CN107988418B - 用于转基因番木瓜yk16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于转基因番木瓜yk16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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    • C12Q1/6895Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Abstract

本发明提供一种用于检测转基因番木瓜YK16‑0‑1转化体纯杂合的引物组,属于生物技术领域。所述引物组包括以下三条引物:1601‑GF:5’‑AGAGAACATCTGGTGGTATC‑3’,1601‑TR:5’‑CTCATTAAACTCCAGAAACC‑3’,1601‑GR:5’‑AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG‑3’。本发明还提供基于上述引物组的试剂盒、检测方法。本发明所提供的引物组可检测待测番木瓜个体材料中是否含有YK16‑0‑1转化体,并鉴别出该品种中特定个体的纯杂合状态,适合于纯合度检测和育种选种。

Description

用于转基因番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试 剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种用于转基因番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
转基因番木瓜是目前我国种植的两种主要转基因作物之一,2016年我国转基因番木瓜种植面积为8550公顷,比2015年的7000公顷增加了22%。
转基因番木瓜YK16-0-1是1996年叶东锡等人将番木瓜环斑病毒(PRSV)的外壳蛋白基因通过农杆菌介导的方法导入到番木瓜基因组中所获得的,能够产生对番木瓜环斑病毒的良好抗性。2012年对深圳市市售的转基因番木瓜检测表明,57份番木瓜样品中,转基因阳性率为91.2%,其中,YK16-0-1品系占96.1%。说明在我国转基因番木瓜中YK16-0-1转化体已有较大范围的种植和销售。
转基因性状与其他生物性状一样,可以根据其自交或杂交产生后代中的分离情况来判定其是纯合或杂合。在育种过程中,获得纯合体是一个非常关键的步骤,也是保证种子质量的重要的因素。传统的区分转基因植株纯杂合方法是通过检测自交产生的子一代是否发生分离以及计算分离比进行的,不仅耗时费力,而且浪费了子一代的宝贵资源。而快速高效地筛选纯合植株,可显著加快转基因植株的育种进程,因此鉴别转基因植株纯杂合方法具有重要的应用价值。
本领域亟需开发一套可快速、高效、便捷地鉴定筛选转基因番木瓜YK16-0-1纯杂合的方法。
发明内容
鉴于本领域存在的上述问题和需求,本发明分析了YK16-0-1转化体插入位点的番木瓜基因组序列,设计和验证了特异性的引物组合,建立了快速鉴定YK16-0-1转化体纯杂合的方法,可检测待测番木瓜材料是YK16-0-1转化体,并鉴别出特定个体的纯杂合状态。
本发明提供的技术方案如下:
用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组,其特征在于,包括以下三条引物:
1601-GF:5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’,
1601-TR:5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’,
1601-GR:5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’。
用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物组。
所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂,和/或,用于进行电泳检测的常规试剂。
所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括:dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水,或包含上述物质的商品化PCR反应混合液;所述用于进行电泳检测的常规试剂包括:电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶;
所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNA Marker;所述核酸染料指溴化乙锭;所述商品化PCR反应混合液指Go GreenMaster Mix。
用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法,其特征在于,包括:采用所述的引物组,和/或,所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。
所述PCR扩增的反应体系为:Go GreenMaster Mix 0.5μL/μL,引物0.5μmol/L,所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL,其余为超纯水;所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性4min,以95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s为1个循环,共进行35个循环,72℃保温10min。
所述方法还包括:将所述PCR扩增结果进行电泳检测,判读电泳检测结果。
所述电泳指:将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8%的琼脂糖凝胶上,于120V电压下电泳20分钟;所述判读电泳检测结果指:如果电泳结果仅出现300bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有纯合的YK16-0-1转化体;如果电泳结果同时出现300bp和202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有杂合的YK16-0-1转化体;如果电泳结果仅出现202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品不含有YK16-0-1转化体。
所述引物组在制备番木瓜YK16-0-1转化体检测试剂方面的用途,其特征在于,在标有番木瓜YK16-0-1转化体检测用途的商品包装盒内放入如SEQ NO.ID 1-3所示的3条引物。
采用上述3条引物扩增待测番木瓜材料的基因组DNA并进行电泳检测扩增引物通过电泳条带显示可直观、快速地鉴别出待测番木瓜材料中是否含有YK16-0-1转化体,以及所含有的YK16-0-1转化体的纯杂合类型;现有技术中通常的YK16-0-1转化体定性检测方法只能检测出是否含有YK16-0-1转化体,但并不能进一步获知YK16-0-1转化体的纯杂合类型;而本发明申请日前获知YK16-0-1转化体纯杂合类型的常规手段是通过番木瓜材料自交或杂交产生后代中的分离情况来判定其是纯合或杂合,这种方法明显过程繁琐冗长、费时费力。采用本发明的引物组,可以在番木瓜植株生长的任一阶段取样提取DNA,利用PCR和电泳即可快速便捷得获知YK16-0-1转化体是否存在以及纯杂合类型,省时省力,具有显著的进步。不仅如此,本发明还验证了所述引物组及相关的PCR检测YK16-0-1转化体的准确率,发现采取上述引物组进行PCR定性检测的结果与常规自交、杂交方法获知的YK16-0-1转化体纯杂合类型完全一致,由此可知,本发明的引物组不仅开创性地通过分子生物学方法可快速检测YK16-0-1转化体的纯杂合类型,而且还能保证非常高的准确率。
本领域技术人员熟知,上述引物可通过人工序列合成制备得到,存在状态可以是粉状、或溶液状的。
本发明的第二个方面提供一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒,其特征在于,包括所述的引物组。采用基于上述引物组的试剂盒,也能解决定性检测番木瓜材料中YK16-0-1转化体及其纯杂合类型的问题,获得同样的效果。
在进一步的方案中,所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂,和/或,用于进行电泳检测的常规试剂。
具体地,所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括:dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水,或包含上述物质的商品化PCR反应混合液;所述用于进行电泳检测的常规试剂包括:电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶;
更进一步地,所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNA Marker;所述核酸染料指溴化乙锭;所述商品化PCR反应混合液指Go GreenMaster Mix。
基于所述引物组和试剂盒,采用包含上述步骤的方法,即可快速省力地从番木瓜材料中获知是否存在YK16-0-1转化体以及YK16-0-1转化体的具体纯杂合类型。
本发明的第三个方面提供了一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法,其包括:采用所述的引物组,和/或,所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。
具体地,所述PCR扩增的反应体系为:Go GreenMaster Mix 0.5μL/μL,引物0.5μmol/L,所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL,其余为超纯水;
所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性4min,以95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s为1个循环,共进行35个循环,72℃保温10min。
进一步地,所述方法还包括:将所述PCR扩增结果进行电泳检测,判读电泳检测结果。
更具体地,所述电泳指:将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8%的琼脂糖凝胶上,于120V电压下电泳20分钟;
所述判读电泳检测结果指:如果电泳结果仅出现300bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有纯合的YK16-0-1转化体;
如果电泳结果同时出现300bp和202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有杂合的YK16-0-1转化体;
如果电泳结果仅出现202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品不含有YK16-0-1转化体。
本发明的第四个方面提供了所述的引物组在制备番木瓜YK16-0-1转化体检测试剂方面的用途,其特征在于,在标有番木瓜YK16-0-1转化体检测用途的商品包装盒内放入如SEQ NO.ID 1-3所示的3条引物。
本发明通过对转基因番木瓜YK16-0-1转化体转基因结构序列的测定和分析,开发出了快速高效的YK16-0-1转化体纯杂合检测方法。本发明通过大量实验证实,本发明的引物组/试剂盒/方法检测获知的番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合类型,以及随机抽取的自交种子的纯杂合分布比例,与自交分离比例1∶2∶1高度吻合;此外,同时分布采用本发明的引物组/试剂盒/方法与现有常规方法对同一批自交种子进行了纯杂合鉴定的结果比较,发现二者结果高度一致,说明本发明的引物组/试剂盒/方法在鉴定YK16-0-1转化体纯杂合方面的准确率高达100%,并且不受植株生长阶段的限制,可在植株任一生长阶段取样获知YK16-0-1转化体的纯杂合类型。因此,本发明为特异性鉴定番木瓜YK16-0-1转化体提供了便利,本发明的优点在于快速、准确、高效、方便,所需实验条件不高,具有非常高的实用价值。
附图说明
图1.YK16-0-1转化体PCR检测的引物位置示意图。
图2.YK16-0-1转化体检测方法验证图谱;其中,1:YK16-0-1转化体纯合单株;2:YK16-0-1转化体杂合单株;3-5:不含YK16-0-1转化体单株;6:空白对照;M:分子量标记DL2000。
图3.单株鉴定图谱;其中,1-24:24个番木瓜单株;M:分子量标记DL2000。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等的分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的条件,或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
试剂
分子生物学试剂,如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker等购自大连宝生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京三博生物技术有限责任公司合成。
实验仪器
PCR扩增仪:型号S1000(Bio-Rad公司)
核酸电泳仪:DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
凝胶成像系统:BiospectrumAC(UVP公司)
其它仪器包括:离心机,恒温加热板,电子天平,培养箱等。
生物材料的来源
本发明实施例所使用的番木瓜叶片样品、种子于2013年采集自海南省海口市和文昌市番木瓜种植园。
第1组实施例、本发明的引物组
本组实施例提供一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组。本组所有的实施例都具备如下共同特点:所述引物组包括如下三条引物:
1601-GF:5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’,
1601-TR:5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’,
1601-GR:5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’。
基于上述3条具体的引物,以及上述引物组是“用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定”这一技术目的,本领域公知“引物”的基本作用是用来进行PCR扩增,因此本领域技术人员可以合理采用本领域常规的PCR检测来完成本发明解决的技术问题,获得预期的技术效果。
上述3条引物可以通过人工合成制备得到。
第2组实施例、本发明的试剂盒
本组实施例提供一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特点:所述试剂盒包括第1组实施例任一所述的引物组。
在进一步的实施例中,所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增的常规试剂,和/或,用于进行电泳检测的常规试剂。本领域技术人员可根据本文的记载,出于“鉴定YK16-0-1转化体纯杂合类型”的目的,合理选择本领域常规的用于PCR扩增的试剂,和/或,电泳试剂。例如:
在具体的实施例中,所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括:dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水,或包含上述物质的商品化PCR反应混合液;所述用于进行电泳检测的常规试剂包括:电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶。上述各试剂具有本领域技术人员常规理解的技术含义,均可商购获得。本领域技术人员为了更好地获得PCR扩增结果或电泳检测结果,可以对上述各类试剂进行常规调整和替换。
在更具体的实施例中,所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNA Marker;本文中的DNA Marker采用的DL2000Marker,当然也可以替换成本领域其它常见的DNAmarker。所述核酸染料指溴化乙锭,也可以替换成本领域其它常用的核酸染料,例如GelGreen和Gel Red;所述商品化PCR反应混合液指Go GreenMaster Mix。本领域技术人员还可以选用其它常见的PCR Mix产品。
第3组实施例、本发明的方法
本组实施例提供一种用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法。在本组所有的实施例中,所述方法都具备如下共同特征:所述方法包括:采用第1组实施例任一所述的引物组,和/或,第2组实施例任一所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。本领域技术人员可以根据本发明所提供的引物序列进行虚拟比对,从而基于序列的虚拟结果预测出可能的电泳条带结果,从而判读出显示不同大小条带的电泳结果所代表的检测含义。
在具体的实施例中,所述PCR扩增的反应体系为:Go GreenMaster Mix 0.5μL/μL,引物0.5μmol/L,所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL,其余为超纯水;关于反应体系,本领域技术人员可以出于获得更好的PCR结果的目的,对其进行常规调整,例如,在下述实验例2中采用了一组最优选的反应体系:Go GreenMaster Mix 10μL,引物1601-GF、1601-TR和1601-GR(10μmol/L)各1μL,DNA模板2μL,补超纯水至总体积20μL。所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性4min,以95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s为1个循环,共进行35个循环,72℃保温10min。
在进一步的实施例中,所述方法还包括:将所述PCR扩增结果进行电泳检测,判读电泳检测结果。
在一些实施例中,所述电泳指:将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8%的琼脂糖凝胶上,于120V电压下电泳20分钟;
所述判读电泳检测结果指:如果电泳结果仅出现300bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有纯合的YK16-0-1转化体;如果电泳结果同时出现300bp和202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有杂合的YK16-0-1转化体;如果电泳结果仅出现202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品不含有YK16-0-1转化体。
本组实施例所提供的方法在每一个步骤或环节的操作上均可参考实验例2所述的具体操作。
第4组实施例、本发明的引物的应用
本组实施例提供第1组实施例任一所述的引物组在制备番木瓜YK16-0-1转化体检测试剂方面的用途。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述用途包括:在标有番木瓜YK16-0-1转化体检测用途的商品包装盒内放入如SEQ NO.ID 1-3所示的3条引物。
任何规模出于商业目的地销售、使用本发明的引物组用来检测YK16-0-1转化体的行为均落入本发明的保护范围。
实验例1.引物设计
本发明的关键点在于YK16-0-1转化体番木瓜基因组和转基因插入片段上的引物设计和优化。
通过序列比对发现,YK16-0-1转化体插入位点位于番木瓜基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=papaya)supercontig_16的399442位。本发明在YK16-0-1转化体插入位点两侧基因组上设计引物,以及插入序列上设计引物,三条引物如下:
1601-GF:5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’,
1601-TR:5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’,
1601-GR:5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’,如图1所示。
其中1601-GF/1601-TR扩增区域为YK16-0-1转化体的5`端转基因序列与番木瓜基因组的连接区,1601-GF/1601-TR对YK16-0-1转化体的扩增序列,300bp,如Seq ID No.4所示;1601-GF/1601-GR扩增片段为番木瓜基因组序列,位于番木瓜基因组的supercontig_16的399317-399518位,扩增序列为202bp。而在含有YK16-0-1转化体的基因组中,插入位点的引物之间的片段为包括完整插入片段的区域,预期超过6kb,这么长的片段在普通PCR条件下则不能获得扩增;因此即仅能在不含YK16-0-1转化体的样品中,获得番木瓜基因组序列的202bp的扩增产物,如Seq ID No.5.所示;
三条引物联合使用,在杂合体可以扩增出两条条带。
可用于常规PCR方法快速准确鉴定田间番木瓜单株或单粒番木瓜种子中的YK16-0-1转化体的纯杂合状态。
实验例2.番木瓜YK16-0-1转化体的定性PCR检测方法
实验方法和过程
1.样品前处理
番木瓜单株叶片,采用液氮磨碎。
2.番木瓜基因组DNA提取
依照植物DNA提取试剂盒(TIANGEN生物技术有限公司)的操作手册,进行番木瓜材料总DNA的提取。取5μl提取的DNA溶液,以0.8%的琼脂糖凝胶电泳,根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。
3.单株番木瓜叶片的检测
采用建立的由3条引物1601-GF(基因组正向引物)、1601-GR(基因组反向引物)和1601-TR(插入片段反向引物)组成的YK16-0-1转化体定性PCR检测方法,选择纯合、杂合和不含YK16-0-1转化体的番木瓜材料单株进行验证。
PCR反应体系:Go GreenMaster Mix 10μL,引物1601-GF、1601-GR和1601-TR(10μmol/L)各1μL,DNA模板2μL,补超纯水至总体积20μL。反应程序:95℃预变性4min,95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,扩增反应进行35个循环,72℃保温10min。
在YK16-0-1转化体杂合样品中,三条引物分别扩增插入位点之间的番木瓜基因组序列和插入序列的5’连接区序列,从而获得300和202bp的两种扩增产物;
在YK16-0-1转化体纯合样品中,仅能获得插入序列5’连接区序列的300bp的扩增产物即1601-GF(基因组正向引物)和1601-TR(插入片段反向引物)扩增所得;而基因组正反向引物之间由于包括的插入片段(YK16-0-1转化体)完整区域预期超过6kb,在普通PCR条件下不可能获得扩增;
而不含YK16-0-1转化体的样品中,仅能获得番木瓜基因组序列的202bp的扩增产物,即1601-GF(基因组正向引物)和1601-GR(基因组反向引物)扩增所得。
验证结果表明,如图3所示,纯合YK16-0-1转化体植株(泳道1)仅扩增得到一条300bp的片段,杂合植株(泳道2)得到300bp和202bp两条条带,不含YK16-0-1转化体的植株(泳道3-5)只得到一条202bp的条带,这与预期结果完全一致。
因此,本发明建立的YK16-0-1转化体定性PCR方法及引物组能有效地鉴别YK16-0-1转化体及其存在状态。
4.番木瓜叶片样品中YK16-0-1转化体的定性PCR检测
随机抽取2013年从海南省采集的单株番木瓜叶片样品24份,采用建立的YK16-0-1转化体特异性定性PCR方法进行鉴定(图3)。结果表明24份样品中YK16-0-1转化体纯合、杂合和不含有的分别为4、12和8份。
说明,本发明的方法及试剂盒能够准确鉴定单个番木瓜材料是否含有YK16-0-1转化体,且鉴定YK16-0-1转化体的纯杂合状态,而且还可以用来鉴定一个群体中纯合或杂合个体所占的比例。
实验例3.本发明的引物组/试剂盒/方法的鉴定准确率验证
本实验例验证了本发明引物组/试剂盒在YK16-0-1转化体纯杂合鉴定方面的准确率,通过如下方式进行:将本发明的引物组PCR鉴定YK16-0-1转化体纯杂合类型结果与现有常规手段:通过番木瓜材料自交或杂交产生后代中的分离情况判定YK16-0-1转化体纯杂合类型结果进行了比较。
具体操作为:常规的番木瓜植株YK16-0-1转化体纯杂合检测方法是,待番木瓜植株开花结果后,同时采集其所结果实中的种子。通过果实中种子的YK16-0-1转化体性状的分离情况来判断原植株中YK16-0-1转化体的纯杂合情况。种子中全部为YK16-0-1转化体的其植株为纯合的YK16-0-1转化体;种子中既有含YK16-0-1转化体的种子,也有不含YK16-0-1转化体的种子,则其植株为杂合的YK16-0-1转化体;如果种子全部不含有YK16-0-1转化体,则其植株为YK16-0-1转化体阴性。
而采用本发明的引物/试剂盒/方法,只需在番木瓜幼苗时,获取幼苗叶子提取DNA,即可鉴定每粒种子的YK16-0-1转化体纯杂合类型。本实验例中的鉴定结果:电泳检测照片与实验例2的图3类似,本文不再一一罗列。
经比较,本发明的方法与现有常规方法在YK16-0-1转化体纯杂合鉴定结果上完全一致,说明本发明的YK16-0-1转化体纯杂合鉴定引物组/试剂盒/方法的准确率为100%。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
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<400> 3
agacatatat catcaagacc atagtag 27
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YK16-0-1转化体引物阳性扩增序列
<400> 4
agagaacatc tggtggtatc accccagtct tagtttgata gtttattatt ctgattttgt 60
ttgttaaaat ttctcatttt ctttggatat ctgcctattt tgaaatttgg atactatctc 120
attcaacact gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atctgatcat gagcggagaa 180
ttaagggagt cacgttatga cccccgccga tgacgcggga caagccgttt tacgtttgga 240
actgacagaa ccgcaacgtt gaaggagcca ctcagccgcg ggtttctgga gtttaatgag 300
<210> 5
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YK16-0-1转化体引物阴性扩增序列
<400> 5
agagaacatc tggtggtatc accccagtct tagtttgata gtttattatt ctgattttgt 60
ttgttaaaat ttctcatttt ctttggatat ctgcctattt tgaaatttgg atactatctc 120
attcaatgta tatacatatg ctctctaaat taatttattt taatattttg tttttctact 180
atggtcttga tgatatatgt ct 202

Claims (10)

1.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的引物组,其特征在于,由以下三条引物组成:
1601-GF:5’-AGAGAACATCTGGTGGTATC-3’,
1601-TR:5’-CTCATTAAACTCCAGAAACC-3’,
1601-GR:5’-AGACATATATCATCAAGACCATAGTAG-3’。
2.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,还包括用于进行PCR扩增的常规试剂,和/或,用于进行电泳检测的常规试剂。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒,其特征在于,所述用于进行PCR扩增的常规试剂包括:dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液、超纯水,或包含上述物质的商品化PCR反应混合液;
所述用于进行电泳检测的常规试剂包括:电泳缓冲液、核酸染料、琼脂糖凝胶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述用于进行电泳检测的常规试剂还包括DNA Marker;所述核酸染料指溴化乙锭;所述商品化PCR反应混合液指GreenMaster Mix。
6.用于番木瓜YK16-0-1转化体纯杂合鉴定的方法,其特征在于,包括:采用权利要求1所述的引物组,和/或,权利要求2-5任一所述的试剂盒对待测番木瓜材料的DNA进行PCR扩增。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增的反应体系为:GreenMaster Mix 0.5μL/μL,引物0.5μmol/L,所述待测番木瓜材料的DNA模板0.1μL/μL,其余为超纯水;
所述PCR扩增的反应程序:95℃预变性4min,以95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s为1个循环,共进行35个循环,72℃保温10min。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于,还包括:将所述PCR扩增结果进行电泳检测,判读电泳检测结果。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述电泳指:将PCR扩增产物置于质量体积比为0.8%的琼脂糖凝胶上,于120V电压下电泳20分钟;
所述判读电泳检测结果指:如果电泳结果仅出现300bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有纯合的YK16-0-1转化体;
如果电泳结果同时出现300bp和202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品含有杂合的YK16-0-1转化体;
如果电泳结果仅出现202bp的条带,则待测的番木瓜材料样品不含有YK16-0-1转化体。
10.权利要求1所述的引物组在制备番木瓜YK16-0-1转化体检测试剂方面的用途,其特征在于,在标有番木瓜YK16-0-1转化体检测用途的商品包装盒内放入如SEQ NO.ID 1-3所示的3条引物。
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