CN102482697B - 用于定量生物样品中dna的改良方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了定量生物样品及其组合物中对命名为Bt11的转基因玉米事件为独特的核酸的改良方法。本发明还涉及在所述方法中使用的对事件Bt11为独特的引物对。

Description

用于定量生物样品中DNA的改良方法
背景
本发明涉及定量生物样品中对命名为Bt11的转基因玉米事件为独特的核酸的改良方法并且涉及在开展所述方法中有用的组合物。
随着实施关于转基因作物植物的规定，例如欧盟委员会(EC)第1139/98号规定、EC第49/2000号规定和EC第50/2000号规定，需要精确测量来自转基因物种中的DNA的水平，其中所述的DNA可能存在于例如用于食物的谷类中。因为欧盟委员会常务委员会在1999年制定的用于标记的阈值是1％，故检测并定量来自这些转基因植物的DNA的分析方法已经特别受到众多关注。
可以通过任何熟知的核酸检测方法，包括但不限于使用多核苷酸引物的热扩增法(聚合酶链反应(PCR))或使用核酸探针的DNA杂交法，检测转基因的存在。一般而言，为简化和统一在检测已用于转化多个植物品种的特定DNA构建体中使用的试剂和方法学，这些检测方法通常侧重于频繁所用的遗传元件，例如，启动子、终止子和标记基因，因为对于许多DNA构建体而言编码序列区是可互换的。因此，此类方法可能无法用于区分仅就编码序列而言不同的构建体。此外，此类方法可能无法用于区分不同的转基因事件，尤其使用相同DNA构建体所产生的那些转基因事件。
为区别转基因事件，已经开发了事件特异性PCR方法。异源DNA构建体插入植物的基因组中产生在整合的DNA序列与植物基因组序列之间的单一事件特异性接点。已经开发用于转基因事件的事件特异性定量PCR(qPCR)方法，包括用于Bt11的一种事件特异性定量PCR方法。可能限制此类方法应用的因素可以包括，例如，初始DNA浓度的影响、管理机构制定的标准、引物和PCR方案的选择、样品与样品的重复性、不同实验室之间的重现性和低水平检测与高灵敏度的阈值。
出于前述原因，对于改善定量检测生物样品中来自Bt11转基因玉米事件的核酸存在需求。
发明简述
本发明涉及命名为Bt11的转化玉米(玉蜀黍(Zea mays))事件，其包含两个异源表达盒，一个异源表达盒包含cry1Ab编码序列，所述的cry1Ab编码序列编码对Bt11玉米植物赋予抗虫性的Cry1Ab杀虫蛋白，并且另一个异源表达盒包含pat编码序列，所述的pat编码序列编码对Bt11玉米植物赋予草铵膦除草剂抗性的PAT蛋白。Bt11事件的产生在其内容因而通过引用方式并入的美国专利号6,114,608中描述。这两个表达盒插在第8号染色体长臂上的15cM区域内，接近第117位置并且处于侧翼分布有两个公用标记ZIB3和UMC150a的间隔内。
本发明提供用于生物样品中相对于内源性玉米(Zea mays)adh1基因定量检测Bt11-特异性DNA的组合物和改良方法。这种对Bt11DNA在例如包含Bt11谷粒和非Bt11谷粒的玉米粒混合物中的定量基于设计旨在检测Bt11中5′连接序列的引物对和探针。
在本发明的一个方面，提供一种定量包含玉米核酸的生物样品中事件Bt11DNA的方法，其中该方法包括(a)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的第一对引物和包含SEQ ID NO：3的荧光染料标记探针接触，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第一对引物产生包含SEQ ID NO：4的第一扩增子并且其中所述第一扩增子用于确定事件Bt11；(b)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO：5组成的第一引物和由SEQ ID NO：6组成的第二引物的第二对引物和包含SEQ ID NO：7的第二荧光染料标记探针接触，其中在具有玉米基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第二对引物产生包含SEQ ID NO：8的第二扩增子，并且其中所述第二扩增子指示玉米adh1基因的存在；(c)提供能够进行定量实时PCR的核酸扩增反应条件和PCR仪；(d)使用(a)和(b)的引物和探针进行定量实时PCR，因而产生所述的第一扩增子和所述的第二扩增子；(e)当第一扩增子和第二扩增子由所述PCR仪产生时，同时检测它们；并且(f)与所述第二扩增子比较计算所述第一扩增子的相对量，因而第一扩增子的量指示Bt11DNA在生物样品中的量。
在另一个方面中，本发明提供了包含由SEQ ID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的一对引物，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的PCR中使用时，该对引物产生包含用于确定玉米事件Bt11的SEQ ID NO：4的扩增子。
在又一个方面，本发明提供由SEQ ID NO：3组成的多核苷酸探针，其中用荧光染料在5′和3’端标记时，所述的多核苷酸探针用于检测和定量Bt11扩增子的RT-qPCR中。
本发明的前述和其他方面将会因以下详细描述变得更显而易见。
对序列表中序列的描述
SEQ ID NO：1是Bt11-5For引物。
SEQ ID NO：2是Bt11-5Rev引物。
SEQ ID NO：3是Bt11探针。
SEQ ID NO：4是Bt11qPCR扩增子。
SEQ ID NO：5是Zmadh1-F引物。
SEQ ID NO：6是Zmadh1-R引物。
SEQ ID NO：7是Zmadh1-P探针。
SEQ ID NO：8是adh1qPCR扩增子。
发明详述
提供以下定义以更好定义本发明并引导本领域技术人员实施本发明。除非另外说明，本文中所用的术语将根据相关领域技术人员的常规用法进行理解。分子生物学中常见术语的定义也可以在Rieger等人，《经典遗传学和分子遗传学词汇》(Glossary of Genetics：Classical and Molecular)，第5版，Springer-Verlag：New York，1994中找到。本文中使用如37C.F.R.§1.822中所述的DNA碱基和氨基酸命名。
PCR方法的“准确度”意指在试验结果和接受的参比值之间的接近程度。
“扩增效率”意指每个循环中以100％效率导致-3.32理论斜率的扩增速率。反应的效率可以由以下等式计算：效率＝[10(-1/斜率)]-1。
如本文中所用，术语″扩增(amplified)″意指使用至少一个某核酸分子作为模板构建该核酸分子的多个副本或与该核酸分子互补的多个副本。扩增体系包括，但不限于聚合酶链反应(PCR)体系、连接酶链反应(LCR)体系、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-Beta复制酶体系、基于转录的扩增体系(TAS)和链置换扩增(SDA)。见，例如，《诊断分子微生物学：原理和应用》(Diagnostic Molecular Microbiology：Principles andApplications)，D.H.Persing等人编著，美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，Washington，D.C.(1993)。扩增的产物命名为扩增子。
线性系数(R2)”是通过线性回归分析所获得的标准曲线的相关系数。
如本文中所用的“动态范围”意指Bt11DNA浓度的范围，在所述范围内本发明的方法以线性方式以可接受水平的准确度和精密度进行。
如本文中所用，术语转基因″事件″指通过用异源DNA(例如，包括目的基因的表达盒)转化植物细胞或组织并使其再生而产生的重组植物。术语“事件”指包含该异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也指通过转化体与另一个玉米品系之间的有性远交产生的子代。甚至与轮回亲本反复回交后，插入的DNA和来自转化亲本的侧翼DNA存在于杂交子代中相同的染色体位置处。术语“事件”也指来自原始转化体的包含所插入DNA和与插入DNA紧邻的侧翼基因组序列的DNA，其中预期所述的DNA转移至子代，所述子代因包括该插入DNA的一个亲本系(例如，原始转化体和因自交产生的子代)与不含所述插入DNA的亲本系的有性杂交而接受包含目的转基因的插入DNA。通常，植物组织的转化产生多个事件，其中每一者代表DNA构建体插入植物细胞基因组中的不同位置。基于转基因或其他想要特征的表达，选择特定事件。因而，“事件Bt11”、“Bt11”或“Bt11事件”可以互换地使用。
如本文中所用的″表达盒″意指能够指导特定核苷酸序列在适宜宿主细胞中表达的核酸分子，其包含与目的核苷酸序列有效连接的启动子，其中所述的目的核苷酸序列与终止信号有效连接。它一般还包含为正确翻译该核苷酸序列所需的序列。表达盒也可以包含这类序列，它们是指导目的核苷酸序列表达时不必需的，但是因用于从表达载体移出该表达盒的便利限制性位点而存在。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意指该表达盒的组分至少之一相对于该表达盒的其他组分至少之一是异源的。表达盒也可以是一种表达盒，其天然地存在，但已经以用于异源表达的重组形式获得。然而，一般而言，表达盒相对于宿主是异源，即，该表达盒的特定核酸序列不天然存在于宿主细胞中并且必须已经由本领域已知的转化方法导入宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以处于组成型启动子或处于仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时才启动转录的诱导型启动子控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子也可以是针对特定组织、或器官或发育阶段为特异的。当转化到植物中时，表达盒或其片段也可以称作“插入的序列”或“插入序列”。
″基因″是限定的区域，其位于基因组内部并且除编码序列之外，还可以包含负责控制表达也即转录和翻译编码部分的其他(主要是调节性)核酸序列。基因也可以包含其他的5′和3′非翻译序列和终止序列。可以存在的其他元件例如是内含子。
″异源″核酸序列是与导入该核酸序列的宿主细胞不天然结合的核酸序列，包括天然存在核酸序列的多个非天然存在副本。
“检测限(LOD)”是样品中可以可靠检出，但不必然定量的DNA最低量或浓度。本发明方法的LOD将小于目标浓度的二十分之一。本发明的方法将会在至少95％的时间以所述LOD检测到Bt11DNA的存在，从而确保≤5％假阴性结果。
“定量限(LOQ)”是可以用可接受水平的精密度和准确度可靠定量的样品中Bt11DNA的最低量或浓度。本发明方法的LOQ将在RSDr  ≤25％的情况下小于目标浓度值的十分之一。目标浓度意图作为与立法要求相关的阈值。
“实用性”意指操作的便易性、实现的可行性和效率和/或本文中所述方法的相关单位成本(例如$/样品)。
如本文中所用的“引物”是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补性靶DNA链复性以形成引物和靶DNA链之间的杂交体，并且随后由聚合酶(如DNA聚合酶)沿靶DNA链延伸。引物对或组可以用于核酸分子的扩增，例如，通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。
“探针”是与常规的可检测标记物或报道分子(如化学发光物质、放射性同位素、配体或酶)连接的分离核酸。这种探针与自玉米事件Bt11或常规玉米品系的DNA链互补。Bt11的DNA可以来自Bt11玉米植物或来自包含源自Bt11的DNA的样品。本发明的探针包含与靶DNA序列特异性结合并且可以用来检测这种靶DNA序列存在的脱氧核糖核酸或核糖核酸和聚酰胺及其他探针材料。
引物和探针通常具有10和15个之间或更多个核苷酸长度。引物和探针也可以具有至少20个或更多个核苷酸长度，或至少25个核苷酸或更多，或至少30个或更多个核苷酸长度。此类引物和探针在高严格性杂交条件下与靶序列特异性杂交。本发明的引物和探针可以与靶序列具有完全的序列互补性，不过可以通过常规方法设计与靶序列不同并保持与靶序列杂交的能力的探针。
如本文中所用，“重复性标准偏差(RSDr)”是在重复性条件下获得的试验结果的标准偏差。“重复性条件”是这样的条件，其中使用相同设备，由相同操作人员在相同的实验室中对相同的测试项目用相同的方法在短间隔时间内获得试验结果。
如本文中所用，“重现性标准偏差(RSDR)”是在重现性条件下获得的试验结果的标准偏差。“重现性条件”是这样的条件，其中使用不同设备，由不同操作人员在不同的实验室中对相同的测试项目用相同的方法获得试验结果。重现性标准偏差描述实验室间变异。
方法的“稳健性”是该方法保持不受背离程序中所述实验条件的微小但人为偏差所影响的能力的测度。
方法的“特异性”指该方法与目的特征或分析物专门对应的属性。例如，实施例1中所述PCR方法(其使用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中公开的引物)的特异性专门检测Bt11DNA。
方法的“真实性”是从庞大系列试验结果中获得的平均值与接受的参比值之间的接近程度。真实性的量度一般以偏差百分数表述。本发明的方法在整个动态范围内具有±5％的真实性。
如本文中所用，术语对Bt11“独特”特别意指作为事件Bt11的特征或用于确定事件Bt11。因此，对事件Bt11独特的核酸不存在于其他非Bt11玉米植物中。
本发明涉及用于生物样品中相对于内源性玉米adh1基因定量检测Bt11-特异性DNA的组合物和改良方法。这种对Bt11DNA在例如包含Bt11谷粒和非Bt11谷粒的玉米粒混合物中的定量基于设计旨在检测Bt11中5′连接序列的引物对和探针。
在本发明的一个实施方案中，本发明包括一种定量包含玉米核酸的生物样品中事件Bt11DNA的方法，该方法包括(a)使所述生物样品与包含由SEQID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的第一对引物和包含SEQ ID NO：3的荧光染料标记探针接触，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第一对引物产生包含SEQ IDNO：4的第一扩增子并且其中所述第一扩增子用于确定事件Bt11；(b)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO：5组成的第一引物和由SEQ ID NO：6组成的第二引物的第二对引物和包含SEQ ID NO：7的第二荧光染料标记探针接触，其中在具有玉米基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第二对引物产生包含SEQ ID NO：8的第二扩增子，并且其中所述第二扩增子指示玉米adh1基因的存在；(c)提供能够进行定量实时PCR的核酸扩增反应条件和PCR仪；(d)使用(a)和(b)的引物和探针进行定量实时PCR，因而产生所述的第一扩增子和所述的第二扩增子；(e)当第一扩增子和第二扩增子由该PCR仪产生时，同时检测它们；并且(f)与所述第二扩增子比较计算所述第一扩增子的相对量，因而第一扩增子的量指示Bt11DNA在生物样品中的量。
在该实施方案的一个方面，该方法具有小于或等于0.08％Bt11DNA浓度的定量限(LOQ)。
在该实施方案的另一个方面，该方法具有小于或等于0.04％Bt11DNA浓度的检测限(LOQ)。
在该实施方案的又一个方面，该方法具有至少0.99的平均线性系数(R2)。
在该实施方案的再一个方面，该方法在0.090％的Bt11DNA浓度具有24％或更小的相对重现性标准偏差(RSDR)。
在该实施方案的再一个方面，该方法在0.090％的Bt11DNA浓度具有17％或更小的相对重复性标准偏差(RSDr)。
在该实施方案的又一个方面，该方法在整个动态范围内具有±5％或更小的真实值。
在另一个实施方案中中，本发明包括包含由SEQ ID NO：1组成的第一引物和由SEQ ID NO：2组成的第二引物的一对引物，所述引物对在PCR中在生物样品中存在玉米事件Bt11DNA模板的情况下一起发挥作用以产生用于确定玉米事件Bt11的扩增子。
在该实施方案的一个方面，扩增子包含SEQ ID NO：4。
在又一个实施方案中，本发明包括荧光染料标记的探针，其包含SEQ IDNO：3。
以下实施例仅意图说明本发明的一个或多个优选实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1.Bt11定量RT-qPCR方法开发
本实施例描述了用于确定生物样品中事件Bt11DNA相对于总玉米DNA的相对量的改良Bt11-特异性实时定量PCR(RT-qPCR)方法。
Figure BDA0000133047380000081
(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定法是在PCR反应进展期间直接监测PCR产物累积的RT-qPCR检测技术。每个扩增循环期间TaqDNA聚合酶5′至3′外切核酸酶活性对靶特异性探针分子的降解导致荧光的累积。增加的荧光水平与PCR产物的累积直接相关并且在每个扩增循环期间通过使用专用PCR仪器，例如，不限于，ABI PRISMTM 770或ABI PRISMTM 7900HT(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行检测。
根据荧光超过背景以上特定水平的循环，循环阈值(Ct)由PCR仪自动赋予每份样品。反应开始时具有较高水平模板的样品将会更快地扩增至可检测的水平并且产生较低的Ct。为将试样中事件Bt11DNA的量定量，使用校准样品的归一化ΔCt值来通过线性回归计算参比曲线ΔCt-式。随后测量未知样品的归一化ΔCt，并且借助计算出的回归公式估计未知样品中Bt11事件DNA的相对量本文中所述的
Figure BDA0000133047380000082
测定法可以用来精确地定量Bt11DNA相对于内源性校准物玉米基因的水平。因为内源性校准物序列相对于总玉米基因组DNA保持恒定，故Bt11-特异性DNA相对于内源性基因的相对水平的任何变动显示拷贝数的差异。
1.1用于事件Bt11玉米的事件特异性PCR体系
基于涉及DNA插入物及其侧翼5′和3′边界序列的序列信息，测试从事件Bt11的插入物和因组DNA之间的两个连接区衍生的PCR体系。在寡核苷酸设计软件(Primer ExpressTM V2.0)辅助下，设计针对5′边界的三个探针和六条扩增引物，并且设计针对3′边界的一个探针和三条扩增引物。随后实验地测试这些引物和探针的全部可能组合。
对Ct值、ΔRn值、扩增曲线形状和PCR效率的比较产生被选择用于进一步优化的一个引物对/探针组合。
优选的引物对和探针位于5′基因组-插入物接点处，其产生比3′接点引物更好的结果。正向引物位于基因组DNA中，反向引物的结合位点位于事件Bt11插入物内部，因而该探针跨越5′基因组-插入物接点。为特异性检测事件Bt11DNA，使用以下引物扩增与异源插入物DNA和在插入物5’端侧翼存在的玉米基因组DNA重叠的68-bp核酸片段：
Bt11-ev-f1：5′-TGTGTGGCCATTTATCATCGA-3’(SEQ ID NO：1)
Bt11-ev-r5：5′-CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3′(SEQ ID NO：2)。
借助以下靶-特异性寡核苷酸探针在每个循环(实时)测量PCR产物：
Bt11-ev-p1：5′-TTCCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-3′(SEQ IDNO：3)
其中所述的寡核苷酸探针在其5’端以报道染料(荧光素(FAM))标记，并且在其3’端以猝灭染料(四甲基罗丹明(TAMRA))标记。
在具有Bt11玉米DNA作为模板的反应中使用这些引物产生了包含SEQID NO：4的扩增子，所述扩增子对事件Bt11为独特并且用于确定事件Bt11。
1.2玉米-特异性参比PCR体系(Adh1)
为相对地定量事件Bt11DNA，使用扩增玉米(Zea mays)内源性醇脱氢酶1基因(adh1)(Genbank登录号AY691949)的135-bp片段的预存玉米-特异性参比PCR体系(Hernandez等人2004.J.Agric.Food Chem.52：4632-4637)作为特异性检测玉蜀黍序列的参比体系。该参比体系使用以下引物：
Zmadh1-F：5′-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT-3′(SEQ ID NO：5)
Zmadh1-R：5′-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3′(SEQ ID NO：6)
借助以下靶-特异性寡核苷酸探针在每个循环(实时)测量PCR产物：
Zmadh1-P：5′-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3′(SEQ ID NO：7)
其中所述的寡核苷酸探针在其5’端以VICTM(Applied Biosystems，FosterCity，CA)染料标记，并且在其3’端以TAMRA标记。
在具有玉米DNA作为模板的反应中使用这些引物产生了包含SEQ IDNO：8的扩增子，所述扩增子指示玉米adh1的存在。
1.1校准曲线的计算
校准曲线由250ng玉米DNA总量中含有固定百分数Bt11DNA的5份样品组成。Bt11DNA在标准样品中的浓度从10％变动至0.08％。通过将校准样品的ΔCt值对相应Bt11％浓度的对数作图产生校准曲线；校准曲线(y＝ax+b)的斜率(a)和截距(b)随后用来基于双盲样品(b1ind sample)的归一化ΔCt值计算它们的平均Bt11％含量。
在TaqManTM反应期间，伴随ABI PRISMTM 7900HT仪的软件通过荧光的累积检测PCR产物的累积。将相对于已建立基线水平(ΔRn)归一化的荧光对循环数作图。通过划出贯穿反应的任意截值(cutoff)获得Ct值，从而该线穿过每个反应的对数期。伴随ABI PRISMTM 7900HT仪的序列检测系统软件提供循环数，其中在所述循环数上特定反应的荧光(PCR产物)的累积与阈值(Ct)交叉。将FAM Ct(Bt11)值与VIC Ct(adh1)值比较以相对于存在的总核酸水平归一化每个反应的FAM Ct值，以产生ΔCt[ΔCt＝Ct(FAM)-Ct(VIC)]。该计算除去由反应中不相等的模板输入所引起的任何变异。因为每基因组的内源性玉米基因的拷贝数保持恒定，故ΔCt的变化对应于Bt11DNA的量(或拷贝)的变化。通过未知样品的ΔCt值与已知对照的ΔCt值比较，获得ΔΔCt[ΔΔCt＝ΔCt(未知)-ΔCt(已知)]。随后可以使用ΔΔCt值，使用以下等式计算拷贝数：拷贝数＝2(ΔΔCt)。
1.2实时PCR建立
PCR在96孔反应平板中实施。该方法是一种简单体系，其中校准物玉米adh内源性测定法和靶Bt11测定法在独立的孔中同时进行。在两个反应管(一个反应管用于Bt11体系和一个反应管用于adh1体系)中，在冰上，以所列的顺序添加表1和2中的组分(除之DNA外)以制备主混合物。2X Sigma Jumpstart即用型混合物以550μl的1M MgCl2和20μl的10000x磺基罗丹明101补足。柔和混合并短暂离心。准备好另外两种反应管，一种反应管用于Bt11，并且一种反应管用于adh1主混合物、用于标准曲线DNA样品、未知DNA样品和对照DNA样品。添加正确量的主混合物(例如对于三个PCR重复，20x3＝60μl主混合物)至每只反应管。添加表1和2中所示的正确量的DNA(例如对于三个PCR重复，5x3＝15μl DNA)至每只反应管。
表1.用于玉米adh1参比体系的扩增反应混合物中每个反应孔的终体积/浓度。
Figure BDA0000133047380000111
表2.用于Bt11-特异性体系的扩增反应混合物中每个反应孔的终体积/浓度。
涡旋混合每只管大约10秒以帮助降低每份样品的各重复之间的变异性。在微量离心机中离心各管。等分25μl于每个PCR反应孔中。用光学盖板或光学帽密封反应平板。将平板以大约250x g在4℃至大约室温的范围离心大约1分钟。将平板置于PCR仪中并且以表3中所述的循环条件进行PCR。
表3.用于玉米Bt11/adh1体系的循环程序
Figure BDA0000133047380000113
1.3数据分析
在运行上文所述的实时PCR方案后，通过以下流程分析结果：
为设定阈值，以对数模式显示一个体系(例如Bt11)的扩增曲线。在其中扩增图谱为平行的曲线区域内(pCR的指数期)设定阈值线。根据需要更新Ct值。通过点击扩增曲线的Y轴切换至线性模式，并且检查先前设定的阈值落入该曲线的几何相内部。
为设定基线，确定阈值线与第一扩增曲线交叉的循环数，并且在该值之前三个循环设定该基线(例如，最早的Ct＝25，设基线在Ct＝25-3＝22交叉)。
对另一个体系(例如adh1体系)的扩增曲线重复上述流程。
在将阈值限定于上文所述的扩增对数期内部后，仪器的软件计算每个反应的Ct-值。通过针对校准点所测量的Ct-值对Bt11％含量的对数作图并且通过将线性回归线拟合入这些数据，产生参比Ct-曲线。此后，该回归公式用来估计Bt11DNA在未知DNA样品中的相对量。
针对从含有本领域已知的转基因玉米的样品中提取的DNA以实时PCR实验地测试Bt11测定法(正向/反向引物和探针)的特异性，其中所述的转基因玉米包括Bt11、Bt10、NK603、MON810、MON863、MON810x MON863、TC1507、MIR604、Bt176、GA21、MON88017、T25和
Figure BDA0000133047380000121
RW(DAS-59l22-7)。
结果显示，当使用每个反应100ng总DNA时，除阳性对照Bt11外，没有一个上文提及的受检转基因玉米品系在平行测定的样品(replicated sample)中产生扩增子。
实施例2.Bt11定量RT-qPCR方法的验证
优化实施例1中所述的方法以定量来自Bt11和常规玉米种子的混合物中的生物样品内的Bt11DNA。该方法利用在插入物与植物基因组之间区域内的单一DNA序列。该序列对事件Bt11玉米是特异的并且赋予此方法事件-特异性。
2.1精密度/准确度/动态范围/LOQ/LOD
为确定精密度、准确度、动态范围、LOQ和LOD，以八个独立试验实施以下实验设计。
通过制备在非转基因玉米DNA背景下具有100％；10％；5％；1％；0.5％和0.1％事件Bt11DNA的总基因组DNA的50ng/μl(250ng/反应)溶液产生校准样品(Std1至Std6)。在4表中显示Bt11标准物的稀释方案和PCR反应中相应的总基因组DNA含量。
表4.校准样品的稀释方案
Figure BDA0000133047380000131
通过将校准样品的平均ΔCT值对相应Bt11％含量的对数作图产生校准曲线；校准曲线(y＝ax+b)的斜率(a)和截距(b)随后用来基于参比样品的归一化ΔCT值计算它们的平均％Bt11含量。
每体系运行三个阴性对照(NTC)以验证试剂的纯度。以每个反应250ng基因组DNA一式三份分析每份参比样品(含有在非转基因玉米DNA背景下不同比例的事件Bt11DNA)。
数据分析已经通过使用Adh1体系的基线设置3-19和事件Bt11-特异性检测体系的基线设置3-2实现。阈值是：在ABI 7900HT检测体系上的0.4(Adh1)和0.7(Bt11)。
对于5份样品中的每份样品(范围从非转基因玉米DNA中的5.0％下至0.08％事件Bt11DNA)，计算定量结果的平均值(均数)、距离望值的相对偏差(偏差)以及标准偏差(STDEV)和相对标准偏差(RSDr)以确定准确度和重复性。结果在表5中显示。
表5.重复性条件下针对事件Bt11的8个独立PCR试验的定量结果。
a定量限(LOQ)
b检测限(LOD)
平均值距离期望(真)值的相对偏差在整个动态范围内在-13.8％和0％之间变动。
全部样品在5.0％和0.08％Bt11浓度之间的精密度(重复性标准偏差RSDr)值从5.9％变动至16.3％相对标准偏差。
确定所述方法的相对检测限(LOD)小于或等于250ng总玉米DNA中的0.04％。
确定所述方法的相对定量限(LOQ)小于或等于250ng总玉米DNA中的0.08％。
2.2扩增效率和R2系数
为评估事件Bt11-特异性(单一)PCR体系的扩增效率(E)和R2系数，进行事件Bt11Ct值与[％Bt11-含量]对数的线性回归分析。评价了8个独立试验的标准物的回归线(见上文2.1)，并且测定包括斜率、截距和R2在内的回归参数。扩增的效率由以下等式计算：E＝[10(-1/斜率)]-1。结果在表6中显示。
表6.事件Bt11-特异性回归线的回归参数和PCR效率
  斜率   截距   R2   E
  试验1   -3.48   31.7   1.000   0.94
  试验2   -3.61   31.9   0.999   0.89
  试验3   -3.48   31.7   0.999   0.94
  试验4   -3.53   31.8   0.999   0.92
  试验5   -3.51   31.7   0.999   0.93
  试验6   -3.40   31.5   1.000   0.97
  试验7   -3.57   31.6   0.999   0.90
  试验8   -3.55   31.5   1.000   0.91
  均数   -3.52   31.7   0.999   0.93
为评估基于ΔCt的事件Bt11检测方法的扩增效率E和R2系数，进行ΔCt值与[％Bt11-含量]对数的线性回归分析。评价了8个独立试验的标准物的回归线(见4.3)，并且已经测定包括斜率、截距和R2在内的回归参数。扩增的效率由以下等式计算：E＝[10(-1/斜率)]-1。结果在表7中显示。
表7.基于校准样品ΔCt值的校准曲线的回归参数和PCR效率。
  斜率   截距   R2   E
  试验1   -3.43   9.2   1.000   0.96
  试验2   -3.55   9.3   0.999   0.91
  试验3   -3.42   9.2   0.999   0.96
  试验4   -3.45   9.2   0.999   0.95
  试验5   -3.46   9.5   0.999   0.95
  试验6   -3.34   9.4   0.998   0.99
  试验7   -3.50   9.5   1.000   0.93
  试验8   -3.50   9.4   0.999   0.93
  均数   -3.46   9.3   0.999   0.95
为评估该方法的稳健性，在可变的主混合物浓度和复性温度下实施PCR反应。
对于涉及主要反应组分的浓度变化的两种检测体系的稳定性，在主混合物的+20％浓度和-20％浓度实施实验。以每个反应250ng基因组DNA分析三份样品(非转基因玉米DNA中的0.080％、0.90％和5.0％事件Bt11DNA)。一式三份的均数在表8中显示。
表8.在+/-20％主混合物情况下的定量结果
Figure BDA0000133047380000151
a排除一个离群值
为评估变动复性温度的影响，在ABI 7900HT序列检测系统上以58℃和62℃复性温度以每个反应250ng基因组DNA分析三份样品(非GM玉米DNA背景下的0.080％、0.90％和5.0％事件Bt11DNA)。结果在表9中显示。
表9.使用不同复性温度时的定量结果
Figure BDA0000133047380000161
为评估不同实时PCR平台的影响，在
Figure BDA0000133047380000162
7700、7500快速(以非快速模式运行)和Stratagene Mx 3005P检测系统上以每个反应250ng基因组DNA分析三份样品(非GM玉米DNA背景下的0.080％、0.90％和5.0％事件Bt11DNA)。在表10中显示对每份样品所获得的两个定量结果。
表10.使用不同平台时的定量结果
Figure BDA0000133047380000163
为评估重现性条件下的试验结果，在两个不同实验室Lab1和Lab2进行两个定量试验。在不同的序列检测系统上以每个反应250ng基因组DNA分析含有0.08％-5.0％Bt11DNA浓度的不同样品(每份样品一式三份)。表11显示在每间实验室对Bt11DNA的每个浓度所获得的两个定量结果。计算重现性标准偏差(RSDR)在0.08％Bt11浓度下为大约9.0％。
表11.在重现性条件下(实验室间)的定量结果。
Figure BDA0000133047380000171
将本文中所述的定量方法提交至作为欧盟基因修饰食品和饲料参比实验室(CRL-GMFF)的欧盟委员会联合研究中心(JRC，健康和消费者保护生物技术和GMO研究所联合体(Biotechnology and GMOs Unit of the Institute forHealth and Consumer Protection))。JRC组织一项涉及12个实验室的国际协作研究。每个实验室检验5个浓度的Bt11DNA，包括0.09％、0.40％、0.90％、5.00％和8.00％。这项多实验室验证研究的结果在互联网gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/处可获得的CRL公告中公布。该方法具有0.99的平均线性系数(R2)、在0.09％Bt11浓度下17％的RSDr、在0.09％Bt11浓度下24％的RSDR和在5％Bt11浓度下-5％的最高偏差(真实)值。
实施例3现有方法的评估
已经公布了其他的事件Bt11定量测定法(Ronning等人2003.Eur.FoodRes.Technol.216：347-354以及欧盟委员会JRC欧盟参比实验室(CRL)2004年在互联网gmo-crl.jrc.it//summaries/Bt11-protocol.pdf处公布，其基于Ronning等人的方法)。
为评估这种定量方法，由一个独立实验室对Bt11DNA和非转基因DNA的混合物如上文参考的CRL公告中所述那样进行PCR测定。该测定法使用设计旨在与3′基因组-插入物区结合的引物和探针。多个实验的结果提示使用这种方法时Bt11反应的PCR效率是不充分的。与adh1标准回归线相比，Bt11标准回归线的斜率提示缺乏PCR效率。在6个实验中的5个实验内，当针对Bt11和adh1标准物序列所用的DNA溶液相同时，Bt11标准反应的相关性比adh1标准反应更差。结果进一步提示先前方法可能具有精密度、重复性以及稳健性方面的缺陷。
本说明书中引用的全部出版物及公布的专利文件通过引用方式以相同的程度并入本文中，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份单独的出版物或专利文件。
Figure IDA0000133047410000011
Figure IDA0000133047410000021

Claims (10)

1.一种定量包含玉米核酸的生物样品中事件Bt11DNA的方法，该方法包括：
(a)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO:1组成的第一引物和由SEQID NO:2组成的第二引物的第一对引物和包含SEQ ID NO:3的荧光染料标记探针接触，其中在具有来自事件Bt11玉米的基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第一对引物产生包含SEQ ID NO:4的第一扩增子并且其中所述第一扩增子用于确定事件Bt11；
(b)使所述生物样品与包含由SEQ ID NO:5组成的第一引物和由SEQID NO:6组成的第二引物的第二对引物和包含SEQ ID NO:7的第二荧光染料标记探针接触，其中在具有玉米基因组DNA的核酸扩增反应中使用时，所述第二对引物产生包含SEQ ID NO:8的第二扩增子，并且其中所述第二扩增子指示玉米adh1基因的存在；
(c)提供能够进行定量实时PCR的核酸扩增反应条件和PCR仪；
(d)使用(a)和(b)的引物和探针进行定量实时PCR，因而产生所述的第一扩增子和所述的第二扩增子；
(e)当所述第一扩增子和所述第二扩增子由所述PCR仪产生时，同时检测它们；并且
(f)与所述第二扩增子比较计算所述第一扩增子的相对量，因而所述第一扩增子的量指示Bt11DNA在所述生物样品中的量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.08%Bt11DNA浓度的定量限(LOQ)。
3.权利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.04%Bt11DNA浓度的检测限(LOD)。
4.权利要求1所述的方法，其中所述方法具有至少0.99的平均线性系数(R2)。
5.权利要求1所述的方法，其中所述方法在0.090%的Bt11DNA浓度具有24%或更小的相对重现性标准偏差(RSDR)。
6.权利要求1所述的方法，其中所述方法在0.090%的Bt11DNA浓度具有17%或更小的相对重复性标准偏差(RSDr)。
7.权利要求1所述的方法，其中所述方法在整个动态范围内具有±5%或更小的真实值。
8.包含由SEQ ID NO:1组成的第一引物和由SEQ ID NO:2组成的第二引物的一对引物，所述引物对在生物样品中存在玉米事件Bt11DNA模板的情况下一起发挥作用以产生用于确定玉米事件Bt11的扩增子。
9.一种由SEQ ID NO:3组成的多核苷酸探针，其是荧光染料标记探针。
10.SEQ ID NO:3作为荧光染料标记探针的用途。
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