CN108456743B - 与大豆开花期和成熟期相关的snp标记及其检测引物、方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了与大豆开花期和成熟期相关的SNP标记及其检测引物、方法与应用。本发明通过对我国大豆地方品种的全基因组关联分析发现SNP位点Chr12:5520945与大豆开花期和成熟期显著相关，并进一步针对该位点开发dCAPS标记，提供了一种检测大豆开花期和成熟期的方法及专用引物(SEQ ID NO.2‑3)，经实验证明，本发明提供的引物可以特异检测大豆中Chr12:5520945位点的基因型，也可以作为不同生育期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的积极意义。

Description

与大豆开花期和成熟期相关的SNP标记及其检测引物、方法与 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及与大豆开花期和成熟期相关的SNP标记及其检测引物、方法与应用。

背景技术

大豆营养价值丰富，发展大豆生产对改善人民的食物结构、满足蛋白和油脂的需求以及发展畜牧业和食品业都具有十分重要的意义。大豆为典型的短日作物，需要严格的光周期条件，使其适应范围狭窄，具有很强的区域性，严重限制了大豆品种的引进、培育和大范围种植推广。作为栽培大豆起源国，我国的大豆种质资源在长期的栽培和进化过程中，在生育期长短和结构等性状上富集了广泛的遗传变异以适应不同地区的光温变化。对大豆光周期反应及生育期基因的深入研究，在生产实践上可为大豆品种的栽培区划、合理布局及分子育种等提供理论依据。

前人研究发现，与大豆花期和生育期相关的基因位点主要有10个，分别是E1和E2(Bernard，1971)、E3(Buzzell，1971)、E4(Buzzell和Volden，1980)、E5(Dissanayaka etal.，2016；McBlain&Bernard，1987)、E6(Bonato和Vello，1999)、E7(Cober和Voldeng，2001)、E8(Cober et al.，2010)、E9(Kong et al.，2014)和J(Ray et al.，1995)。其中，E1、E3、E4和E7与大豆光周期敏感性相关(Buzzell et al.1971，Buzzell et al.1980，McBlainet al.1987，Cober et al.1996，Cober et al.1996，Abe et al.2003)。近年来，参与大豆开花调控基因Dt1(Tian et al.，2010)、GmFT2a、GmFT5a(Liu et al.，2017；Nan et al.，2014)、E1(Xia et al.2012)、GmCRY1a(Xia et al.2012)、FT4/FTL8(Samanfar et al.，2016)、GmELF3(Lu et al.，2017；Yue et al.，2016)和E10(Samanfar et al.，2016)等被克隆，人们对大豆光周期反应机制有了全新的认识。在光周期开花调控过程中，植物叶片中光受体感受光信号，然后传递给生物钟振荡子，最终诱导开花基因表达，控制开花。

随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选择(Molecular marker-assistedselection，MAS)成为可以节约人力、物力和加速育种进程的有效方法(Cregan etal.1999)。MAS的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因型而鉴定出目标植株。衍生的酶切扩增多态性序列(derived-Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence，dCAPS)标记是一种利用特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生的一种检测SNP位点的DNA标记。具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特点，已广泛用于作物的分子鉴定、基因定位、图位克隆和辅助育种等。

若能开发一种与大豆开花期和成熟期相关的dCAPS标记，可为大豆在分子鉴定和辅助育种等方面提供有力的技术支持。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供与大豆开花期和成熟期相关的SNP标记及其检测引物、方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明通过对我国大豆地方品种的全基因组进行关联分析，发现一个SNP标记，与大豆开花期和成熟期显著相关，该SNP标记的位点为基因组版本Glycine maxWm82.a2.v1(Soybean，http://www.phytozome.net)的Chr12:5520945，该位点的等位基因为T和C，有CC、CT和TT三种基因型。

所述SNP标记位点及其两端的侧翼序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明针对上述SNP标记位点开发dCAPS标记方法。

本发明首先提供一组大豆开花期和成熟期的检测引物，包含具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物。

本领域技术人员应当理解，上述检测引物为一组引物对。

作为优选，所述检测引物(引物对)由SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子和SEQ IDNO.3所示的单链DNA分子组成。

进一步地，含有本发明所述检测引物(引物对)的试剂与试剂盒均属于本发明的保护范围。

在所述试剂与试剂盒中，所述检测引物(引物对)中不同序列的引物之间的摩尔比为1:1。

在所述试剂与试剂盒中，每种引物(即不同序列的引物)的终浓度为2μM。

在所述试剂与试剂盒中，还含有MseI内切酶，用于对引物扩增得到的产物进行限制性酶切，在检测中，利用酶切结果对待测目标加以分析。

第三方面，本发明提供了所述引物、所述试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定大豆开花和成熟中的应用。

以及所述引物、所述试剂或试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测大豆开花和成熟产品中的应用。

第四方面，本发明提供了一种检测大豆开花期和成熟期的方法，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，利用本发明提供的检测引物(引物对)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将步骤1)所得到的PCR扩增产物，利用MseI内切酶进行酶切，得到酶切产物；

3)检测酶切产物，依据酶切产物的片段数量或片段大小判断待测样品的开花期和/或成熟期。

具体判断方法为：若所述酶切产物中有159bp和27bp大小的片段，则所述待测大豆为候选的早花早熟大豆，基因型为TT；若所述酶切产物中没有159bp和27bp大小的片段，则所述待测大豆为候选的晚花晚熟大豆，基因型为CC。

作为优选，步骤1)中，PCR扩增的反应体系(含有引物对的PCR试剂)为20μL，包括：10ng/μL基因组DNA 5μL、10×PCR缓冲液(全式金生物技术有限公司)2μL，2.5mmol/L dNTPs1.5μL，2μmol/L引物各1.5μL和1U Taq聚合酶0.2μL，无菌水8.3μL。

作为优选，步骤1)中，PCR扩增反应的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸8min；于4℃保存。

作为一种示例性说明，上述PCR反应可在ABI(Applied Biosystems，美国)公司的PCR扩增热循环仪上进行扩增。

作为优选，步骤2)中，将所得到的PCR扩增产物取5μL，加入6×loading buffer后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。之后，利用MseI内切酶进行酶切，得到酶切产物。

所述酶切的反应体系为10μL：PCR产物5μL、MseI内切酶(10U/μL)0.2μL、NEBbuffer 1.5μL、无菌水3.3μL。

所述酶切的条件为：35-40℃酶切30-60min，优选为：37℃酶切50min。

作为一种示例性说明，可将配制好的酶切反应体系放入37℃保温箱或水浴锅中，酶切50min后取出，得到酶切产物。

进一步地，步骤3)中，将MseI内切酶切产物采用3％琼脂糖凝胶电泳检测，依据酶切产物的片段数量或片段大小判断待测样品的开花期和/或成熟期。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对我国大豆地方品种的全基因组关联分析发现SNP位点Chr12:5520945与大豆开花期和成熟期显著相关，针对该位点开发dCAPS标记。

进一步地，本发明提供了一种检测大豆开花期和成熟期的方法及专用引物。经实验证明，本发明提供的引物可以特异检测大豆中Chr12:5520945位点的基因型，也可以作为不同生育期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的积极意义。

附图说明

图1为实施例2中引物对1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的示意图；

M：Trans2K Plus DNA Marker；1～8：表2中的8份材料。

图2为实施例2中引物对1扩增产物的酶切产物琼脂糖凝胶电泳的示意图；

M：Trans2K Plus DNA Marker；1～8：表2中的8份材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1特异性引物的设计

从Phytozome(http://www.phytozome.net)下载Glyma.12g073900基因序列，利用Primer3(version 4.1.0，http://primer3.sourceforge.net)在线软件设计PCR引物：引物对1；引物对1的PCR产物预计长度为186bp，经MseI内切酶酶切后理论上可获得159bp和27bp两个片段。

引物对1：

F:ATTGCCCATAAAGCTGCAGTAGATCCT(SEQ ID NO.2)；

R:GTTGCTTCCATCCTGTCCAT(SEQ ID NO.3)。

引物对1的设计是基于一个与大豆开花期和成熟期相关的终止子丢失(Stoploss)的单核苷酸多态性位点开发成的dCAPS标记。该位点位于Glyma.12g073900基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的第11927位，其基本信息见表1。

表1 Chr12:5520945的单核苷酸多态性位点基本信息

实施例2特异性引物在鉴定或辅助鉴定大豆开花和成熟中的应用

1、提取基因组DNA

本实施例以8份已知基因型的大豆材料(ZYD05055、PI507643、PI578340B、PI578341、PI507600、ZYD02878、PI518671(Williams82)、ZDD23876(中黄13))为待测大豆样品，提取其基因组DNA。

2、PCR扩增

以各待测大豆基因组DNA为模板，利用实施例1的引物对1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

上述PCR扩增的反应体系20μL(含有引物对的PCR试剂)，包括：10ng/μL基因组DNA5μL、10×PCR缓冲液(全式金生物技术有限公司)2μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，2μmol/L引物各1.5μL和1U Taq聚合酶0.2μL，无菌水8.3μL。

上述反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火40s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸8min；于4℃保存。

上述PCR反应在ABI(Applied Biosystems，美国)公司的PCR扩增热循环仪上进行扩增。

上述引物对1对应的PCR扩增产物取5μL，加入6×loading buffer后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出目的片段。8份已知基因型(ZYD05055、PI507643、PI578340B、PI578341、PI507600、ZYD02878、PI518671(Williams 82)、ZDD23876(中黄13))的大豆品种的DNA进行PCR扩增，所有8份材料均获得了186bp的与目标片段长度大小相近的单一PCR产物，如图1所示。

3、酶切

引物对1得到的PCR产物MseI内切酶酶切。

上述酶切反应体系10μL：PCR产物5μL、MseI内切酶(10U/μL)0.2μL、NEB buffer1.5μL、无菌水3.3μL。

将酶切反应体系放入37℃保温箱或水浴锅中，酶切50min后取出，得到酶切产物。

将上述酶切产物采用3％琼脂糖凝胶电泳检测，若酶切产物中有159bp和27bp大小的片段(测序检测大小)，则待测基因型为TT，若酶切产物中没有159bp和27bp大小的片段(测序检测大小)，则上述待测基因型为CC，如图2所示。酶切鉴定基因型结果和已知基因型一致。检测结果如表2。

表2 8份已知基因型大豆品种Chr12:5520945位点基因型

4、Chr12:5520945位点基因型与开花、成熟时间的相关性分析

(1)鉴定大豆品种的开花时间和成熟时间

为了验证标记的可靠性，对189份大豆品种进行开花时间和成熟时间的调查，田间试验于2016年中国农业科学院油料作物研究所武汉基地进行。1.5米行长，株距0.1米，行距0.55米。田间管理采用当地常规管理，保证实验材料正常生长、成熟。田间表型鉴定参考“大豆种质资源描述规范和数据标准”调查出苗期、开花期和成熟期(Qiu et al.，2006)。田间调查按行进行，出苗期(Emergence date)时50％以上的幼苗子叶出土；开花期(Floweringdate)时50％植株开始开花；成熟期(Maturity)时50％以上植株成熟，摇动有响声则认为该单株已达到成熟。

(2)利用实施例1提供的特异性引物检测上述189份大豆的Chr12:5520945基因型，结果如表3所示。

表3 189份大豆Chr12:5520945位点基因型与开花时间和成熟时间

备注：生态型NR，HR，SR分别表示North Region(北方地区)，Huanghuai Region(黄淮地区)和South Region(南方地区)。

表3中涉及的大豆品种均记载在如下文献中：王国勋.中国大豆品种资源目录.北京:中国农业出版社，1982；常汝镇，孙建英.中国大豆品种资源目录:续编一.北京:农业出版社，1991；常汝镇，孙建英，邱丽娟，陈一舞.中国大豆品种资源目录:续编二.北京:中国农业出版社，1996。

利用Chr12:5520945位点的dCAPS标记检测189份材料的基因型，其中189份材料的生态类型分为NR(North Region，北方地区)，HR(Huanghuai Region，黄淮地区)和SR(SouthRegion，南方地区)。

70份NR材料中，TT基因型的为54份材料，开花时间为(22～36)天，平均开花时间为(29.1±4)天，成熟时间为(74～111)天，平均成熟时间为(96.8±9.7)天；CC基因型的为16份材料，开花时间为(38～46)天，平均开花时间为(41±2.4)天，成熟时间为(112～115)天，平均成熟时间为(113.8±0.9)天。T检验(Student's t test)表明，TT基因型材料的开花时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝5.3e-17)；TT基因型材料的成熟时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝1.8e-09)。

28份HR材料中，TT基因型的为17份材料，开花时间为(28～40)天，平均开花时间为(36.2±3.7)天，成熟时间为(87～109)天，平均成熟时间为(104.3±6.2)天；CC基因型的为11份材料，开花时间为(42～57)天，平均开花时间为(46.8±4.6)天，成熟时间为(110～134)天，平均成熟时间为(117.8±6.9)天。T检验(Student's t test)表明，TT基因型材料的开花时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝8.2e-07)；TT基因型材料的成熟时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝2.1e-05)。

91份NR材料中，TT基因型的为74份材料，开花时间为(27～54)天，平均开花时间为(42.5±6)天，成熟时间为(84～127)天，平均成熟时间为(112.6±6.2)天；CC基因型的为17份材料，成熟时间为(56～78)天，平均开花时间为(65.9±6.5)天，成熟时间为(131～165)天，平均成熟时间为(153.4±15.1)天。T检验(Student's t test)表明，TT基因型材料的开花时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝1.6e-24)；TT基因型材料的成熟时间早于CC基因型材料的开花时间，两者差异极显著(P＝1.9e-30)。

因此可以确定，利用本发明所提供的引物对和检测方法对待测大豆进行大豆开花期和成熟期检测是可行且准确的。

具体方法如下：用实施例1所提供的引物对1对待测大豆基因组DNA进行扩增，得到PCR扩增产物；再将PCR扩增产物用MseI内切酶酶切，检测酶切产物大小：若所述酶切产物中有159bp和27bp大小的片段，则所述待测大豆为候选的早花早熟大豆，若所述酶切产物中没有159bp和27bp大小的片段，则所述待测大豆为候选的晚花晚熟大豆。

dCAPS标记可以辅助检测大豆中Chr12:5520945位点的基因型，也可以作为大豆不同生育期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的意义。

基于前述实验结果，本领域技术人员应当知悉，含有上述引物对的试剂盒或PCR试剂均可以进行上述鉴定。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 与大豆开花期和成熟期相关的SNP标记及其检测引物、方法与应用

<141> 2018-04-08

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14408

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

ctgctgatgt ctccatgtaa agtaatcttg tgaagagttt ctcatgtatg catgtctaat 60

cagatttcgt ccgcagtttc tgtaaggatg gtaagtgagt ttagttatta tattcatttt 120

ctcaggatat tggtatgaat ggaaagttat acctagtgct gagacagaag ctttgagggt 180

tctttgatgc aggaacaggt tgtcgttcca tttctttaaa tttgctatga aatttttgtt 240

tttgagattt tcatttctgt cggggggctg gagtttggag gtatggatct atatttttct 300

atcttaactt tttcaaatta ctactatgta attattatca agtctatttt tgttatgttt 360

agtctgttaa caattaccat aagcaattac tgattttatt ccttatgata ttgtgtatat 420

gtaaatttgt ttgggcccct tgggtggagt accctcaggt atagggtatt tggttttttc 480

tgaattatga tggaaaaagc gctgacttga ctgatggata gggttgtgtt tgcagaaatt 540

gatagttcaa gtgcttggga tgtggagaat ccatgattca cttggggagg atatcatgtt 600

cgtgtgttaa ttcctcacaa tgtttttgca gtgtggttga tataggctgg tccgatgaac 660

aataatgttg ggaaagggaa aaaaggtttg gcagaacaaa atcatatgtt ttttgacaaa 720

aagagtctcg aaaatggagt agttaatgga ggggtagcct ctggatcatc aactgaagat 780

gacacaagat ttaataaggt ggttgaagat ggaaacaatg gattgagggg tctgattcaa 840

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tgtgtgtttt gaatacaaac actaatatcc tttttatagg ctaagaataa ctaaccctat 3360

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ttataaggtc taagttaaaa gtatgatttg gtccttttta taaggtccaa tctaaaatgt 3600

ctcctacatt tattattttt cacaaaaata ccctttatta aagtcagttc tagaataatg 3660

tgacagtgag agaaatataa cacattaatg tttttgttag ttttggaaat taatttaaga 3720

caaatgtaat gctgttaact aaatttacca aattccttta tcttggtgat ttagttaatt 3780

ggaccttata ataaggacca aaggaaatac tttttaagct tcccttcaag ttggtaaatg 3840

gatatcaagt tctggaaatc ttaccatagg gagctccttg gtcaatacat ctgccaattg 3900

gagtcttgaa ggaatgtaag ttgtagttat aagaccatta tctaatttct ctttaatgaa 3960

gtgcctgcca atctctatat gcttggtttt gtcatgctgt acagggttgt ggacaatgct 4020

aatagtagaa ttattatccc aaaacaacct cagagggttt tcataattta tcttaaggtc 4080

atcaagaatg atcttcatcc ataatatctc acagatgttc tgtgccatag ctcaaaactc 4140

tacttttgca ctagaccaag caattacatt ttttatactc ctccatgtta ctaggtttct 4200

ctgaagcttg caataccctg agatgtatcc tttatcaaca actgactcag cttagtcttc 4260

atttgtatac atttccttgg gtagcttgca ttctcttcta aataacagtc tgctttatct 4320

gttgtcctac aagtgttgtt cttggggatc atgcatgaat tggcttacca cactcacagc 4380

ataagcagtg tctggtctag tatgggacaa gtagatgaac tttcccactg gtgtctggta 4440

ctgtgacttc tctactgttg gccttaatcc ccacttccaa tcttgtggtt ctgctcaatg 4500

ggaactttga atgttttaca cccttatttg cttgtttctt tgagaagatc aagtaaaaac 4560

tttctttggg tgataaaggt accttgtttg gaataggcaa cctctatcct aagaaaatac 4620

ttaagctttc ccaattcttt catttcaaac taggttccca acttctccct cataaccttc 4680

tttttagtct aatcattact tgcaatgatc atatcatcca catagagtaa gagtgtgaat 4740

ttcccatcat gcgagtgttt tatgaaaaag gtatgatcat tgtaagatgt gtgtaatacc 4800

acacttcagg atgctttatt tttaataaag atatcatata attaaggata caatgaaaga 4860

ataaaaatcc ctaattccta gttatacacc tttccatatt tccctattta catacaagaa 4920

aatcatatct ttacaatacc cctcaagttg aagcatatat gtcatacgaa cccaacttgt 4980

cacgaatgta gtcaacatga gaacccttga gagatttagt gaacatgtct accagttggt 5040

ctttggagct aacaaagtca gtggtgaatt gccaagtgta ccttctccct tgcataatga 5100

cagtttatct caatgtggtt ggttcgttca tgaaagactg aattagatgt gatgtggaga 5160

acaacttgat tttcacatat gagcttcatg ttatgagtat cttaaaattt taactgttgg 5220

agaagttacc taagccttgt aatctcacat gcagttgttg ccatagcgtt attcaacttt 5280

ggcactggat gtagccacta tattctattt cttgtttcgc caggagatca tatttcctcc 5340

aataagaaca tgatatccaa aagtggaacc atatatctga tagtgatcct gcccagtcag 5400

catcaaagta ataaatgatt atggtattgt ctttgtcttc atataataat ccatatcctg 5460

gtgcaatctt gatgtactga aggatgcaca taacaacatc ccaatgactg tcacaagtgg 5520

cattaaggaa ttgactcacc atgctgacaa caaagatgat gtctggtaca atgaggtaat 5580

tacgtctgcc cacaagtcgt caatatcttc ccgagttttt tagcggctca ccctgacctg 5640

gaataagctt ggcagtagga tccattgcaa tgttgttagg gcgacaatca agcatacttg 5700

tctcagttag gatgtccaaa gcatactttc gttaggagac aacaatgcca gatgaggatt 5760

tgtcaacctc aatgcctaag gaatgcttga gcaaacaaaa atgtgaatgc tgattctaag 5820

gcaaataagc tattatttag ggactcccac taattgtaac actccccctc aagctggtgc 5880

agatcttaaa ttgagcaaac aaaaatgtga atgctgatcg ataataatgc ctcattatgg 5940

tgggcagatc ttaaattagc ccttcataat ccccaacatg agatggtgtt aaagggaggg 6000

ctaacatgga aggtggggaa tggaactaaa atcaagtttt gggaggatca ttggggcttt 6060

ggagacacat cgctgctggc aaaatacccc agtttgtacc taatttcaga ccaacagcac 6120

aactatattc aggagatggg tcagcaaaca gacaaagggt gggagtggaa atttaaatgg 6180

agaagacact tgttcgacag agagcttgag atggcagatt gcttcctttc tgaagttgct 6240

ggcagcagta tccagattca caaaaaagat gagtggatct ggaaagcaga gcctactgga 6300

caatattcgg taacaagcgc ctataatatg ctcaatggag tggatgttga ggaggataat 6360

gggtggatgt ttgaggagtt atggaagatt cgagtcccaa ctaaaatcac tatttttgca 6420

tggaggttat taaaggagag actacaaacg aaggcaaatt tgaggaggag aagggtggca 6480

attaatgatc cattatgccc attttgtggt aattctgagg agaacgaagc gcatgtattt 6540

ctgacatgtg acaaaatact cccattatgg tgggaatcta tgaaatgggt caaccttcat 6600

ggagcttttc cgcagaaacc gtggcagcac ttttcccagc atgcattctg ttttcctagc 6660

aaaattcgta ttaaccgatg gagaagttgg tggcttgccc tcacatggac agtgtggcag 6720

caccggaata aaatcatctt ctcaaatgaa acttttgatg gaaacaaatt aatggaggat 6780

gctattttta cattatggac atggctgaag aactttgaga aggactttgc tctcacttac 6840

agctattggt cgtctaacat agcagcagga tttgtatttt caggggggta gaaaccatag 6900

acagtgggtg ttgtaggtct ttgtaatacc tagctttggt tccttgcgag actgctatta 6960

gtctgagctt ggaaccatgt tgctggcaag ctaatctaat tacatgtact gtttggtacc 7020

tctggtactc actatatata taatatattt tatctttgct gatcaaaaaa aaaaaaaaag 7080

ctggtgcaga tatatcatat gcattaagct tgttacatat agtttcaacc cggggtcctt 7140

taagagactt ggtaaaaata tctgccaatt gatcattgga accaacaaaa tcagtcgtga 7200

tttcctcaaa caacaccttt tctcttacta attgataatc tatctttgtg tttagtctgt 7260

tcatggaaga ccatattaga tgcaacttga agagcaactt gattgtcaca aataagctta 7320

gtgtcctgag tgtcagcaaa ctgtatgcag ctgctaccat ggcacggtat tcagctttgg 7380

tgcagaatct agcaactata ttttgcttct tgcttctcca ggagatcgaa ttctctccaa 7440

gcaaaacaca ataaccagag gtagatctcc tgtctgatgg tgatcttaac aaccaatttt 7500

ggcattgcct ttgtcttcat ataggagtcc tcgacctagt gcattcttga tatatctgag 7560

gatgtgcatg acagcatccc aatggctatc acaaggggca cggaatagca tgcccgcagg 7620

cggaaaagaa aaaagaaaaa ggtgtagaat ttctgaattg tgtcttaaca agatcacaca 7680

cgactgtcta tataatatat atttacaata aatacaaata aatatgaatg ctgattctaa 7740

ggctaataag ctattaatta gggattctac cactaattct aacagtgaca aaataataaa 7800

agcctaaagt tacctggctc ttatgatttg gtcgctagag agactagact ttatacgtgt 7860

tgaacagaaa aagtgcccag ttataaagac tgggcacaca agggacaatg acctactgtg 7920

aagattggat acatgagatt ggttacagat gatggctgat gtcagcggaa aagagaatcc 7980

cattagatag gagttaatac ctacttgaaa gaataatgtc tgaatattaa attcataaat 8040

tacagttgta ctaaagtaat ttacataaag aaatgacttg aaatataagg aaaatcactg 8100

aaatattatt tcttgatttt cagtgtatat taagggtcta tttatacggc tctattcata 8160

aaatcaagct caattaaaca atcctaataa ggaataaatc aaattaaatc tacaaaaaaa 8220

ggaaagaaaa tataaacaca ttaagcacat gctgcacacg ttacaacaga ataatttctg 8280

aatactatca ctttgatgat ttgaaaccat acgaggtgtt acattagacc aaacagcatg 8340

attacatacc taaaataaga ctgaaaatct ggtagatatc tataataatt acagtacagc 8400

taatgaggga ctgctacaac attatataaa cttgtattga taattacttg ctagaatata 8460

gctatacagt aagaaaatct gtcctaataa aaggaaatca agcaataaat ctgtcctaac 8520

agaaacaact cattccaaga cagcaaccca tcacagttta tcttgttgat caacttaaat 8580

atccaactat ccagttcatt cttcaatatt caatatcact ccttaactga tataaggatc 8640

aatgaaggaa ttgcaaaaga taattactgc attcctcctt tcaatcaaat ttgaagtttc 8700

ttttacgtag agatctatgc cttaaagatg caataatgga ttaaagtagt ttatattatt 8760

ctatcctatt gatcttatca tttttcaact taaacaataa attgattctt caataatcaa 8820

tgattcaatg tcattcctga acttggatta acacacttcc tcagtctagt ggtagtggga 8880

gtgaaagtgc gaccctcacc agaaaatttg caaagtcaag aagtaatgat gcatatgaaa 8940

acaatagtga cagcagtgat gagaatgact atggaagcag aggcttgagc attcgtgatg 9000

gaagtgacaa tggaagtggc actcaggtat tgcacgtatc tcataaaata tacatgttct 9060

cttaattgaa tcacccttaa gtaatatttc cccatcggag ggcaaggtta ccacattatg 9120

ctgtgtcgat atcatttttt gctcatgaaa attagtttct aaatccatgt gttgtcactg 9180

tttgatgttt ttaaatttcc ttatatgaaa tttcttctat ttaagactca acacatgcag 9240

tagttcagct ctgaagaaca caaattcatc attttttatc gatggatcaa ttattttcta 9300

atggctcggt aataacattg aatcttcaat actgactagc ttcacttgag caatttgata 9360

tggtaatttt aagtggacag aaaataggga ttttaaattt ctagacaagt cacatgggtc 9420

ttgaaagcag ggctaggtac tgggacagac caataaacat tagcaggaaa aaaaagactt 9480

tgaggactgt ggtagctgac aataagaaat ggatttttag agtctgagtt gtcatttagg 9540

gttattagtg atgaataaag aagagaagaa taatggacgt cgttcattga tcaggttaac 9600

ctacataggt ttcacttagc aaaaggttgc atgtgccaat tacttgccat aacaattaaa 9660

caagccaaca agtgtcactg aactatcttg tcatccatag tttaatcatc atttgattgt 9720

cctatatcca atcacttatg ttctttttgt tagtggaact gaggatagta tgatgcatgc 9780

tattatttgt tttgtaattc atactacaca attttaaatc atatattgta gaaattcgca 9840

tattaatgta gggagaacca caatttagga attcttggca gttattttca gtttaggaac 9900

aatttactgc tgaatggtta acattgtttg gagggtggtt aatgggttaa ttcccccatt 9960

aaaaaaaaat ctttacaggg ttctcactta aattgggagt ttcacttgaa aaaacttgag 10020

aaataaagaa tcttgtgaat tataatgtct tttgtttttt tatcaactgt accctattca 10080

gatggagatg ggagaagttc tttgtttttg ttctgtgtgt tttctaggaa ttatatatta 10140

aagcttctgt gtcacccttt aatcatctag acttcttgct tgacaaatta atatgaaaat 10200

tcaatattcc ttgtaaaatc aaatcttttt ttttggatgt tggtttttat tatgattaat 10260

aggcatgatt tattgctgat ttgtaagccc tgccccactt tttctccccc acctgtgtta 10320

tatgtaggtc aggttcaaaa atggtcggac actgtttttg cactgtaact tcgcaaatta 10380

tctactttcc tacaaaacaa ccattttggg actcttgagc atttgatatg tcctactttc 10440

tttgaagcaa attttgatgg gtttgtgata ttggttttgg ttaaaacgag gcccaaattt 10500

tatggcagtg tgcagtttat gaaaatcttt ggtgtccttg gttggagtgg agcacatgca 10560

tcacttagga tatttgattg ccattacatt ttctgtgtaa tatgaaaatg tttattgctt 10620

cctttatttg ttatgcccta actattgctg gggacaaaga atggatagct tgctgggttt 10680

cttttttcat gttctttttt gttttttgtg ttttctggtc tggttgattt cttgctgctt 10740

catttctgtg ctttctctca tcactcagaa aattactttt ctattaaaaa atagttaacc 10800

atatgttact taattgttca cttttctgtg tgattgttcc tacacaaatg aacaataaat 10860

atttttgcaa gcaattcgaa aattgtattt accccttatt tatttatcta aataccccaa 10920

agtcctagta aagctcctat tttatgtaga gttcatggac taaatgtcta gctcaagttg 10980

gcagtcctca tccagtttca cctcataaac agttggttga tgcccctgat agcacatgtg 11040

cccaagtgat gcaaacaaag actgaaaaag ttagtagtag atgggtgcat gcgacggaaa 11100

aagagtgcca tgaacttatt gatcttggta tgcctcgata gtatgtattt ttttacttgt 11160

ctatcttgat ttggatattt ccccaaataa accacttagt tactttcttt ccagatgatg 11220

ttgcaagggt taaggacttg gctatgggaa tatctttgaa tatgcaacta gagcatccac 11280

tcgaggaact gtctagcaat ccaattgtgg gtaaaggggc aaataagatg tctgatgtag 11340

atgatatgca gatcattaag agaaagagca atgtctgtga aaaaggacaa ttggaataca 11400

atggtgataa aaccgggaca caggaaaatc aggctatgaa tgttattgat gttactgata 11460

gcaacagtcc acaggctgaa agcagagact tgaacactcc aaatgggttt tctggttttt 11520

cacaatcaaa agcaaactgt tgccccaaag agcatccatc ccttgaacta actctgaaaa 11580

ggctgggaga agtaggagat gctaaaaatg tcactggtga agaatgcaat gtcttgagac 11640

attcagatca gtcagcattc tcaaagtaag aggaaatttg ccagcacaaa taccttattt 11700

tggaagcaaa tattgttgca ctacattgat aacgtttaat ttttttcttt attctgcaga 11760

tataatactg tttctgctaa ccaggtgatg ctcttcagtc ctttgacggc aagaacttta 11820

tttattgtgt aaaaattaag atttttgtgt tgcataattt gcaattttgc atttacattt 11880

ttcatcccaa attccactta tctcattgtc tattccccac cgttaatcat ctctcaatga 11940

atataagatt tcttccaagc caacaagggg taatgggatt aattgaatca tcaaaaaatt 12000

tctaatacac aatatgaaga aatgatatca atatgctgtg tgttatagtt atttctccgc 12060

aatttgcaag gaaattctgg gtaccattag ctggagaata gtgtttatca ccaaatctta 12120

atctttgggc aatccttatg ttttctttac tttttatcag gctcaaactg gaaatgtagg 12180

aagctgttcc ccactagaca atagctcagc tgcaccaaat acagagacaa tgcacaactt 12240

tccatctcat tcaaatggca ctccttcaaa tcaaaaatct aatgggagca acaacatcaa 12300

tgacagggcc tccactaata catatcttgg caccaaacct gatacttttg acaagaagcc 12360

ggagtctgga agagggattg gctcgtataa ttcttgtgaa ctcctaactg tgcagaacaa 12420

tagcatttct tcatctcaga agaaaacttc tgcctgggaa gaatatacag aaatcattaa 12480

agaatcagta ggaggctctg aacaaggatt ccaagtcgag cacacttact atcagcttca 12540

ccattataat cacattgccc ataaagctgc agtagatccc taatcagatc atgatctctt 12600

actgaaaagc tcaactccgc aatgtgtatc atcaaatgca tttggagggc cagcagaaag 12660

taatgctgca aactatggtg tggatggaaa tgcagtggag agtgatcatg ggagcaataa 12720

tggacaggat ggaagcaaca acttgacaat cagaacgata aatgtggaaa acggaaatgt 12780

ggctgctggg agcattggaa ttggtggcat tgataggaaa agcattggga acgggacaga 12840

tgaagtacgg cttgcattga gagaggctgc cttgaccaaa tttcgcctaa agagaaaaga 12900

aagatgcttt gagaagaggg taatctattt ttaattacat tgtcctaata tgttctctgt 12960

agatctttgt tgcatgtgga ttttgtcaat ttgagtatgt catactcatt gtttgtgttc 13020

ccataatttc tataaatgaa ctgatggctt attgagattc caacaagttg gatgatgctg 13080

ttaatataat ctacttattt gaaagcatcc tatgcaaaaa atatgttgcc gttggcatta 13140

tctatatgca tagttatcta ctctccatcc tgggtatttt atatttctgt aattttatca 13200

aattatatcc actttattta aagttaagat attttcttcc aatgttactt tctttgtatg 13260

actggtatgt tcatgtttga gtcagtgatt tgatcctcat cattaataag cacggtatgt 13320

tatatattgc caacttgaat ttggcttgtt tccatattct ggaattttca tttatttttc 13380

aggttcgata tcacagcagg aaaaaactag cagaacagcg accacgtatt aagggacaat 13440

ttgtcagacg aatagtgtat ggtgctgcat ggctgggttc attttatatt tttatgttgc 13500

gttatgcaag tgctgggtta acttctgtcc aattttttct caggtctgaa ggcaaagaag 13560

aaaaagataa acaaagtgac aacctggtgc ctggggacaa ttctatcgac attcctcaat 13620

aacaccagcc aaaatggtga tcattatttg actgattccg ttccattaac tgcctctagc 13680

ttcttgctat cggactagct tcttcacacg ttcacctagg aagtagcttg gaggtttgtg 13740

ttagaggaat ctgtgattag gtagttgaaa tttatctcta ttgtgtgaaa atcagacatt 13800

taatttgaaa tttctagaca atgttctaga ttctgtttat gtttgtctga actttaaaac 13860

tccaaatgga cccatagaag tggttacctt tggataggtt aacctctgat gaaataaaat 13920

ttatcatgtt agctttcatt ttggttacac ctggttaaca gctaatgctg ttcctttctg 13980

agaattataa catgcttgct gagatctaga tccaatactg gaatagatgt cttgaattga 14040

ttgtcgtggg taaaaagaaa gggagaatgg agcttccctg cctcgtatgt ttcataagtc 14100

ataactatga agcagggaca gttcaaggaa tgaaccatgt ctgttgtgtt gtgcgagtat 14160

ggaatatgtc agctgtcaac catgttcatg tctttgttcg acacgcaagg attgtgtcaa 14220

aaccaagtcc atgtcatgtc attatttttt catcaattcc ttcacccccc aaaagtaaaa 14280

tcttattcat ctatttaaaa tgattgtctt gaaatgggac agtcaccact tctccttaac 14340

ttgtgctgtg acgcgaactg tttaaaatag ttggatttcc tcaagtagcg tcaatcataa 14400

atcaatta 14408

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 2

attgcccata aagctgcagt agatcct 27

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 3

gttgcttcca tcctgtccat 20

Claims (8)

1.如SEQ ID NO.1所示的SNP标记在鉴定或辅助鉴定大豆开花和成熟中的应用。

2.如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物在鉴定或辅助鉴定大豆开花和成熟中的应用。

3.含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中，含有MseI内切酶。

4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中，具有不同序列的引物之间的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求3或4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中，具有不同序列的引物的终浓度为2μM。

6.权利要求3-5任一项所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定大豆开花和成熟中的应用。

7.如SEQ ID NO.1所示的SNP标记或如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物或权利要求3-5任一项所述的试剂或试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测大豆开花和成熟产品中的应用。

8.一种检测大豆开花期和成熟期的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将步骤1)所得到的PCR扩增产物，利用MseI内切酶进行酶切，得到酶切产物；

3)检测酶切产物，依据酶切产物的片段数量或片段大小判断待测样品的开花期和/或成熟期。

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