KR20120044975A

KR20120044975A - 생물학적 샘플에서 ｄｎａ를 정량화하는 개선된 방법

Info

Publication number: KR20120044975A
Application number: KR1020127001186A
Authority: KR
Inventors: 호프 하트
Original assignee: 신젠타 파티서페이션즈 아게
Priority date: 2009-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2012-05-08
Also published as: AP3139A; CO6480907A2; UA105044C2; WO2010148268A1; EA021136B1; CA2765958A1; NZ596987A; ES2483121T3; CN102482697B; CN102482697A; MX2011013199A; US9096896B2; AP2011006051A0; BRPI1011662A2; EP2443247A1; US20120100544A1; EA201200026A1; EP2443247B1; EP2443247A4; CL2011003186A1

Abstract

생물학적 샘플에서 Bt11로 지정된 유전자전이 옥수수 품목 특유의 핵산을 정량화하는 개선된 방법 및 동 방법의 합성물이 공개됩니다. 나아가 본 발명은 품목 Bt11 특유의 방법에 사용되는 시발체 쌍들에 관한 것입니다.

Description

생물학적 샘플에서 ＤＮＡ를 정량화하는 개선된 방법{Improved method for quantifying DNA in a biological sample}

본 발명은 생물학적 샘플에서 Bt11로 지정된 유전자전이 옥수수 품목 특유의 핵산을 정량화하는 개선된 방법 및 동 방법 실행에 유용한 합성물에 관한 것입니다.

예를 들면 유럽연합 집행위원회(EC) 규정 1139/98, EC 규정 49/2000 및 EC 규정 50/2000과 같은 유전자전이 농작물을 둘러싼 규정 실행의 결과로 예를 들면 식품용으로 사용된 곡물 내에 존재할 수 있는 유전자전이 종에서 DNA의 수준을 정확히 측정할 필요가 있어 왔습니다. 이러한 유전자전이 농작물에서 DNA를 검출하고 정량화하는 분석 방법은, 특히 유럽연합 집행위원회의 상임위원회가 1999년에 정한 표시를 위한 한계치가 1%이기 때문에 많은 주목을 받아왔습니다.

폴리뉴클레오티드 시발체를 사용하는 열 증폭(중합효소 연쇄 반응(PCR)) 또는 핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화를 포함하지만 이에 국한되지 않는 잘 알려진 핵산 검출 방법에 의해 이식 유전자의 존재를 검출하는 것이 가능합니다. 일반적으로 다양한 식물 품종을 변형시키기 위해 사용되어온 특정 DNA 구조물을 검출하는데 사용키 위한 시약 및 방법의 단순성과 일률성을 위해, 많은 DNA 구조물들의 경우 코딩 서열 지역은 교환할 수 있기 때문에 이 검출 방법은 일반적으로 예를 들면 촉진자, 종료자 및 표지 유전자와 같은 자주 사용되는 유전 요소들에 초점을 둡니다. 결과적으로 이런 방법들은 코딩 서열과 관련해서만 다른 구조물들을 구별하는데 유용하지 않을 수 있습니다. 아울러, 이런 방법들은 다른 유전자전이 품목들, 특히 동일 DNA 구조물을 사용하여 제작된 것들을 구별하는데 유용하지 않을 수 있습니다.

유전자전이 품목들 간에 구별하기 위해 품목 특유의 PCR 방법들이 개발되었습니다. 식물의 게놈에 비상동 DNA 구조물을 삽입하면 통합 DNA 서열과 식물의 게놈 서열 간의 독특한 품목 고유의 접합부가 형성됩니다. 품목 고유의 양적 PCR(qPCR) 방법들은 Bt11을 위한 방법을 포함해 유전자전이 품목들을 위해 개발되었습니다. 이런 방법들의 적용 능력을 제한할 수 있는 요소들에는 예를 들면 최초 DNA 농도의 영향, 규제기관이 지정한 기준, 시발체 및 PCR 프로토콜의 선택, 샘플 간 반복성, 다른 실험실 간의 재현성, 저수준 검출 및 고감도 문턱값 등이 포함됩니다.

전술한 이유들 때문에, Bt11 유전자전이 옥수수 품목 생물학적 샘플로부터의 핵산의 양적 검출을 개선할 필요가 있습니다.

본 발명은 2개의 비상동 발현 카세트로 이루어지는 Bt11라고 불리는 유전자전이 옥수수(Zea mays) 품목에 관한 것인데, 하나는 곤충 저항성을 Bt11 옥수수에 부여하는 Cry1Ab 살충 단백질을 부호화하는 Cry1Ab 코딩 서열로 구성되고 다른 하나는 glufosinate-ammonium 제초제 저항성을 Bt11 옥수수에 부여하는 PAT 단백질을 부호화하는 pat 코딩 서열로 구성됩니다. Bt11 품목 창작은 미국 특허 번호 6,114,608에 서술되어 있으며, 그 내용을 언급에 의해 편입합니다. 117번 위치 가까이 8번 염색체의 장완의 15 cM 영역 내에 그리고 2개의 일반 표지 ZIB3 및 UMC150a가 양 옆에 접해 있는 간격 내에 삽입되는 2개의 발현 카세트.

본 발명은 내재 옥수수 adh1 유전자와 관련하여 생물학적 샘플 내에서 Bt11 고유 DNA의 양적 검출을 위한 합성물과 개선된 방법을 제공합니다. 예를 들면 Bt11 및 비 Bt11 곡물로 구성되는 혼합 옥수수 곡물 내의 Bt11 DNA에 대한 이러한 정량화는 Bt11 내의 5’ 접합 서열 검출 용으로 설계된 시발체 쌍 및 프로브에 근거합니다

본 발명의 한 양상에서, 옥수수 핵산들로 구성되는 생물학적 샘플에서 품목 Bt11 DNA를 정량화하는 방법이 제공되는데, 동 방법은 다음 단계들로 구성됩니다: (a) SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 첫 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 3으로 구성되는 형광 염료 표지 프로브로 생물학적 샘플 접촉, 여기서 첫째 시발체 쌍은 품목 Bt11 옥수수의 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 4로 구성되는 첫째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 첫째 앰플리콘은 품목 Bt11의 진단임; (b) ) SEQ ID NO: 5로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 6로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 둘째 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 7로 구성되는 형광 염료 표지 프로브로 생물학적 샘플 접촉, 여기서 둘째 시발체 쌍은 옥수수 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 8로 구성되는 둘째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 둘째 앰플리콘은 옥수수 adhl 유전자의 존재를 나타냄; (c) 핵산 확장 반응 상태 및 양적 실시간 PCR을 실시할 수 있는 PCR 기구 제공; (d) (a) 및 (b)의 시발체와 프로브를 사용하여 첫째 앰플리콘과 둘째 앰플리콘을 생성하는 양적 실시간 PCR 실행; (e) 첫째 앰플리콘 및 둘째 앰플리콘이 상기 PCR 기구에 의해 생성될 때 그들을 동시에 검출; 및 (f) 첫째 앰플리콘의 상대량을 둘째 앰플리콘에 비교하여 계산, 여기서 첫째 앰플리콘의 양은 생물학적 샘플에서 Bt11 DNA의 양을 나타냄.

또 한 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 시발체 쌍을 제공하며, 여기서 시발체 쌍은 품목 Bt11 옥수수의 게놈 DNA와 함께 PCR에서 사용되는 경우 품목 Bt11의 진단이되는 SEQ ID NO: 4로 구성되는 앰플리콘을 생성합니다.

또 다른 한 양상에서, 본 발명은 5’ 및 3’ 말단에서 형광 염료로 표시할 경우 Bt11 앰플리콘의 검출 및 정량화를 위한 RT-qPCR에서 유용한 SEQ ID NO: 3으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 프로브를 제공합니다.

본 발명의 전술한 양상과 기타 양상은 다음의 자세한 설명으로 더욱 명백해질 것입니다.

서열 목록 내의 서열들에 대한 설명

SEQ ID NO: 1은 Bt11-5For 시발체입니다.

SEQ ID NO: 2는 Bt11-5Rev 시발체입니다.

SEQ ID NO: 3은 Bt11 시발체입니다.

SEQ ID NO: 4는 Bt11 qPCR 앰플리콘입니다.

SEQ ID NO: 5는 Zmadh1-F 시발체입니다.

SEQ ID NO: 6은 Zmadh1-R 시발체입니다.

SEQ ID NO: 7은 Zmadh1-P 프로브입니다.

SEQ ID NO: 8은 adh1 qPCR 앰플리콘입니다.

본 발명을 더욱 잘 정의하고 이 분야의 통상의 지식을 가진 사람들에게 본 발명의 실행에 대해 안내하기 위해 다음의 정의들을 제공합니다. 달리 언급하지 않은 한, 여기서 사용한 용어들은 관련 분야에 대한 통상의 지식을 가진 사람들의 관례적인 용법에 따라 이해되어야 합니다. 일반적인 분자 생물학 용어에 대한 정의는 Rieger 등의 Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5^th edition, Springer-Verlag; New York, 1994에서도 볼 수 있습니다. 37 C.F.R. § 1.822에 제시된 DNA 염기 및 아미노산에 대한 용어 체계가 여기에서 사용됩니다.

PCR 방법의 “정확성”은 시험 결과와 인정된 기준값 간의 일치 정도를 의미합니다.

“증폭 효율”은 각 주기에 있어서 100%의 효율로 -3.32의 이론적 기울기를 유발하는 증폭율을 의미합니다. 반응 효율은 다음 등식에 의해 계산할 수 있습니다: 효율 = [10^{(-1/기울기)}] - 1.

여기에서 사용된 바와 같이, “증폭”이란 용어는 핵산 분자들 중 최소한 하나를 틀로 사용하여 한 핵산 분자의 복수 카피 또는 동 핵산 분자에 대해 보완적인 복수 카피의 구성을 의미합니다. 증폭 시스템은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시스템, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 시스템, 핵산 서열 기재 증폭(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), Q 베타 리플리케이스 시스템, 전사 기재 증폭 시스템(TAS) 및 가닥 치환 증폭(SDA)을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아닙니다. 예를 들어 Diagnostic Molecular Microbiology; Principles and Applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993) 참조. 증폭 산물은 앰플리콘이라고 부릅니다.

“직선성 계수(R²)”는 선형 회귀 분석에 의해 얻어지는 표준 곡선의 상관 계수입니다.

여기에서 사용된 “역동 범위”는, 본 발명의 방법이 만족할 만한 정확성 및 정밀도 수준으로 선형으로 실행되는 Bt11 DNA 농도의 범위를 의미합니다.

여기에서 사용된 이식 유전자 “품목”이란 용어는 식물 세포나 조직을, 예를 들면, 관심 유전자를 포함하는 발현 카세트와 같은 비상동 DNA 로 전환하고 재생하여 생산된 재조합 식물을 지칭합니다. “품목”이란 용어는 비상동 DNA를 포함하는 원 형질전환주 및/또는 형질전환주의 후손을 지칭합니다. 또한 “품목”이란 용어는 형질전환주와 다른 옥수수 계통 간의 유성 이종교배에 의해 생산된 후손을 지칭합니다. 반복친으로의 반복적 여교잡 후에도 삽입 DNA 및 형질전환 부모의 인접 DNA가 동일한 염색체 위치에서 교잡종의 후손 내에 있습니다. 또한 “품목”이란 용어는, 삽입된 DNA(예를 들어, 원 형질전환주와 자가생식에서 비롯된 후손)를 포함하는 한 모체 라인과 삽입된 DNA를 포함하지 않는 모체 라인의 유성 교배의 결과로서 관심 이식 유전자를 포함하는 삽입된 DNA를 받는 후손으로 전이될 것으로 예상되는 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접한 인접 게놈 서열로 구성되는 원 형질전환주의 DNA를 지칭합니다. 보통 식물 조직의 전환은 여러 품목들을 생성하며, 각 품목은 식물 세포 게놈 내의 다른 위치에 DNA 구조물을 삽입하는 것을 나타냅니다. 이식 유전자나 다른 바람직한 특성의 발현에 근거하여 특정 품목이 선택됩니다. 따라서 “품목 Bt11”, “Bt11” 또는 “Bt11 품목”는 서로 바꾸어서 사용할 수 있습니다.

여기서 사용된 “발현 카세트”는 적합한 숙주 세포 내에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있으며 종료 신호에 작동 가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 의미합니다, 또한 이것은 일반적으로 뉴클레오티드 서열의 적합한 번역을 위해 요구되는 서열들을 포함합니다. 또한 발현 카세트는 관심 뉴클레오티드 서열의 직접 발현에는 필요치 않지만 발현 벡터로부터 카세트의 제거를 위해 편리한 제한 자리들로 인해 존재하는 서열들을 포함할 수도 있습니다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이것은 그 성분들 중 최소한 하나가 다른 성분들 가운데 최소한 하나에 대해 비상동임을 의미합니다. 또한 발현 카세트는 자연 발생하는 것일 수도 있지만 비상동 발현을 위해 유용한 재조합 형태로 확보될 수도 있습니다. 그러나 일반적으로 발현 카세트는 숙주에 대하여 비상동입니다. 즉, 발현 카세트의 특정 핵산 서열은 숙주 세포 내에서 자연적으로 발생하지 않으며 이 분야에서 알려진 유전자전이 프로세스에 의해 숙주 세포나 숙주 세포의 조상에게 삽입되어야 합니다. 발현 카세트 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현은, 구성 프로모터의 또는 숙주 세포가 특정 외부 자극에 노출된 경우에만 전사를 시작하는 유도 가능 프로모터의 통제하에 있을 수 있습니다. 식물과 같은 다세포 유기체의 경우 프로모터는 특정 조직 또는 기관 또는 발육 단계에 특유한 것일 수 있습니다. 발현 카세트나 그 조각은 식물에 전환된 경우 “삽입된 서열” 또는 “삽입 서열”로 지칭될 수도 있습니다.

“유전자”는 게놈 내에 위치하여 있으며 코딩 서열 이외에도 코딩 부분의 발현, 즉 전사와 번역의 통제를 담당하는 다른 주로 조절 핵산 서열들을 포함할 수 있는 정의된 구역입니다. 또한 유전자는 다른 5’ 및 3’ 미번역 서열들과 종료 서열들을 포함할 수 있습니다. 또한 예를 들면 인트론과 같은 추가 요소들이 존재할 수 있습니다.

“비상동” 핵산 서열은 자연 발생 핵산 서열의 비자연 발생 복수 카피를 비롯하여 삽입된 숙주 세포와 자연 연관되지 않은 핵산 서열입니다.

“검출 한계(LOD)”는 신뢰할 수 있게 검출될 수 있지만 반드시 정량화될 수 있는 것은 아닌 샘플 내의 최소 양 또는 농도의 DNA 입니다. 본 발명에 따른 한 방법의 LOD는 목표 농도의 1/20 미만이 될 것입니다. 실험상, 본 발명의 한 방법은 LOD에서 최소한 95%의 경우에 Bt11 DNA의 존재를 검출하여 ≤ 5%의 거짓음성 결과를 보장합니다.

“정량 한계(LOQ)”는 만족할 만한 수준의 정밀도 및 정확성으로 신뢰할 수 있게 정량화될 수 있는 샘플 내의 Bt11 DNA의 최소 양이나 농도입니다. 본 발명에 따른 한 방법의 LOQ는 RSD_r ≤ 25% 에서 목표 농도값의 1/10 미만이 될 것입니다. 목표 농도는 법적 요건에 적합한 문턱값으로 사용하기 위한 것입니다.

“실행 가능성”은 작동의 용이성, 실행의 가능성과 효율 및/또는 여기에 서술된 방법의 관련 단가(예를 들어, $/샘플)를 의미합니다.

여기서 사용된 “시발체”는 시발체와 타겟 DNA 가닥 간에 잡종을 형성하기 위해 핵산 튀기생성에 의해 상보성 타겟 DNA 가닥으로 아닐링된 후에 DNA 중합효소와 같은 중합효소에 의해 보족 타겟 DNA 가닥을 따라 확장되는 격리 핵산들입니다. 시발체 쌍이나 세트들은, 예를 들면 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)이나 다른 종래의 핵산 증폭 방법들에 의한 핵산 분자의 증폭을 위해 사용될 수 있습니다.

“프로브”는, 화학 발광제, 방사성 동위원소, 리간드 또는 효소와 같은 종래의 검출 가능 레이블이나 리포터 분자가 부착되는 격리 핵산입니다. 이러한 프로브는 옥수수 품목 Bt11 또는 종래의 옥수수 계열의 DNA 가닥에 대해 보완적입니다. Bt11의 DNA는 Bt11 옥수수 또는 Bt11의 DNA를 포함하는 샘플로부터 비롯될 수 있습니다. 본 발명에 따른 프로브들은 디옥시리보핵산이나 리보핵산뿐만 아니라 특별히 타겟 DNA 서열에 결합하고 동 타겟 DNA 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질들을 포함합니다.

시발체와 프로브들은 일반적으로 길이가 10과 15 이상의 뉴클레오티드 사이입니다. 또한 시발체와 프로브들은 길이가 최소한 20 뉴클레오티드 이상 또는 최소한 25 뉴클레오티드 이상 또는 최소한 30 뉴클레오티드 이상일 수 있습니다. 이러한 시발체와 프로브들은 매우 엄격한 혼합물생성 조건 하에서 특정 타겟 서열로 혼합물을 만듭니다. 비록 프로브가 타겟 서열과 다르며 타겟 서열로혼합물을 만드는 능력을 보유하는 것이 종래의 방법에 의해 설계될 수 있더라도, 본 발명에 따른 시발체와 프로브들은 타겟 서열과 완전한 서열 보완성을 갖출 수 있습니다.

여기서 사용된 “반복성 표준 편차(RSD_r)”는 반복성 조건 하에서 얻은 시험 결과의 표준 편차입니다. “반복성 조건”은 시험 결과가 동일한 방법으로, 동일한 시험 품목에 대해, 같은 실험실에서, 같은 실시자에 의해, 짧은 시간 간격 내에 같은 장비를 사용하여 얻어지는 조건입니다.

여기서 사용된 “재현성 표준 편차(RSD_R)”는 재현성 조건 하에서 얻은 시험 결과의 표준 편차입니다. 재현성 조건은 시험 결과가 동일한 방법으로, 동일한 시험 품목에 대해, 다른 실험실에서, 다른 실시자에 의해, 다른 장비를 사용하여 얻어지는 조건입니다. 재현성 표준 편차는 실험실 간 변화를 서술합니다.

방법의 “확고성”은 절차에서 서술된 실험 조건으로부터 작지만 의도적인 이탈에 의해 영향을 받지 않는 상태로 남는 능력의 척도입니다.

방법의 “특이성”은 관심 특성 또는 피분석물에 대해서만 독특하게 반응하는 방법의 속성을 지칭합니다. 예를 들면, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 공시된 시발체들을 사용하는 예 1에 서술된 PCR 방법의 특이성은 독특하게 Bt11 DNA를 검출합니다.

방법의 “충실성”은 일련의 대규무 시험 결과로부터 얻은 평균값과 인정된 기준값 간의 일치 정도입니다. 충실성의 정도는 일반적으로 퍼센트 바이어스로 표현됩니다. 본 발명에 따른 한 방법은 전체 역동 범위에 걸쳐 ±5%의 충실성을 가지고 있습니다.

여기서 사용된 Bt11 “특유의”란 용어는 품목 Bt11의 특수한 특성이나 진단을 의미합니다. 그러므로, 품목 Bt11 특유의 핵산들은 다른 비 Bt11 옥수수에서는 발견되지 않습니다.

본 발명은 내재 옥수수 adh1 유전자와 관련하여 생물학적 샘플 내에서 Bt11 고유 DNA의 양적 검출을 위한 합성물과 개선된 방법에 관한 것입니다. 예를 들면 Bt11 및 비 Bt11 곡물로 구성되는 혼합 옥수수 곡물 내의 Bt11 DNA에 대한 이러한 정량화는, Bt11 내의 5’ 접합 서열 검출 용으로 설계된 시발체 쌍 및 프로브에 근거합니다

일 실시예에서, 본 발명은 옥수수 핵산들로 구성되는 생물학적 샘플에서 품목 Bt11 DNA를 정량화하는 방법을 포함하는데, 동 방법은 다음 단계들로 구성됩니다: (a) SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 첫 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 3으로 구성되는 형광 염료 표지 프로브로 생물학적 샘플 접촉, 여기서 첫째 시발체 쌍은 품목 Bt11 옥수수의 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 4로 구성되는 첫째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 첫째 앰플리콘은 품목 Bt11의 진단임; (b) ) SEQ ID NO: 5로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 6로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 둘째 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 7로 구성되는 형광 염료 표지 프로브로 생물학적 샘플 접촉, 여기서 둘째 시발체 쌍은 옥수수 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 8로 구성되는 둘째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 둘째 앰플리콘은 옥수수 adhl 유전자의 존재를 나타냄; (c) 핵산 확장 반응 상태 및 정량적 실시간 PCR을 실시할 수 있는 PCR 기구 제공; (d) (a) 및 (b)의 시발체와 프로브를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 실시하고 이에 의해 첫째 앰플리콘과 둘째 앰플리콘을 생산; (e) 첫째 앰플리콘 및 둘째 앰플리콘이 상기 PCR 기구에 의해 생성될 때 그들을 동시에 검출; 및 (f) 첫째 앰플리콘의 상대량을 둘째 앰플리콘에 비교하여 계산, 여기서 첫째 앰플리콘의 양은 생물학적 샘플에서 Bt11 DNA의 양을 나타냄.

이 실시예의 한 양상에서, 동 방법의 정량 한계(LOQ)는 0.08% Bt11 DNA 농도보다 작거나 같습니다.

이 실시예의 또 한 양상에서, 동 방법의 검출 한계(LOD)는 0.04% Bt11 DNA 농도보다 작거나 같습니다.

이 실시예의 또 다른 한 양상에서, 동 방법의 평균 직선성 계수(R²)는 최소한 0.99입니다.

이 실시예의 또 다른 한 양상에서, 동 방법의 재현성 표준 편차 (RSD_R)는 0.090%의 Bt11 DNA 농도에서 24% 이거나 그 이하입니다.

이 실시예의 또 한 양상에서, 동 방법의 반복성 표준 편차 (RSD_r)는 0.090%의 Bt11 DNA 농도에서 17% 이거나 그이하입니다.

이 실시예의 또 따른 한 양상에서, 동 방법의 충실성 값은 전체 역동 범위에 걸쳐 ±5% 이거나 그이하입니다.

또 한 양상에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 시발체 쌍을 제공하며, 이것은 생물학적 샘플 내에 옥수수 품목 Bt11 DNA 틀이 있을 때 PCR에서 함께 기능하여 옥수수 품목 Bt11의 진단인 앰플리콘을 생산합니다.

이 실시예의 한 양상에서, 앰플리콘은 SEQ ID NO: 4로 구성됩니다.

또 다른 한 실시예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3으로 구성되는 형광 염료로 표시한 프로브를 포함합니다.

다음 예들은 전적으로 본 발명의 바람직한 하나 이상의 실시예를 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 합니다.

예

예 1. Bt11 정량 RT-qPCR 방법 개발

이 예는 생물학적 샘플에서 전체 옥수수 DNA에 비한 품목 Bt11 DNA의 상대량을 결정하기 위한 개선된 Bt11 특유의 실시간 정량 PCR(RT-qPCR) 방법을 서술합니다.

TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) 아쎄이는 PCR 반응 진행 중에 PCR 산물의 축적이 직접 모니터되는 RT-qPCR 검출 기법입니다. 각 증폭 주기 중 Taq DNA 중합효소의 5'-3' 엑소누클리에이스 활성에 의한 타겟 특유 프로브 분자들의 분해는 형광 축적을 초래합니다. 증가된 수준의 형광은 PCR 산물 축적과 직접 관련되며 예를 들면 ABI PRISM™ 770 또는 ABI PRISM™ 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은(이에 국한되지는 않음) 특수 PCR 기계를 사용하여 각 증폭 주기 중에 검출됩니다.

주기 문턱값(Ct)들은, 형광이 바탕 위의 특정 수준을 초과하는 주기에 따라 각 샘플에 PCR 기구에 의해 자동으로 배정됩니다. 반응 초기에 보다 높은 수준의 틀을 가진 샘플들은 보다 신속하게 검출 가능한 수준으로 증폭되며 낮은 Ct를 생성합니다. 시험 샘플에서 품목 Bt11 DNA 양의 정량화를 위해서는, 보정 샘플들의 정규화 △Ct 값들을 사용하여 선형 회귀분석에 의해 기준 곡선 △Ct-공식을 계산합니다. 그런 다음 미지 샘플들의 정규화 △Ct 값들을 측정하고 계산된 회귀분석 공식에 의해 미지 샘플 내에서 Bt11 품목 DNA의 상대량이 추정됩니다. 여기서 서술된 TaqMan® 아쎄이를 사용하여 내재 보정 옥수수 유전자에 비한 Bt11 DNA의 수준을 정확히 정량화할 수 있습니다. 내재 보정 서열은 전체 옥수수 게놈 DNA와 비교하여 일정하게 유지되기 때문에, 내재 유전자에 대한 Bt11 특유 DNA의 상대 수준의 변화는 복사 수의 차이를 나타내는 것입니다.

1.1 품목 Bt11 옥수수를 위한 발현 특유 PCR 시스템

삽입물과 품목 Bt11의 게놈 DNA 간의 접합 영역에서 파생된 PCR 시스템들은 DNA 삽입물 및 그 인접 5’-3’ 경계 서열에 관한 서열 정보에 근거하여 시험되었습니다. 올리고핵산염 설계 소프트웨어(Primer Express™ V2.0)의 도움을 받아 5’ 경계를 위해 3개의 프로브와 6개의 증폭 시발체들을 설계하였으며 3’ 경계를 위해 1개의 프로브와 3개의 증폭 시발체들을 설계하였습니다. 이어서 시발체 및 프로브의 가능한 모든 조합을 실험적으로 시험하였습니다.

Ct 값, △Rn 값, 증폭 도표의 형태 및 PCR 효율의 비교에 근거하여 한 시발체 쌍/프로브 조합을 더욱 최적화하기 위해 선택하였습니다.

최적의 시발체 쌍 및 프로브는 5’ 게놈-삽입 접합부에 위치하여 있는데, 이것은 3’ 접합 시발체들보다 더 나은 결과를 낳았습니다. 전방향 시발체는 게놈 DNA 내에 위치하여 있으며, 역방향 시발체의 결합 자리는 품목 Bt11 삽입물 내에 위치하여 있는데 비하여, 프로브는 5’ 게놈-삽입물 접합부에 걸쳐 있습니다. 품목 Bt11 DNA의 특정적 검출을 위해, 비상동 삽입 DNA 및 삽입물의 5’ 종단부에 인접한 옥수수 게놈 DNA를 중첩하는 68-bp 핵산 조각을 다음 시발체들을 사용하여 증폭합니다:

Bt11-ev-f1: 5'- TGTGTGGCCATTTATCATCGA-3’ (SEQ ID NO: 1)

Bt11-ev-r5: 5'-CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3' (SEQ ID NO: 2).

PCR 산물들은 다음 타겟별 올리고핵산염 프로브에 의해 각 주기에서(실시간) 측정됩니다:

Bt11-ev-p1: 5'-TTCCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-3' (SEQ ID NO: 3), 5’ 종단에서 리포터 염료인 플로오레신 (FAM)으로 그리고 3’ 종단에서 억제 염료인 테트라메틸로드아민(TAMRA)으로 표시.

Bt 옥수수 DNA와 반응에서 이러한 시발체들을 틀로 사용하면 SEQ ID NO: 4로 구성되는 앰플리콘이 생산되는데, 이것은 품목 Bt11에 특유하고 그 진단성을 나타냅니다.

1.2 옥수수 특유의 기준 PCR 시스템 (Adh1)

품목 Bt11 DNA의 상대적 정량화를 위해, 옥수수 내재 알코올 탈수소 효소 1 유전자(adh1)(Genbank 수납번호 AY691949) 의 135-bp 조각을 증폭하는 기존 옥수수 고유 기준 PCR 시스템 (Hernandez et al. 2004. J. Agric. Food Chem. 52:4632-4637)을 Zea mays 서열의 특정적 검출을 위한 기준 시스템으로 사용하였습니다. 이 기준 시스템은 다음 시발체들을 사용합니다:

Zmadh1-F: 5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 5)

Zmadh1-R: 5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3' (SEQ ID NO: 6)

Zmadh1-P: 5'-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3' (SEQ ID NO: 7), 5’ 종단에서 VIC™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) 염료로 그리고 3’ 종단에서 TAMRA로 표시.

옥수수 DNA와 반응에서 이러한 시발체들을 틀로 사용하면 SEQ ID NO: 8로 구성되는 앰플리콘이 생산되는데, 이것은 옥수수 adh1의 존재를 나타냅니다.

1.1 보정 곡선 계산

보정 곡선은 250 ng의 옥수수 DNA 총량에서 고정된 퍼센트의 Bt11 DNA를 포함하는 5개 샘플로 구성됩니다. 표준 샘플에서 Bt11 DNA의 농도의 범위는 10%에서 0.08%까지 이르렀습니다. 보정 곡선은 각 Bt11% 농도의 로그에 대한 보정 샘플들의 △Ct 값들을 좌표에 표시함으로써 형성되며, 보정 곡선(y = ax + b)의 기울기(a)와 절편(b)을 사용하여 그들의 정규화 △Ct 값들에 근거하여 블라인드 샘플의 평균 Bt11% 함량을 계산합니다.

TaqMan™ 반응 중에 ABI PRISM™ 7900 HT 기구 동반 소프트웨어가 형광 축적에 의해 PCR 산물의 축적을 검출합니다. 확립된 베이스라인 수준(△Rn)에 대비한 정규화 형광이 주기 번호와 대조하여 좌표에 표시됩니다. Ct 값은, 선이 각 반응의 로그 기를 통과하도록 임의의 반응 차단을 그림으로써 얻어집니다. 서열 검출 시스템 소프트웨어는 ABI PRISM™ 7900 HT 기구와 함께 특정 반응의 형광(PCR 산물) 축적이 문턱값(Ct)을 교차하는 주기 번호를 제공합니다. 각 반응의 FAM Ct 값을 존재하는 전체 핵산 수준으로 정규화하기 위해 FAM Ct(Bt11) 값이 VIC Ct (adh1) 값에 비교되어 △Ct[△Ct = Ct(FAM) - Ct(VIC)]이 나옵니다. 이 계산은 반응에서 같지 않은 틀 입력에 의해 초래된 변화를 제거합니다. 게놈 당 내재 옥수수 유전자 카피의 수는 일정하게 유지되기 때문에, △Ct의 변화는 Bt11 DNA의 양적(또는 카피) 변화에 해당됩니다. 미지 샘플의 △Ct 값을 알려진 대조구의 △Ct에 비교함으로써 △△Ct가 얻어집니다[△△Ct = △Ct(미지) - △Ct (알려짐)]. 그런 다음 카피 수는 다음 등식으로 △△Ct 값을 사용하여 계산할 수 있습니다: 카피 수 = 2^(△△Ct).

1.2 실시간 PCR 설정

PCR들은 96-well reaction plate에서 실시됩니다. 절차는 심플렉스 시스템으로서, 이 시스템에서 보정 옥수수 adh1 내재 아쎄이 및 타겟 Bt11 아쎄이가 별개의 웰 내에서 동시에 실시됩니다. 얼음 위에 놓은 Bt11 시스템을 반응관과 adh1 시스템을 위한 반응관의 2개 반응관 내에, 마스터 믹스를 준비하기 위해 나열된 순서대로 표 1 및 2의 성분들(DNA 제외)을 추가합니다. 2X Sigma Jumpstart Ready Mix에 550 μl의 1M MgCl₂ 및 20 μl의 10000x 술포로다민 101을 보충합니다. 약하게 혼합하고 잠시 원심 분리합니다. 표준 곡선 DNA 샘플, 미지 DNA 샘플 및 대조구 DNA 샘플을 위해 하나는 Bt11을 위한 것으로 그리고 하나는 adh1 마스터 믹스들을 위한 것으로 2개의 반응관들을 더 준비합니다. 각 반응관에 정확한 양의 마스터 믹스를 추가합니다 (예를 들면, 3회 PCR 반복을 위한 마스터 믹스 20 x 3 = 60 μl). 각 반응관에 표 1 및 2에 제시된 정확한 양의 DNA를 추가합니다 (예를 들면, 3회 PCR 반복을 위한 DNA 5 x 3 = 15 μl).

각 샘플의 반복 간에 가변성을 줄이는데 도움이 되도록 약 10초 동안 각 반응관을 소용돌이 혼합합니다. 초소형 원심분리기에서 반응관들을 스핀 다운합니다. 각 PCR 반응 웰에 25 μl을 분취합니다. 반응 플레이트를 광학 커버 또는 광학 캡으로 밀봉합니다. 약 250x g에서 약 1분 동안 4°C 내지 약 실내온도의 범위에서 플레이트를 원심분리합니다. 플레이트를 PCR 기구에 넣고 표 3에 서술된 순환 조건으로 PCR을 실행합니다.

1.3 데이터 분석

위에 서술된 실시간 PCR 프로토콜을 실행한 후에, 다음 절차에 따라 결과를 분석합니다:

문턱값 설정을 위해 로그 모드에서 한 시스템(예를 들면, Bt11)의 증폭 곡선들을 표시합니다. 증폭 프로필들이 평행한 곡선의 영역에서(pCR의 지수 기) 문턱값 선을 찾습니다. 필요한 대로 Ct 값을 업데이트합니다. 증폭 도표의 Y 축을 클릭하여 선형 모드로 바꾸고 이전에 설정한 문턱값이 곡선의 기하학적 위상에 속하는지 점검합니다.

베이스라인 설정을 위해 문턱값 선이 첫째 증폭 곡선을 교차하는 주기 번호를 결정하고 그 값 3개 주기 전에 베이스라인 를 설정합니다(예를 들면, 최초에 Ct = 25, Ct = 25 - 3 = 22에 베이스라인 교차 설정).

위에 서술된 절차를 다음 시스템(효과, adh1 시스템)의 증폭 도표에서 반복합니다.

위에 서술된 대로 증폭의 로그 기 이내에 문턱값을 정의한 후에, 기구의 소프트웨어는 각 반응을 위한 Ct 값을 계산합니다. Bt11% 함량의 로그에 대해 보정 점들을 위해 측정된 Ct 값들을 좌표에 표시하고 직선형 회귀분석 선을 이 데이터에 맞춤으로써 기준 Ct-곡선이 생성됩니다. 그 후, 회귀분석 공식을 사용하여 미지 DNA 샘플에서 Bt11 DNA의 상대량을 추정합니다.

Bt11 아쎄이(전방향/역방향 시발체 및 프로브)의 특이성은, Bt11, Bt10, NK603, MON810, MON863, MON810 x MON863, TC1507, MIR604, Bt176, GA21, MON88017, T25 및 Herculex® RW (DAS-59122-7)을 포함하는 이 분야에서 알려진 이식 유전자를 가진 옥수수를 포함하는 샘플들로부터 추출된 DNA에 대해 실시간 PCR로 실험적으로 시험되었습니다.

결과는 위에 언급된 시험을 거친 이식 유전자를 가진 옥수수 계열 중 어느 것도 양성 대조 Bt11을 제외하고는 반응 당 총 100 ng DNA를 사용하였을 때 복제 샘플들 내에서 앰플리콘을 생산하지 못하였음을 입증합니다.

예 2. Bt11 정량 RT - qPCR 방법 입증

예 1에 서술된 방법은 Bt11 및 종래의 옥수수 종자 혼합물에서 취한 생물학적 샘플에서 Bt11 DNA의 정량화를 위해 최적화됩니다. 동 방법은 삽입물과 식물 게놈 간의 영역 내에서 독특한 DNA 서열을 이용합니다. 이 서열은 품목 Bt11 옥수수 특유의 것이므로 동 방법에 품목 특이성을 부여합니다.

2.1 정밀도/정확성/역동 범위/LOQ/LOD

정밀도, 정확성, 역동 범위, LOQ 및 LOD를 결정하기 위해, 다음 실험 설계가 8개의 독립 실행에서 실시되었습니다.

보정 샘플들(Std1 내지 Std6)은 이식 유전자를 가지지 않은 옥수수 DNA 바탕에서 100%; 10%; 5%; 1%; 0.5% 및 0.1%의 품목 Bt11 DNA를 갖춘 총 50 ng/μl (250 ng/반응)의 게놈 DNA 용액을 준비함으로써 생산되었습니다. Bt11 표준 및 PCR 반응 내의 해당 총 게놈의 DNA 함량의 희석 구성이 표 4에 표시되어 있습니다.

보정 곡선은 각 Bt11% 함량의 로그에 대한 보정 샘플들의 평균 △Ct 값들을 좌표에 표시함으로써 형성되며, 보정 곡선(y = ax + b)의 기울기(a)와 절편(b)을 사용하여 그들의 정규화 △Ct 값들에 근거하여 기준 샘플의 평균 Bt11% 함량을 계산합니다.

시약의 순도를 검증하기 위해 시스템 당 3개의 음성 대조(NTC)를 실행하였습니다. 각 기준 샘플(이식 유전자를 가지지 않은 옥수수 DNA 바탕에서 다른 비율의 품목 Bt11 DNA 포함)은 반응 당 250 ng 게놈 DNA에서 3회 분석되었습니다.

Adh1 시스템의 경우 3-19 그리고 품목 Bt11 고유 검출 시스템의 경우 3-21의 베이스라인 설정을 사용함으로써 데이터 분석이 이루어졌습니다. 문턱값들은 다음과 같습니다: ABI 7900 HT 검출 시스템 상의 0.4 (Adh1) 및 0.7 (Bt11).

5개 샘플 각각의 경우(이식 유전자를 가지지 않은 옥수수 DNA 내에서 5.0%에서 0.08%에 이르는 품목 Bt11 DNA), 정확성과 반복성을 결정하기 위해 정량화 결과의 표준 편차(STDEV) 및 상대 표준 편차(RSD_r)뿐만 아니라 평균값(MEAN) 및 기대값으로부터의 상대 편차(BIAS)가 계산되었습니다. 그 결과가 표 5에 제시되어 있습니다.

기대(참) 값으로부터의 평균값의 상대 편차의 범위는 전체 역동 범위에 걸쳐 -13.8%와 0% 사이였습니다.

Bt11 농도가 5.0%에서 0.08% 사이인 모든 샘플의 정밀도(반복성 표준 편차 RSD_r) 값의 범위는 5.9% 내지 16.3%의 상대 표준 편차였습니다.

동 방법의 상대 검출 한계(LOD)는 250 ng의 총 옥수수 DNA에서 0.04% 이하인 것으로 확정되었습니다.

동 방법의 상대 정량 한계(LOQ)는 250 ng의 총 옥수수 DNA에서 0.08% 이거나 그이하입니다.

2.2 증폭 효율 및 R² 계수

품목 Bt11 특이(단일) PCR 시스템의 증폭 효율(E) 및 R² 계수에 연결하기 위해 로그에 대비한 품목 Bt11 Ct 값에 대한 직선형 회귀분석[% Bt11 함량]이 실시되었습니다. 8회 독립 실행의 표준에 대한 회귀선들이(상기 2.1항 참조) 평가되었고 기울기, 절편 및 R²를 포함한 회귀분석 매개변수들이 확정되었습니다. 증폭 효율은 다음 등식에 의해 계산되었습니다: E = [10^{(-1/기울기)}] - 1. 결과는 표 6에 제시되어 있습니다.

△Ct에 근거한 품목 Bt11 검출 방법의 증폭 효율(E) 및 R² 계수를 평가하기 위해 로그에 대비한 △Ct 값에 대한 직선형 회귀분석[% Bt11 함량]이 실시되었습니다. 8회 독립 실행의 표준에 대한 회귀선들이(4.3항 참조) 평가되었고 기울기, 절편 및 R²를 포함한 회귀변수들이 결정되었습니다. 증폭 효율은 다음 등식에 의해 계산되었습니다: E = [10^{(-1/기울기)}] -1. 결과는 표 7에 제시되어 있습니다.

동 방법의 확고성을 평가하기 위해 다양한 마스터 믹스 농도 및 아닐링 온도 하에서 PCR 반응들이 실시되었습니다.

주요 반응 성분들의 농도 변화에 관한 양 검출 시스템들의 안정성을 평가하기 위해 +20% 및 -20%의 마스터 믹스 농도에서 실험이 실시되었습니다. 3개 샘플(이식 유전자를 가지지 않은 옥수수 DNA에서 0.080%, 0.90% 및 5.0%의 품목 Bt11 DNA)이 반응 당 250 ng 게놈 DNA에서 분석되었습니다. 3회의 평균이 표 8에 제시되어 있습니다.

다양한 아닐링 온도의 영향을 평가하기 위해 3개 샘플(비 GM 옥수수 DNA배경에서 0.080%, 0.90% 및 5.0%의 품목 Bt11 DNA)이 ABI 7900 HT 서열 검출 시스템에서 58℃ 및 62℃의 아닐링 온도로 반응 당 250 ng 게놈 DNA에서 분석되었습니다. 결과가 표 9에 제시되어 있습니다.

다른 실시간 PCR 플랫폼들의 영향을 평가하기 위해 3개 샘플(비 GM 옥수수 DNA배경에서 0.080%, 0.90% 및 5.0%의 품목 Bt11 DNA)이 ABI PRISM® 7700, 7500 고속 (비고속 모드로 실행) 및 Stratagene Mx 3005P 검출 시스템 각각에서 반응 당

250 ng 게놈 DNA에서 분석되었습니다. 각 샘플에 대해 얻은 2개 정량화 결과가 표 10에 제시되어 있습니다.

재현성 조건 하에서 시험 결과를 평가하기 위해, 2회의 정량화가 2개의 다른 실험실 Lab 1 및 Lab 2에서 실시되었습니다. 0.08% - 5.0% Bt11 DNA의 농도를 함유하는 다른 샘플들이 다른 서열 검출 시스템에서 반응 당 250 ng 게놈 DNA에서 분석되었습니다(각각 3회). 표 11은 각 실험실에서 각 Bt11 DNA 농도에 대해 얻은 2개 정량화 결과를 보여줍니다. 재현성 표준 편차(RSD_R)는 0.08% Bt11 농도에서 약 9.0%로 계산되었습니다.

여기에 서술된 정량화 방법은 유전자 변형 식품 및 사료를 위한 EU집행위원회 산하 연구소(CRL-GMFF)인 EU 집행위원회 공동 연구 센터(JRC, 건강 및 소비자 보호 연구소의 생명공학 및 GMO 조직)에 제출되었습니다. JRC는 12개 실험실들을 포함하는 국제 공동 연구를 조직하였습니다. 각 실험실은 0.09%, 0.40%, 0.90%, 5.00% 및 8.00%를 포함하는 5개 Bt11 DNA 농도를 시험하였습니다. 본 다수 실험실 검증 연구는 CRL 출판물 CRLVL10/07VR (2008)에 출판되었으며, 월드 와이드 웹의 gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/에서 볼 수 있습니다. 동 방법은 0.99의 평균 직선성 계수(R²) , 0.09%의 Bt11 농도에서 17%의 RSD_r, 0.09%의 Bt11 농도에서 24%의 RSD_R, 및 5%의 Bt11 농도에서 -5%의 최고 바이어스(참) 값을 나타냈습니다.

예 3. 종래 방법의 평가

기타 품목 Bt11 정량화 아쎄이들이 발표되었습니다 (Ronning et al, 2003. Eur. Food Res. Technol. 216:347-354 및 European Commission JRC Community Reference Laboratory (CRL) 발행 2004, 월드 와이드 웹의 gmo-crl.jrc.it//summaries/Bt11-protocol.pdf에 위치. 이것은 Ronning 등의 방법에 근거함).

이 정량화 방법을 평가하기 위해, 위에 언급한 CRL 출판물에 서술된 대로 Bt11 DNA 및 이식 유전자를 가지지 않은 DNA의 혼합물에 대한 PCR 아쎄이들이 독립적 실험실에 의해 실시되었습니다. 이 아쎄이는 3’ 게놈-삽입 영역에 결합되도록 설계된 시발체와 프로브들을 사용합니다. 다수 실험의 결과 이 방법을 사용하는 Bt11 반응의 PCR 효율은 부적합한 것으로 나타납니다. Bt11 표준 회귀선의 기울기는 adh1 표준 회귀선에 비해 PCR 효율이 부족함을 나타냅니다. 6회의 실험 중 5회에서, Bt11 및 adh1 표준 시리즈를 위해 사용한 DNA 용액이 동일한 경우에 Bt11 표준 반응의 상관 관계는 adh1 표준 반응에 비해 빈약하였습니다. 나아가 결과는 종래의 방법이 정밀성, 반복성 및 확고성에 있어서도 결함이 있을 수 있음을 나타냅니다.

본 명세서에 인용된 모든 출판물과 발표된 특허 문서들은 마치 각 개별 출판물이나 특허 문서가 특정적으로 개별적으로 언급에 의해 편입되는 것처럼 같은 정도로 언급에 의해 여기에 편입됩니다.

SEQUENCE LISTING <110> Syngenta Participations AG <120> Improved method for quantifying DNA in a biological sample <130> 72563P1 <150> 61/218,155 <151> 2009-06-18 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11-ev-f1 forward Bt11 primer <400> 1 tgtgtggcca tttatcatcg a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11-ev-r5 Bt11 reverse primer <400> 2 cgctcagtgg aacgaaaact c 21 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11-ev-p1 Bt11 probe <400> 3 ttccatgacc aaaatccctt aacgtgagt 29 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11 5` amplicon <400> 4 tgtgtggcca tttatcatcg acttccatga ccaaaatccc ttaacgtgag ctttcgttcc 60 actgagcg 68 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZmAdh1-F forward primer <400> 5 cgtcgtttcc catctcttcc t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zmadh1-R reverse primer <400> 6 ccactccgag accctcagtc 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZmAdh1-P probe <400> 7 aatcagggct cattttctcg ctcctca 27 <210> 8 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adh1 amplicon <400> 8 cgtcgtttcc catctcttcc tcctttagag ctaccactat ataaatcagg gctcattttc 60 tcgctcctca caggctcatc tcgctttgga tcgattggtt tcgtaagtgg tgagggactg 120 agggtctgga gtgg 134

Claims

옥수수 핵산들로 구성되는 생물학적 샘플 내에서 품목 Bt11 DNA를 정량화하는 방법, 동 방법은 다음과 같이 구성됩니다:
(a) SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 첫 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 3으로 구성되는 형광 염료 표지 프로브로 상기 생물학적 샘플 접촉, 여기서 첫째 시발체 쌍은 품목 Bt11 옥수수의 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 4로 구성되는 첫째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 첫째 앰플리콘은 품목 Bt11의 진단적임;
(b) SEQ ID NO: 5로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 6로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 둘째 시발체 쌍과 SEQ ID NO: 7으로 구성되는 둘째 형광 염료 표지 프로브로 상기 생물학적 샘플 접촉, 여기서 둘째 시발체 쌍은 옥수수 게놈 DNA와의 핵산 확장 반응에서 사용되는 경우 SEQ ID NO: 8로 구성되는 둘째 앰플리콘을 생성하며 그리고 여기서 둘째 앰플리콘은 옥수수 adh1 유전자의 존재를 나타냄;
(c) 핵산 확장 반응 상태 및 정량적 실시간 PCR을 실시할 수 있는 PCR 기구 제공;
(d) (a) 및 (b)의 시발체와 프로브를 사용하여 정량적 실시간 PCR을 실시하고 이에 의해 상기 첫째 앰플리콘과 상기 둘째 앰플리콘을 생산;
(e) 상기 첫째 앰플리콘 및 상기 둘째 앰플리콘이 상기 PCR 기구에 의해 생성될 때 그들을 동시에 검출; 및
(f) 상기 첫째 앰플리콘의 상대량을 상기 둘째 앰플리콘에 비교하여 계산, 여기서 상기 첫째 앰플리콘의 양은 상기 생물학적 샘플에서 Bt11 DNA의 양을 나타냄.
제1항에 있어서, 상기 방법의 정량 한계(LOQ)가 0.08% Bt11 DNA 농도이거나 그 이하인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 검출 한계(LOD)가 0.04% Bt11 DNA 농도이거나 그 이하인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 평균 직선성 계수(R²)가 최소한 0.99인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 재현성 표준 편차(RSD_R)가 0.090%의 Bt11 DNA 농도에서 24% 이거나 그 이하인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 상대 반복성 표준 편차(RSD_r)가 0.090%의 Bt11 DNA 농도에서 17% 이거나 그 이하인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법의 충실성 값이 전체 역동 범위에 걸쳐 ±5% 이거나 그 이하인 방법.
생물학적 샘플 내에 옥수수 품목 Bt11 DNA 틀이 있을 때 함께 기능하여 옥수수 품목 Bt11의 진단적인 앰플리콘을 생산하는 SEQ ID NO: 1로 구성되는 첫째 시발체 및 SEQ ID NO: 2로 구성되는 둘째 시발체로 이루어지는 시발체 쌍.
SEQ ID NO: 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 프로브.