CN112029892A - 一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆zh10-6转化体特异性的方法 - Google Patents

一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆zh10-6转化体特异性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多重PCR方法快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10‑6转化体特异性的方法，该方法以转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的G2‑epsps和GAT外源插入基因序列设计合成特异性引物，通过引物浓度优化组合，构建转化体特异性鉴定多重PCR反应体系。本发明针对转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的外源插入序列的独特表达方式（插入了两个重复的G2‑epsps基因和一个GAT基因，形成了2个表达框和4个边界）设计了4对转化体特异性序列，引入大豆内源Lectin基因构建五重PCR反应体系，为基于外源目的基因的转基因转化体特异性鉴定提供了一种经济高效、准确可靠的高通量的技术手段。

Description

一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的 方法
技术领域
本发明属于农业转基因生物安全评价技术领域，特别是涉及一种转基因耐除草剂大豆转化体特异性多重PCR方法构建及其应用。
背景技术
随着转基因作物的商业化种植，转基因作物的安全性以及对人类健康和生态环境的潜在威胁倍受广大民众的广泛关注。我国农业部发布的“转基因植物安全评价指南”，为我国农业转基因生物安全评价提供了技术支撑。其中分子特征是转基因植物安全评价的重要组成部分，指转基因植物中外源DNA 片段在受体基因组中的整合、表达以及遗传稳定性等方面的信息，是建立转基因植物精准检测技术的依据。
目前，我国针对转基因植物安全评价的分子特征鉴定已建立了多种检测方法。蛋白质水平检测方法主要包括试纸条法、酶联免疫吸附法和生物传感器法；核酸水平检测方法主要包括普通PCR、实时荧光PCR 和环介导等温扩增PCR技术等。而多重PCR即复合PCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction，MPCR)可在一个反应体系内同时检测多个转基因成分，并且可以在一次反应中检测多个品系的转基因成分，相对于普通PCR 技术是一种经济、高效的检测手段，逐渐在转基因植物的分子特征鉴定中得到应用。尹全等根据抗草甘膦大豆MON89788分子特征，建立了除内源基因在外的3种外源基因的复合PCR检测体系；董立明等针对目前国内外已商品化应用最为广泛的5种转基因大豆建立了转基因大豆品系的六重PCR 检测技术，其检测灵敏度为0.1 %。
转基因耐草甘膦大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研究的转G2- epsps基因和GAT基因的耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有两个重复的G2-epsps基因和一个GAT基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，然后利用G2- EPSPS基因和GAT基因整合在受体基因组不同位置上的特性，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在我国具有重要产业化应用前景。目前还没有关于ZH10-6分子特征的检测方法研究的报道，本研究通过利用复合PCR技术检测ZH10-6的4个边界序列，建立其分子特征转化体特异性的鉴定方法，为该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。
发明内容
本发明提供了一种转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征转化体特异性多重PCR鉴定方法。本发明的鉴定方法具有高效、快速、经济、操作简便等优势。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物，其特征在于包括ZH10A（边界A）：
引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’ SEQ ID NO:1
反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’ SEQ ID NO:2
ZH10B（边界B）：
引物正向序列：5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCT-3’ SEQ ID NO:3
反向引物序列：5’- ATTCTAAAACGCTTTCTTCTTGCTA-3’ SEQ ID NO:4
ZH10C（边界C）：
引物正向序列：5’- CTAAACCTCTTAATGATACGGCTT-3’ SEQ ID NO:5
反向引物序列：5’- TCGTGACTGGGAAAACCCT-3’ SEQ ID NO:6
ZH10D（边界D）
引物正向序列：5’- ACCCTTGTTGAACGAGTGG-3’ SEQ ID NO:7
反向引物序列：5’- AGAAGAGTATTCGGGAAGCTAA -3’ SEQ ID NO:8。
本发明进一步公开了采用快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物快速鉴定的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
（1）用于鉴定转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征转化体特异性引物，其特征在于，包括ZH10A（边界A）引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’，反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’； ZH10B（边界B）引物正向序列：5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCT-3’，反向引物序列：5’- ATTCTAAAACGCTTTCTTCTTGCTA-3’； ZH10C（边界C）引物正向序列：5’- CTAAACCTCTTAATGATACGGCTT-3’，反向引物序列：5’-TCGTGACTGGGAAAACCCT-3’； ZH10D（边界D）引物正向序列：5’- ACCCTTGTTGAACGAGTGG-3’，反向引物序列：5’- AGAAGAGTATTCGGGAAGCTAA -3’；
（2）五重PCR反应体系为20 μL，包括：2×Green Mix(含缓冲液、dNTPs、
Figure 941905DEST_PATH_IMAGE001
2+)10 μL，8.5 μL引物预混液，1.0 μL DNA样品，0.5 μL灭菌超纯水补足20 μL；
引物预混液8.5 μL，包括：ZH10A-4F/ ZH10A-2终浓度10 μM各1.5 μL，ZH10B-1/ZH10B-2终浓度10 μM各0.75 μL，ZH10C-1/ ZH10C-2终浓度5μM各0.5 μL，ZH10D-3F/ZH10D-2终浓度5 μM各1 μL，Lectin基因终浓度2 μM各0.5 μL；
（3）扩增程序：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸7 min。取7μL PCR扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。
本发明更近一步公开了快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物在用于ZH10-6插入位点快速高效筛查方面的应用。实验结果显示本研究建立了转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种，包括大豆内源Lectin基因在内的4个转化体特异位点分子特征的五重PCR检测方法，具有良好的特异性。
本发明的重点是解决转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征方法建立，发明的难点在于根据转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的外源插入序列的独特表达方式（插入了两个重复的G2-epsps基因和一个GAT基因，形成了2个表达框和4个边界），分别于4个边界设计了4对转化体特异性序列，引入大豆内源Lectin基因构建了五重PCR反应体系，本发明的创新点在于为转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征转化体特异性鉴定建立了方法，为基于外源目的基因的转基因转化体特异性鉴定提供了一种经济高效、准确可靠的高通量技术手段。
本发明试验效果如下：
（1）以非转基因大豆受体ZH10、其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因棉花混样、转基因油菜混样、转基因大豆ZH10-6第一世代样品为测试样品，对五重PCR检测方法进行测试。结果见图1，应用五重PCR方法在非转基因大豆ZH10、其他转基因大豆混样、转基因大豆ZH10-6第三世代样品中扩增得到大豆内源Lectin基因，在转基因大豆ZH10-6第三世代样品中扩增得到4个转化体特异性序列，在玉米、水稻、棉花、油菜等4种作物的转基因混样中均未扩增到5种靶标成分，表明建立的转基因大豆ZH10-6分子特征转化体特异性五重PCR鉴定方法具有良好的特异性。
（2）将转基因大豆ZH10-6第一世代样品DNA用鲑鱼精进行梯度稀释，制备了 8份灵敏度测试样，样品DNA质量浓度分别为2.5，1.25，0.5，0.25，0.125，0.05，0.025，0.0125 mg﹒L-1。利用优化好的反应体系和反应程序进行五重PCR扩增。结果见图2，当DNA样品浓度M≥0.25 mg﹒L-1时，可获得全部5种靶标基因成分的特异性扩增产物，而当 DNA样品浓度为≤0.25 mg﹒L-1时，仅能获得部分预期扩增产物，表明该五重PCR方法对每种靶标基因的检出限为0.25 mg﹒L-1；按初始DNA浓度25 mg﹒L-1测算，相对检出限为0.1%，可满足转基因作物中转化体序列特异性位点的精确检测需求。
试验结论：
本研究建立了转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种，包括大豆内源Lectin基因在内的4个转化体特异位点分子特征的五重PCR检测方法。该检测方法具有良好的特异性，五重PCR检测体系的最适引物配比为（μmol/L）：0.75：0.375：0.125：0.25：0.05。对每种靶标的检测灵敏度可达到0.1%，适用于ZH10-6插入位点快速高效筛查。与现行标准中的常规PCR方法相比，本研究建立的五重PCR检测方法大大提高了检测效率，降低了检测成本，为转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种分子特征转化体特异性鉴定提供了一种经济高效、准确可靠的高通量技术手段。
附图说明
图1为转基因大豆ZH10-6第一世代样品分子特征转化体特异性多重PCR方法鉴定图谱；如图标注分别为1-2：CK；3-4：ZH10-6受体ZH10；5-6：转基因大豆混样；7-8：转基因玉米混样；9-10：转基因水稻混样；11-12：转基因油菜混样；13-14：转基因棉花混样；15-16：阳性对照ZH10-6；
图2为转基因大豆ZH10-6第一世代样品多重PCR方法灵敏度分析图谱；如图标注分别为1-8：模板DNA浓度依次为2.5，1.25，0.5，0.25，0.125，0.05，0.025，0.0125 mg﹒L-1；
图3为转基因大豆ZH10-6第三世代样品分子特征转化体特异性多重PCR方法鉴定图谱；如图标注分别为1-2：CK；3-4：ZH10-6受体ZH10；5-6：转基因大豆混样；7-8：转基因玉米混样；9-10：转基因水稻混样；11-12：转基因油菜混样；13-14：转基因棉花混样；15-16：阳性对照ZH10-6。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
（1）试剂：Promega公司生产的GO Taq
Figure 419766DEST_PATH_IMAGE002
Green Master Mix，2×预混液；上海生工合成的大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列扩增引物。包括ZH10A（边界A）：
引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’ SEQ ID NO:1
反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’ SEQ ID NO:2
ZH10B（边界B）：
引物正向序列：5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCT-3’ SEQ ID NO:3
反向引物序列：5’- ATTCTAAAACGCTTTCTTCTTGCTA-3’ SEQ ID NO:4
ZH10C（边界C）：
引物正向序列：5’- CTAAACCTCTTAATGATACGGCTT-3’ SEQ ID NO:5
反向引物序列：5’- TCGTGACTGGGAAAACCCT-3’ SEQ ID NO:6
ZH10D（边界D）
引物正向序列：5’- ACCCTTGTTGAACGAGTGG-3’ SEQ ID NO:7
反向引物序列：5’- AGAAGAGTATTCGGGAAGCTAA -3’ SEQ ID NO:8。
（2）以非转基因大豆受体ZH10、其他转基因大豆混样、转基因玉米混样、转基因水稻混样、转基因棉花混样、转基因油菜混样、转基因大豆ZH10-6第三世代样品为测试样品（农业部科技发展中心及北大荒垦丰种业有限公司提供），对五重PCR检测方法进行测试。
（3）五重PCR反应体系为20 μL，包括：2×Green Mix(含缓冲液、dNTPs、
Figure 885382DEST_PATH_IMAGE001
2+等)10μL，8.5 μL引物预混液，1.0 μL DNA样品，0.5 μL灭菌超纯水补足20 μL。引物预混液8.5 μL，包括：ZH10A-4F/ ZH10A-2终浓度10 μM各1.5 μL，ZH10B-1/ ZH10B-2终浓度10 μM各0.75μL，ZH10C-1/ ZH10C-2终浓度5μM各0.5 μL，ZH10D-3F/ ZH10D-2终浓度5μM各1 μL，Lectin基因终浓度2 μM各0.5μL。
（4）扩增程序：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸7 min。取7μL PCR扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。
（5）凝胶电泳：配置2 %琼脂糖凝胶，取10 μL上述PCR产物，120V，30 min，进行凝胶电泳检测，根据目的条带有无，判定待测样品大豆内源Lectin基因和转化体特异性序列的检测结果，扩增结果见图2。
（6）结果表明，应用五重PCR方法在非转基因大豆ZH10、其他转基因大豆混样、转基因大豆ZH10-6第三世代样品中扩增得到大豆内源Lectin基因，在转基因大豆ZH10-6第三世代样品中扩增得到4个转化体特异性序列，在玉米、水稻、棉花、油菜等4种作物的转基因混样中均未扩增到5种靶标成分，表明建立的转基因大豆ZH10-6分子特征转化体特异性五重PCR鉴定方法具有良好的特异性。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市农业科学院
<120> 一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagcctcgga tgggattgat 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgctcatgt gttgagcata taa 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcgtgactg ggaaaaccct 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attctaaaac gctttcttct tgcta 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaaacctct taatgatacg gctt 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcgtgactgg gaaaaccct 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acccttgttg aacgagtgg 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agaagagtat tcgggaagct aa 22

Claims (3)

1.一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物，其特征在于包括ZH10A（边界A）：
引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’
反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’
ZH10B（边界B）：
引物正向序列：5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCT-3’
反向引物序列：5’- ATTCTAAAACGCTTTCTTCTTGCTA-3’
ZH10C（边界C）：
引物正向序列：5’- CTAAACCTCTTAATGATACGGCTT-3’
反向引物序列：5’- TCGTGACTGGGAAAACCCT-3’
ZH10D（边界D）
引物正向序列：5’- ACCCTTGTTGAACGAGTGG-3’
反向引物序列：5’- AGAAGAGTATTCGGGAAGCTAA -3’。
2.一种采用权利要求1所述的快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物快速鉴定的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
（1）用于鉴定转基因耐草甘膦大豆ZH10-6新品种的分子特征转化体特异性引物，其特征在于，包括ZH10A（边界A）引物正向序列：5’-GAGCCTCGGATGGGATTGAT-3’，反向引物序列：5’-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3’； ZH10B（边界B）引物正向序列：5’-GTCGTGACTGGGAAAACCCT-3’，反向引物序列：5’- ATTCTAAAACGCTTTCTTCTTGCTA-3’； ZH10C（边界C）引物正向序列：5’- CTAAACCTCTTAATGATACGGCTT-3’，反向引物序列：5’-TCGTGACTGGGAAAACCCT-3’； ZH10D（边界D）引物正向序列：5’- ACCCTTGTTGAACGAGTGG-3’，反向引物序列：5’- AGAAGAGTATTCGGGAAGCTAA -3’；
（2）五重PCR反应体系为20 μL，包括：2×Green Mix(含缓冲液、dNTPs、
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2+)10 μL，8.5 μL引物预混液，1.0 μL DNA样品，0.5 μL灭菌超纯水补足20 μL；
引物预混液8.5 μL，包括：ZH10A-4F/ ZH10A-2终浓度10 μM各1.5 μL，ZH10B-1/ZH10B-2终浓度10 μM各0.75 μL，ZH10C-1/ ZH10C-2终浓度5μM各0.5 μL，ZH10D-3F/ZH10D-2终浓度5 μM各1 μL，Lectin基因终浓度2 μM各0.5 μL；
（3）扩增程序：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸7 min；取7μL PCR扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。
3.权利要求1所述的快速鉴定转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性的引物在用于ZH10-6插入位点快速高效筛查方面的应用。
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CN112359098A (zh) * 2020-12-10 2021-02-12 天津市农业科学院 一种实时荧光定量pcr检测耐除草剂转基因大豆j12含量的方法

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