라스미드의 구성도이다.
도 2는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA의 농도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 만들기 위해 벡터에 삽입(insertion)된 유전자를 확인하기 위한 전기영동 사진이다. (M: 분자량 마커, 1,2 : 11kbMS pDNA, UC: 플라스미드 DNA, C: enzyme으로 cutting한 플라스미드 DNA로 insert확인)
도 4는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA의 형광측정 값을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하여 균질함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하여 단기 안정함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 표준 플라스미드 DNA를 사용하여 실시간 정량 PCR을 수행하여 장기 안정함을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8의 (a)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 미지의 시료의 내재 유전자에 대한 정량 분석을 한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 및 미지시료의 내재 유전자에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 9의 (a)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드를 이용하여 미지의 시료의 도입 유전자에 대한 정량 분석을 한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 본 발명에 따른 표준 플라스미드 및 미지시료의 도입 유전자에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

1. 표준 플라스미드 제작

표준 플라스미드는 옥수수의 내재 유전자(ssIIb, 서열번호 1) 및 GM 유전자(cry3Bb1, 서열번호 2)에 대한 PCR 산물을 연결하여 이를 pCR-Blunt 벡터(미국 Invitrogen사)에 삽입한 표준 플라스미드를 제작하였다(pBlunt-11kbMS, 도 1).

구체적으로 먼저 full gene(flanking region 존재)의 삽입 유전자를 확보하기 위해, 정방향 프라이머(MON863-5', 서열번호 6)와 역방향 프라이머(MON863-3', 서열번호 7)에 의해 증폭된 cry3Bb1 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, 이를 pCR-Blunt 벡터에 삽입하였다. 이후, ssIIb 삽입 유전자를 확보하기 위해, ssIIb 정방향 프라이머(ssIIb 1-5', 서열번호 3)와 역방향 프라이머(ssIIb 1-3', 서열번호 4)에 의해 증폭된 ssIIb 유전자의 PCR 산물을 얻은 후, pCR-Blunt 벡터에 Zero PCR cloning 키트(미국 Invitrogen사)를 사용하여 표준 플라스미드 pBlunt-11kbMS를 제작하였다.

재조합된 플라스미드 pBlunt-11kbMS는 E. coli 균주 TOP10 세포에 도입하여 형질전환시킨 후, LB 배지에서 cell culture하여 다량확보하였다.

서열번호	프라이머/프로브 종류	프라이머/프로브 염기서열
3	ssIIb 1-5'	5'- CTCCCAATCCTTTGACATCTGC -3'
4	ssIIb 1-3'	5'- TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG -3'
5	ssIIb-taq	5'FAM- AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA -TAMRA3'
6	MON863-5'	5'- GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC -3'
7	MON863-3'	5'- TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT -3'
8	MON863-taq	5'FAM- TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA -TAMRA3'

2. 플라스미드 DNA 추출

실시예 1에서 다량확보한 cell에서 plasmid maxi 키트 (Qiagen사)를 사용해 제조사가 제안하는 방법을 그대로 또는 약간 변형시켜 사용하여 플라스미드 DNA(pDNA)를 추출하였다.

구체적으로, 배양한 cell을 4℃에서 15분간 6000g 로 원심분리하여 수확한 후, 수확된 cell pellet에 10ml 버퍼 P1을 넣고 재부유시켰다. 이후 10ml Buffer P2를 첨가한 후 4-6번 아래 위를 뒤집어서(inverting) 섞어준 후, 5분 동안 상온(15-25℃)에 방치한 후 10ml Buffer P3을 첨가한 후 4-6번 아래 위를 뒤집어서(inverting) 섞어준 후 20분간 ice에 놓아 두었다. 다음 4℃에서 30분간 20000g 이상에서 상층액을 원심분리시켰다(상층액이 깨끗하지 않다면, 추가로 원심분리를 한다). Qiagen-tip에 10ml Buffer QBT를 중력으로 통과시켜 Equilibrate시킨 다음, Qiagen-tip에 step 5로부터의 상층액을 통과시킨 후, 30ml Buffer QC로 Qiagen-tip을 두번 정도 워싱해 주었다. 50ml tube에 15ml Buffer QF를 넣어 DNA를 분리시켰다. 10.5ml 이소프로판올을 첨가하여 분리된 DNA를 4℃에서 30분간 ≥15000g 침전시킨 후, 상층액은 버렸다. 침전물을 5ml 상온의 70% 에탄올로 DNA pellet을 워싱하고 10분간 ≥15000g 에서 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 버렸다. 5-10분간 pellet을 자연 건조시킨 후 적절한 부피의 버퍼(e.g. TE buffer, pH 8.0, 10mM Tris, pH8.5)로 녹여서 최종적으로 추출된 플라스미드 DNA(pDNA)를 준비하였다.

3. 플라스미드 DNA의 농도, 삽입 유전자 및 오염도 확인

추출된 플라스미드 DNA의 질적인 평가와 정량을 위해 흡광도 측정과 피코그린(picogreen)을 이용한 형광측정법을 수행하였다. DNA 용액은 자외선 흡광도를 측정한 결과, 260 nm 근방에서 peak을 보이는 전형적인 DNA의 UV 흡광도 스펙트럼을 나타냈다 (도 2 및 표 2 참조).

표준 플라스미드 DNA(pDNA) 내 삽입 된 ssIIb 유전자 확인을 위해 제한효소를 처리하여 인서트(insert)를 분리한 뒤 전기영동을 통해 확인하였다 (도 3). 전기영동 결과 예상 크기(size)인 2890bp의 ssIIb 유전자가 확인되었다[(a) M: 분자량 마커, 1,2: 11kbMS pDNA, (b) M: 분자량 마커, control: 11kbMS pDNA (uncut), 1: enzyme으로 cutting 된 pDNA 8866bp, 2: insert 2890bp].

또한 추출된 플라스미드 DNA는 단백질 등 불순물이 적은 양질의 시료로 판단되었다. DNA 용액 내의 단백질 오염도는 다음과 같이 알아볼 수 있다. 260 nm의 흡광도를 280 nm에서의 흡광도로 나누어 1.7부터 2.0 사이의 값을 얻으면 단백질 오염이 적은 양질의 DNA로 판단하게 되는데 본 실험에 사용한 모든 DNA 시료는 이 사이의 값을 가져서 실험에 적합한 시료로 판단되었다. 이외에 260 nm의 흡광도를 230 nm에서의 흡광도로 나누어 DNA 용액 내의 당(예: 식물조직을 이루고 있는 다당류 등)의 오염도를 알아볼 수 있다. 0.8 이상의 값을 얻으면 양질의 DNA로 판단하게 되는데, 본 실험에 사용한 모든 DNA 시료는 0.8 이상의 값을 나타내어 당의 오염이 적은 다음 단계의 실험을 진행해도 되는 양질의 시료로 판단되었다(표 2 참조).

tube	11kbMS pDNA
원액 농도(ng/ul)	124.27
1/10 dilution 농도(ng/ul)	12.21
230	1.123
260	2.485
280	1.29
단백질혼입(260/280)	1.93
탄수화물 혼입(260/230)	2.21

상기 플라스미드 DNA의 농도를 확인하기 위해, ds-DNA(double strand DNA)에 특이적으로 결합하는 형광 염료인 Pico Green^TM (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용한 ds-DNA의 농도를 측정하는 방법을 이용하여 용액 내의 DNA 양을 결정하였다.구체적으로, kit 내에 구비된, 이미 농도가 결정된 lambda DNA calibrator를 사용하여 형광값에 대한 검량선(calibration curve)을 얻고, 시료의 형광값을 검량선에 대입함으로써 DNA의 농도를 결정하였다(도 4). 그 결과 추출한 플라스미드 DNA는 질적으로 순도가 적합하고, 양적으로 충분한 농도가 되어 다음 단계에 사용하였다.

4. 표준 플라스미드 stock 제조

형광정량을 통해 플라스미드 DNA의 농도를 구한 후, 알고 있는 플라스미드 DNA size(base pair, bp)를 아래의 계산식에 대입하여 카피수(Number of copies)를 계산한 다음, 최종 표준 플라스미드 stock의 플라스미드 DNA의 농도가 4.00 X 10⁸cp/㎕가 될 수 있도록, 10mM Tris로 희석하였다.

Number of copies(cp/ul) = amount ×6.022 ×10²³/ 플라스미드 DNA size(bp) × 1 ×10⁹ ×650

클린 벤치내에서 여과하여 불순물을 제거한 후 약 450개의 cryo tube(Nunc사)에 각각 50 ul씩 분주하였다.

예상한 카피수와 일치하는지 알아보기 위해 실시간 PCR법을 사용하여 예비 테스트를 하였다. 본 실험예에서는 ABI 7900HT (미국 Applied Biosystems사)를 사용하여 모든 실험을 수행하였으며 실험의 기본적인 디자인 및 프라이머, 프로브 등의 실험 구성요소는 식품의약안전처의 규격에 나온 내용을 취하여 사용하였다.

5. 표준 플라스미드의 균질성 확인

총 450여개의 tube에 분주한 시료 중 일정한 간격으로 10개의 tube를 선정해서 tube간 균질성을 확인하는 절차를 거쳤다.

병간 균질성을 점검하고자 분석한 10개 tube에 있는 플라스미드 DNA의 transgene: endogene(GM 유전자:내재 유전자)의 비를 측정하였다(transgene과 endogene은 각 1:1로 재조합). 측정한 결과 이들의 측정값은 0.930~0.955 사이였으며 평균치는 0.945 ± 0.008였다(도 5 참조).

6. 표준 플라스미드의 안정성 확인

안정성 확인 실험과 관련하여, 시료의 운반시 안정한지를 확인하기 위한 것으로 네개의 온도(-20 ℃, 4 ℃, 상온, 60 ℃)에서 일정한 시간 간격(2주, 4주)으로 각 3개 tube의 시료를 분석하여 두 유전자의 비율에 변화가 있는지 살펴보았다.

단기 안정성을 점검하고자 분석한 시료의 도입 유전자(transgene) : 내재 유전자(endogene)의 비율의 측정값은 0.953±0.004(0 time), 0.963±0.003(2 weeks, -20 ℃), 0.955±0.006(4 weeks, -20 ℃), 0.969±0.001(2 weeks, 4 ℃), 0.964±0.005(4 weeks, 4 ℃), 0.953±0.002(2 weeks, 상온), 0.950±0.003(4 weeks, 상온), 0.956±0.010(2 weeks, 60 ℃)로, 4주간 -20 ℃, 4 ℃, 상온에서 GM 유전자와 내재 유전자 비율이 균질성 실험 결과와 유사하게 나타나, 상기의 온도에서 시료가 안정함을 확인할 수 있었고, 장기 안정성 실험의 경우는 보관기간 6개월, 12개월, -70 ℃와 -20 ℃ 두 보관 온도에서 실시하여 0.975±0.004(6 months, -20 ℃), 0.973±0.003(12 months, -20 ℃), 0.956±0.004(6 months, -70 ℃), 0.955±0.007(12 months, -70 ℃)로, 시료의 GM %가 균질성 및 단기 안정성이 확보된 시료의 분석 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 이를 근거로, 보관한 저온 -70 ℃, -20 ℃ 모두에서 해당 시료가 안정함을 알 수 있었고 -20 ℃ 이하에서 12개월까지 장기 보관이 가능하다고 판단 되어진다(도 6 및 도 7 참조).

7. 표준 플라스미드를 이용한 정량성 확인

pBlunt-11kbMS 플라스미드를 6단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 하여, 실시간 PCR을 수행, 그 결과를 이용하여 표준 정량 곡선을 산출하고, 미지 시료에 대하여 정량분석을 수행하였다.

그 결과 pBlunt-11kbMS 플라스미드의 상관계수(R＾) 값이 0.9994(ssIIb) 및 0.9977(cry3Bb1)으로 나타나, 그 수치가 0.99 이상으로, 본 발명에 따른 플라스미드가 정량분석을 위한 표준 플라스미드로 이용 가능함을 확인할 수 있었다. 또한 도 8 및 도 9에서 나타낸 바와 같이 미지시료의 도입 유전자(GM)%를 알기 위한 정량분석을 위해 표준 플라스미드로 이용 가능함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아니다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF STANDARDS AND SCIENCE <120> STANDARD PLASMID FOR DETECTING OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME <130> P15R18D0577 <150> KR 10-2014-0079983 <151> 2014-06-27 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2480 <212> DNA <213> ssIIb of Maize <400> 1 gcggccgcct ggtaggcgct ggtacaagcg gaagcagcag tagcgtgagg catccccatg 60 ccgggggcaa tctcttcctc gtcgtcggct tttctcctcc ccgtcgcgtc ctcctcgccg 120 cggcgcaggc ggggcagtgt gggtgctgct ctgcgctcgt acggctacag cggcgcggag 180 ctgcggttgc attgggcgcg gcggggcccg cctcaggatg gagcggcgtc ggtacgcgcc 240 gcagcggcac cggccggggg cgaaagcgag gaggcagcga agagctcctc ctcgtcccag 300 gcgggcgctg ttcagggcag cacggccaag gctgtggatt ctgcttcacc tcccaatcct 360 ttgacatctg ctccgaagca aagtcagagc gctgcaatgc aaaacggaac gagtgggggc 420 agcagcgcga gcaccgccgc gccggtgtcc ggacccaaag ctgatcatcc atcagctcct 480 gtcaccaaga gagaaatcga tgccagtgcg gtgaagccag agcccgcagg tgatgatgct 540 agaccggtgg aaagcatagg catcgctgaa ccggtggatg ctaaggctga tgcagctccg 600 gctacagatg cggcggcgag tgctccttat gacagggagg ataatgaacc tggccctttg 660 gctgggccta atgtgatgaa cgtcgtcgtg gtggcttctg aatgtgctcc tttctgcaag 720 acaggtggcc ttggagatgt cgtgggtgct ttgcctaagg ctctggcgag gagaggacac 780 cgtgttatgg tcgtgatacc aagatatgga gagtatgccg aagcccggga tttaggtgta 840 aggagacgtt acaaggtagc tggacaggat tcagaagtta cttattttca ctcttacatt 900 gatggagttg attttgtatt cgtagaagcc cctcccttcc ggcaccggca caataatatt 960 tatgggggag aaagattgga tattttgaag cgcatgattt tgttctgcaa ggccgctgtt 1020 gaggttccat ggtatgctcc atgtggcggt actgtctatg gtgatggcaa cttagttttc 1080 attgctaatg attggcatac cgcacttctg cctgtctatc taaaggccta ttaccgggac 1140 aatggtttga tgcagtatgc tcgctctgtg cttgtgatac acaacattgc tcatcagggt 1200 cgtggccctg tagacgactt cgtcaatttt gacttgcctg aacactacat cgaccacttc 1260 aaactgtatg acaacattgg tggggatcac agcaacgttt ttgctgcggg gctgaagacg 1320 gcagaccggg tggtgaccgt tagcaatggc tacatgtggg agctgaagac ttcggaaggc 1380 gggtggggcc tccacgacat cataaaccag aacgactgga agctgcaggg catcgtgaac 1440 ggcatcgaca tgagcgagtg gaaccccgct gtggacgtgc acctccactc cgacgactac 1500 accaactaca cgttcgagac gctggacacc ggcaagcggc agtgcaaggc cgccctgcag 1560 cggcagctgg gcctgcaggt ccgcgacgac gtgccactga tcgggttcat cgggcggctg 1620 gaccaccaga agggcgtgga catcatcgcc gacgcgatcc actggatcgc ggggcaggac 1680 gtgcagctcg tgatgctggg caccgggcgg gccgacctgg aggacatgct gcggcggttc 1740 gagtcggagc acagcgacaa ggtgcgcgcg tgggtggggt tctcggtgcc cctggcgcac 1800 cgcatcacgg cgggcgcgga catcctgctg atgccgtcgc ggttcgagcc gtgcgggctg 1860 aaccagctct acgccatggc gtacgggacc gtgcccgtgg tgcacgccgt gggggggctc 1920 cgggacacgg tggcgccgtt cgacccgttc aacgacaccg ggctcgggtg gacgttcgac 1980 cgcgcggagg cgaaccggat gatcgacgcg ctctcgcact gcctcaccac gtaccggaac 2040 tacaaggaga gctggcgcgc ctgcagggcg cgcggcatgg ccgaggacct cagctgggac 2100 cacgccgccg tgctgtatga ggacgtgctc gtcaaggcga agtaccagtg gtgagcgaat 2160 taattggcga cgcgacgccg ctcctgtcgc aggacctgga cgttatttag aaggctcttc 2220 tccctggcgg ctttgatgcg tgcgtcgcat ttgcgccggg cggacgggcg acggtggttg 2280 gcctaccgcc tacgtcggct gcgtgccctg ggaatttggg cgggcacgat gatgccactg 2340 ggcaccgggc gcggggtagt atgatatgaa accgacggcg atggagatga ggcgcatggc 2400 attttcccac tgataaatgg ggagttgtat gctactttaa tatcgccact cctgttagta 2460 tttatattga tggcggccgc 2480 <210> 2 <211> 1650 <212> DNA <213> cry3Bb1 of Maize <400> 2 ccatggccaa ccccaacaat cgctccgagc acgacacgat caaggtcacc cccaactccg 60 agctccagac caaccacaac cagtacccgc tggccgacaa ccccaactcc accctggaag 120 agctgaacta caaggagttc ctgcgcatga ccgaggactc ctccacggag gtcctggaca 180 actccaccgt caaggacgcc gtcgggaccg gcatctccgt cgttgggcag atcctgggcg 240 tcgttggcgt ccccttcgca ggtgctctca cctccttcta ccagtccttc ctgaacacca 300 tctggccctc cgacgccgac ccctggaagg ccttcatggc ccaagtcgaa gtcctgatcg 360 acaagaagat cgaggagtac gccaagtcca aggccctggc cgagctgcaa ggcctgcaaa 420 acaacttcga ggactacgtc aacgcgctga actcctggaa gaagacgcct ctgtccctgc 480 gctccaagcg ctcccagggc cgcatccgcg agctgttctc ccaggccgag tcccacttcc 540 gcaactccat gccgtccttc gccgtctcca agttcgaggt cctgttcctg cccacctacg 600 cccaggctgc caacacccac ctcctgttgc tgaaggacgc ccaggtcttc ggcgaggaat 660 ggggctactc ctcggaggac gtcgccgagt tctaccgtcg ccagctgaag ctgacccaac 720 agtacaccga ccactgcgtc aactggtaca acgtcggcct gaacggcctg aggggctcca 780 cctacgacgc atgggtcaag ttcaaccgct tccgcaggga gatgaccctg accgtcctgg 840 acctgatcgt cctgttcccc ttctacgaca tccgcctgta ctccaagggc gtcaagaccg 900 agctgacccg cgacatcttc acggacccca tcttcctgct cacgaccctc cagaagtacg 960 gtcccacctt cctgtccatc gagaactcca tccgcaagcc ccacctgttc gactacctcc 1020 agggcatcga gttccacacg cgcctgaggc caggctactt cggcaaggac tccttcaact 1080 actggtccgg caactacgtc gagaccaggc cctccatcgg ctcctcgaag acgatcacct 1140 cccctttcta cggcgacaag tccaccgagc ccgtccagaa gctgtccttc gacggccaga 1200 aggtctaccg caccatcgcc aacaccgacg tcgcggcttg gccgaacggc aaggtctacc 1260 tgggcgtcac gaaggtcgac ttctcccagt acgatgacca gaagaatgaa acctccaccc 1320 agacctacga ctccaagcgc aacaatggcc acgtctccgc ccaggactcc atcgaccagc 1380 tgccgcctga gaccactgac gagcccctgg agaaggccta ctcccaccag ctgaactacg 1440 cggagtgctt cctgatgcaa gaccgcaggg gcaccatccc cttcttcacc tggacccacc 1500 gctccgtcga cttcttcaac accatcgacg ccgagaagat cacccagctg cccgtggtca 1560 aggcctacgc cctgtcctcg ggtgcctcca tcattgaggg tccaggcttc accggtggca 1620 acctgctgtt cctgaaggag tcctcgaact 1650 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssIIb 1-5' <400> 3 ctcccaatcc tttgacatct gc 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssIIb 1-3' <400> 4 tcgatttctc tcttggtgac agg 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssIIb-taq <400> 5 agcaaagtca gagcgctgca atgca 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MON863-5' <400> 6 gtaggatcgg aaagcttggt ac 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MON863-3' <400> 7 tgttacggcc taaatgctga act 23 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MON863-taq <400> 8 tgaacaccca tccgaacaag tagggtca 28

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 ssIIb 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 cry3Bb1 유전자; 및 식물체에 도입된 cry3Bb1 유전자의 5‘ 인접 서열(5’ flanking sequence) 및 3‘ 인접 서열(3’ flanking sequence); 을 포함하는, 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자변형 식물체는 옥수수 MON863 품종인 것을 특징으로 하는 유전자변형 식물체 검정용 표준 플라스미드.
4. ⅰ) 제 1항의 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계;
   ⅱ) 상기 농도별로 희석한 표준 플라스미드와 생물학적 시료료부터 수득한 DNA를 각각 주형으로 해서 검정용 PCR 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;
   ⅲ) 상기 희석한 표준 플라스미드를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 측정하여 표준 정량 곡선을 산출하는 단계; 및
   ⅳ) 상기 생물학적 시료로부터 수득한 DNA를 대상으로 수행한 PCR 산물의 양을 상기 표준 정량 곡선에 도입하여 외래 도입 유전자의 혼입률을 산출하는 단계;를 포함하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 PCR 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하고, 상기 프로브는 서열번호 5 및 8의 염기서열로 이루어지는 프로브인 것을 특징으로 하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 유전자변형 식물체는 옥수수 MON863 품종인 것을 특징으로 하는 유전자변형 식물체에 혼입된 외래도입 유전자의 정량 분석방법.
7. 제 1항의 표준 플라스미드를 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트.
8. 제 1항의 표준 플라스미드로부터 발현되는 단백질을 포함하는 유전자변형 식물체 검정용 키트.

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